Sitofast ve Upstream Kümeleme Yöntemleri FlowSOM ve Cytosplore kullanılarak Yüksek Boyutlu Sitometri Verilerinin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Kitle sitometrisi tarafından üretilen veriler karmaşıktır ve verimli ve basit bir şekilde görselleştirilmesi gerekir. Sitofast, immün hücre popülasyonu içindeki immünolojik örüntüleri vurgulayan ve klinik tedavilere veya deneysel gruplara bağlı hücre alt kümelerini belirleyen bir yöntemdir. Sitofast FlowSOM veya Cytosplore gibi herhangi bir kristalize yöntemden sonra uygulanabilir.

Bu klinik tedavi veya deneysel bir grup ile bağlantılı bir hücre alt kümesi keşfetmek için izin verecektir. Bu yöntemle, verilerin immünolojik genel görünümünü bir bakışta nicel bir şekilde görebileceksiniz. Cytosplore veya FlowSOM ile kümeler oluşturarak başlayın.

Cytosplore kullanıyorsanız, Dosyalar'ı tıklatarak FCS dosyalarını yükleyin ve FCS dosyalarını açın. Ardından, istendiğinde Hiperbolik ArcSinh dönüşümü için bir kofaktör seçin ve kanal olarak benzersiz örnek etiketi ekle'ye tıklayın. Üç HSNE düzeyini çalıştırmak ve haritanın oluşturulmasını beklemek için HSNE çalıştır'ı seçin.

İlk HSNE düzeyinde, CD161 pozitif hücreleri seçerek ve seçime sağ tıklayarak CD161 için pozitif olan hücreleri kontrol edin. İkinci düzeyde, yalnızca CD161 olumlu olaylar ile üçüncü seviyeye ulaşmak için prosedürü tekrarlayın. Son TSNE haritası oluşturulduktan sonra, haritaya sağ tıklayarak ve kaydetme kümelerini seçerek Cytosplore tarafından tanımlanan kümeleri kaydedin.

Cytosplore tarafından istendiği gibi çıktı dosyalarının dizinini seçin ve bu konumu not alın, çünkü daha sonra FSC dosyalarını R.'a yüklemek için kullanılacaktır, çünkü daha sonra basit bir karakter yalnızca çıkış dosyalarını yeniden adlandırırken kimlik ve daha fazla işleme yi ve kaydetmeyi seçin. Belirlenen fonksiyon readcytosploreFCS ile dosyaları R'ye yükleyin. Verileri temizlemek için, gereksiz parametrelerle ilgili sütunun konumunu kontrol ederek ve matristen kaldırarak zaman ve arka plan gibi bazı parametreleri kaldırın.

Ardından, soy işaretçilerinin önce işlevsel işaretçiler tarafından görüntülenmesi için işaretçileri yeniden sırala. Klinik bilgileri içeren elektronik tablo metadosyasını yükleyerek meta veri dosyasını Cytosplore'dan oluşturulan verilere bağlayın. FlowSOM ile kümeleme gerçekleştirmek için, daha önce CD161 pozitif olaylar üzerinde daha önce kapılı ham verileri okumak ile yükleyin.

flowSet fonksiyonu. Uygun sütunları seçerek ve verileri ArcSinh5 şekilde dönüştürerek ilgili biyolojik belirteçleri seçin. İşlevde kofacter=5 seçerek beş kofaktör uygulayın.

FlowSOM işlevini kullanarak verileri kümele ve daha önce Cytosplore tarafından verilen çıktıyla aynı 10 alt kümede verileri kümelemeyi seçerek FlwoSOM ve Cytosplore'u karşılaştırın. Daha sonra her hücreyi tanımlanan alt kümesine ve örnek ID'ye atayın.Grup atamasını içeren R meta veri dosyasını yükleyin ve metin el yazmasındaki kodu kullanarak FCS dosyalarına bağlayın. FlowSOM'dan elde edilen veri çerçevesini temel alan bir CF listesi oluşturun.

Ardından işaretçilerin Cytosplore çözümlemesi çıktısına benzer şekilde görünmesini yeniden sıralayın. Isı eşlemlerini oluşturmadan önce, hücre Sayısı işlevini kullanarak örnek başına sayım tablosunu oluşturun. Bazı kümeler diğerlerinden daha az hücre içerdiğinden, ölçek=gerçek işlevi içinde belirterek küme başına verileri ölçeklendirin, bu da örnekler arasındaki dağılımları görmeyi kolaylaştırır.

Verileri bir ısı haritasıyla görselleştirin ve hücre sayısını oluşturarak ancak her kümenin sıklığını elde etmek için verileri ölçeklendirmeyerek kutu çizimleriyle görselleştirin. Son olarak, CD45, CD11c ve CD54 işaretçilerin ifade yoğunluğunu belirteç adlarına göre görselleştirin ve bunları MSI çizim işlevine dahil edin. Sitofast, analizde tanımlanan ve işaretleyici ifadesine dayanan tüm kümelerin ısı haritası da dahil olmak üzere birçok olası çıktı çalıştırAr.

Üstteki dendrogram, tanımlanan kümeler arasındaki hiyerarşik benzerliği temsil eder. Üst panel, her örnekteki karşılık gelen alt kümelerin göreli miktarını gösteren başka bir ısı haritası görüntüler. Bu arada, sağdaki dendrogram, doğal öldürücü hücrelerin fenotipinin enjeksiyondan üç gün sonra PD-L1 tedavisi ile şekillendirdiğini gösteren alt küme frekanslarına dayalı örnekler arasındaki benzerliği göstermektedir.

Kombine ısı haritaları FlowSOM ve Cytofast ve Cytosplore ve Cytofast için elde edilebilir. Sitofast, verileri nicel olarak sunmak ve sonuçları kutu çizimlerinde görüntülemek için de kullanılabilir. Cytofast paketinde yer alan bir diğer özellik, grup başına her işaretçinin ortanca sinyal yoğunluğu çizimini gösteren MSI çizim işlevidir.

Bu işlev, PD-L1 tedavi edilen grubun doğal öldürücü hücrelerinde CD54 veya CD11c ekspresyonundaki artışlar gibi genel değişikliklerin algılanmasını sağlar. Bu teknik verileri görselleştirmek ve ölçmek için hızlı bir yoldur ve tedaviden sonra yeni hücresel yanıtları keşfetmek için kullanılabilir. Bu yöntemden sonra, R'deki genel test paketi yanıt değişkenleri ile ilişkilendirmek için bir grup covariates'i test etmek için kullanılabilir.

Bu, her alt küme ile klinik sonuç arasındaki korelasyonu gösterir.