Lenf Nodu Kriyosiyonlarında Tümör Hücre Adezyonunun Ölçülmesi

Metastaz için en sık görülen bölgeler orijinal lenf düğümleridir. Somatids in vitro tümör hücrelerinin lenf nodu bölümleri arasındaki yapışkan afiyeti tespit etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin bir avantajı taze lenf nodüllerinin orijinal dokunun doğal bir karmaşıklığını sağlamasıdır, bu da saflaştırılmış proteinler kullanılarak yeniden oluşması mümkün değildir.

Bu yöntem, lenf düğümleri gibi metastatik hedef organlarda tümör hücrelerinin adhezyonunu engelleyen genleri veya tedavileri tanımlamayı amaçlayan moleküler onkoloji çalışmaları için yararlı olabilir. Kurban otuz dakika içinde lenf düğümleri hasat için, oda sıcaklığında temiz bir diseksiyon tahtası üzerinde dorsal recumbency yetişkin Wistar sıçan yerleştirin ve% 70 izopropil alkol ile kürk sprey. Sterilize aletleri kullanarak, karın derisi asansör ve karın vissera ortaya çıkarmak için bir medial cilt kesi yapmak.

Torasik ve abdominal lenf düğümleri görünür hale gelene kadar bağırsak ayıklayın. Künt uçlu makas kullanarak, altta yatan superior mezenterik arteri yaralamadan lenf düğümlerini dikkatlice çıkarın ve lenf düğümünü 5 mL steril PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüm lenf düğümleri hasat edildiğinde, cryomold başına bir lenf düğümü her kalıbın tabanına aşağı yüz yerleştirin ve dokuları kapsayacak kadar optimum kesme sıcaklığı orta ekleyin.

Ani donma sonra, 22 santigrat derece 5 ila 8 mikrometre kalınlığında bölümleri elde etmek ve cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri toplamak için bir kriyostat kullanın. Aynı lenf nodu ardışık dilimleri gelen kaliteli kriyokes dilimler arasındaki farkları en aza indirmek için kritik, ve tutarlı hücre yapışma oranları kolaylaştırmak. Tümör hücre etiketleme için, uygun şekilde sahnelenmiş bir hücre kültüründen ilgi hücreleri hasat ve mL konsantrasyonu ve serumsuz orta başına 6 hücre ye 1 x 10 hücreleri yeniden askıya.

1 mL'lik hücreyi yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın ve hücreleri mL DiI(C18) başına 2 mikrogram ile 37 santigrat derecede on dakika etiketleyin ve hücre çökeltisi önlemek için beş dakikada hafif ajitasyon ile. Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj ile pelet ve herhangi bir fazla boya kaldırmak için taze serum içermeyen orta 10 mL ile etiketli hücreleri iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, serumsuz ortamın mL başına 6 hücresi ne kadar olan 1 x 10'da hücreleri yeniden askıya alın ve %0.1 büyükbaş hayvan serum albumin konsantrasyonu ile tamamlanır.

Hasat lenf düğümleri doku bölümleri üzerine etiketli tümör hücrelerinin proceeding, yavaşça PBS iki kez bölümleri yıkayın, oda sıcaklığında on beş dakika taze PBS yeniden hidrasyon izledi. Kuluçka sonunda, slaytları kurutmak için pamuklu bir bez kullanmadan önce, 37 santigrat derecede otuz dakika boyunca %2,5 büyükbaş serum albumini ile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Her bölümün etrafında bir bariyer çizmek ve her kuşatılmış lenf düğümü üzerine etiketli hücrelerin 100 mikrolitre eklemek için bir hidrofobik kalem kullanın.

Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir ila iki saat sonra, PBS'de dört nazik yıkama ile yapışmayan hücreleri çıkarın ve kalan yapışık floresan hücreleri oda sıcaklığında on beş dakika boyunca PBS'de %3,7 formaldehit ile düzeltin. Yapışkan indeksinin sayısallaştırılması için, parlak ve kırmızı floresan alanlarda her bölümün tek tek TIFF görüntülerini elde etmek için floresan mikroskop üzerindeki 10x hedefini kullanın. Daha sonra, Fiji'deki görüntüleri açmadan önce görüntüleri sistematik olarak adlandırın ve kaydedin.

Ölçeği ayarladıktan sonra, sayısallaştırılacak ilgi bölgesini seçmek için çokgen aracını kullanın. Lenf bezi alanını ölçmek için seçin. Veriler milimetre kare cinsinden ifade edilecektir.

Ardından, Eklentileri, Analiz et, Hücre Sayacı'nı seçin ve sayısallaştırılmış olmak için fotoğrafı tıklatın. Initialize'i tıklatın ve Sayaç Türünü seçin. Ardından, fotoğraftaki hücrelere tıklayın.

Lenf nodu adezyon indeksi lenf nodu kaplı alan başına yapışık tümör hücrelerinin sayısı olarak ifade edilecektir. Bir sonraki fotoğrafı açmak için bir sonraki fotoğrafı açın ve nicelleştirmeyi gösterildiği gibi tekrarlayın. Görüldüğü gibi, yapışık hücrelerin morfolojisi şeklinde yuvarlanır ve hücreler ilgi lenf düğümü boyunca heterojen olarak dağılır.

Lenf nodu adezyon indeksi NDRG4 negatif meme kanseri hücre hatlarında iki ila üç kat daha yüksektir, buna karşılık gelen NDRG4 pozitif hücreler için ölçülen ile karşılaştırıldığında. Bu prosedür, beyin veya akciğer gibi diğer metastatik hedef dokularda yapışma oranlarıyardımcı olmak için uyarlanabilir, döllenmiş tümör hücreleri için yapışma ikincil tercihli siteleri değerlendirmek için. Hem taze hem de dondurulmuş dokuların biyolojik olarak tehlikeli olarak düşünülmesi ve uygun biyo-güvenlik önlemleri kullanılarak ele alınması gerektiğini unutmayın.