Name: Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin, tavuk Eimeria parazitlerinde nükleofeksiyon ile genetik manipülasyon ve transfeksiyon protokolleri. Bu yöntem, aşı geliştirme ve ilaç hedefi taraması için genetiği değiştirilmiş parazitler oluşturmayı mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFD0501200) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31572507, 31772728 ve 31873007) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri için Tavuklar ev sahipliği ve Çin Tarım Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine göre muhafaza edildi ve Biyomedikal Araştırma Hayvanlar içeren için Uluslararası Rehberlik İlkeleri izledi. Deneyler Pekin Laboratuvar Hayvanları Yönetim Komitesi tarafından onaylandı.
1. Eimeria spp. sporozoitlerinin çıkarılması ve arıtımı (örn. E. tenella)
<ol><li>Sporokistlerin salınımı<ol>
<li>5 dk. 2.300 x g.'da potasyum dikromat çözeltisi (%2.5, m/v) santrifüj 1 x 107sporlu ookistler üç kez PBS (fosfat tampon çözeltisi) ile yıkayın.</li>
		<li>Peletleri 1 mL PBS ile yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Eşit hacimli cam boncuklar (1 mm x 1 mm çap aralığı) ekleyin ve sporokistleri serbest bırakmak için bir girdap mikseri kullanarak ookist süspansiyonuna salınım.</li>
		<li>Her dakika mikroskopi ile sporokistlerin salınımını izleyin. Ookistlerin %90'ından fazlası kırıldığında girdapyapmayı durdurun. NOT: Ookistlerin çoğu (E. tenella, E. necatrixve E. acervulinagibi) girdap mikseri kullanılarak 1 dk sonra kırıldı.</li>
		<li>Sporokist süspansiyonu yeni 1,5 mL tüplere ve santrifüje 1.600 x g 5 dk aktarın.</li>
		<li>Çökeltiyi 1 mL%50 yoğunluk gradyan çözeltisi ile yeniden askıya alın, 1,5 mL tüpte birleştirin ve 1 dk için 10.000 x g'de santrifüj edin. NOT: Yoğunluk gradyan kompozisyonu için Tablo 1'ebakın. Yoğunluk gradyanı, polivinilpyrrolidone (PVP) kullanılarak kaplanmış 15-30 nm çapındaki kolloidal silika parçacıklarından (%23 w/w) oluşan silika esaslı kolloidal bir ortamdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sporozoitlerin salınımı<ol>
<li>Ansifo tamponu(Tablo 1)ile çökelti yeniden askıya alın ve sporozoitleri serbest bırakmak için 42 °C'lik su banyosunda 40-60 dakika kuluçkaya yatırın. Sporozoitlerin %90'ından fazlası serbest bırakıldığında kuluçkayı durdurun. Sonra 10 dk için 600 x g santrifüj. NOT: Tüpleri her 5 dakikada bir salla.</li>
		<li>1 mL%55 yoğunluk gradyan çözeltisi ve 1 dk için 10.000 x g santrifüj ile yağışı yeniden askıya alın.</li>
		<li>PBS 1 mL ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak sporozoitler saymak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. E. necatrix'in merozoitlerinin toplanması ve arıtımı
NOT: Deneyde 7-14 d yaş arası Arbor Acre (AA) broilers kullanın. Kokidia içermeyen tavuklar (n=3) 2 x 105 ookist E. necatrixile aşılandı. Saat 109'da, kuşlar servikal çıkış la kurban edildi. Bağırsak2 nesil merozoitlerin toplanması için çıkarıldı. Farklı Eimeria türleriiçin, 2 nesil merozoitlerin toplanması için farklı bir zaman vardı: 109 saat e. necatrix ve 112 saat post-inoulation de E. tenella. E. necatrixtransfection için, merozoites ikinci merozoitler arındırmak kolay olduğu gibi optimal seçimdir.
<ol><li>E. necatrix ikinci nesil merozoitler koleksiyonu
	<ol>
<li>Tavuk bağırsağı uzunlamasına kesin, sarısı sapından (ince bağırsağın ortasından) ileosel orifise kadar, ve PBS veya HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi) ile hafifçe üç kez petri kabında yıkayın.</li>
		<li>Bağırsağı 0,5 cm x 0,5 cm'lik parçalara kesin ve sindirim tamponu ile konik bir şişeye yerleştirin(Tablo 1). Marozoitleri serbest bırakmak için 30-60 dk karıştırma çubuğu ile 37 °C'de bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe yerleştirin. Kuluçka 30 dakika sonra, mikroskobik inceleme ile her 5 dakika merozoitlerin salınımını izlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrasyon ve santrifüj ile merozoitler arındırın.<ol>
<li>Filtre gazlı bez dört kat kullanarak sindirilmiş merozoitler içeren süspansiyon14, ve santrifüj 600 x g 10 dakika için.</li>
		<li>Santrifüjden sonra, bağırsak enkaz içeren supernatant atın. Saflaştırılmış merozoitlerle yağışı 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
		<li>PBS 1 mL ile yağış resuspend ve bir hemositometre kullanarak merorositler saymak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Merozoitlerin veya sporozoitlerin nükleofection'ı
<ol><li>Parazitlerin nükleofeksiyonöncesi hazırlanması<ol>
<li>Bir tüp yaklaşık 107 merozoites veya sporozoitler hazırlayın. Merozoitler transfecting ise, 3-4 tüpler hazırlamak.</li>
		<li>10 μg'den büyük veya eşit miktarda plazmid DNA veya saflaştırılmış PCR parçası hazırlayın. NOT: Bu çalışmada kullanılan plazmid 2 gen içerir: gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ve dihidrofolat redüktaz timizilaz timisilat sintalaz Toxoplasma gondii türetilmiştir (TgDHFR-TS)15.</li>
		<li>Restriksiyon enziminin 25 U'su hazırlayın. Plazmidler doğrusallaştırılmışsa, restriksiyon enzimi transfeksiyon verimliliğini artırabilir. Plazmidler daireselse, restriksiyon enzimini atla.</li>
		<li>85 μL nükleofection tamponu hazırlayın: 20 μL nükleofection tamponU I ve 1 mL nükleofection tamponU II'yi karıştırın ve çözeltinin bir parçasını kullanın. Toplam arabelleğenin hacmi 100 μL'dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nükleofection<ol>
<li>10 dakika boyunca 600 x g sporozoit veya merozoit süspansiyon santrifüj. Sonra supernatant atın.</li>
		<li>Aşağıdaki sırada, sporozoit veya merozoitiçeren 1,5 mL tüpe 85 μL nükleer transfeksiyon tamponu, 10 g plazmid (PCR parçası) ve 25 U restriksiyon enzimi (genellikle 5 μL) ekleyin.</li>
		<li>Süspansiyonu nükleer transfeksiyon kabına aktarın. Bardağı nükleer transfer oluğuna koy.</li>
		<li>Güç düğmesini kullanarak nükleofection cihazını açın ve U-033transfeksiyon prosedürünü seçin. Nucleofection cihazı Serbest Program Seçimi modunda başlarsa, X düğmesine basarak bu moddan çıkın.</li>
		<li>Program bittiğinde, nükleofection cihazının X düğmesine basın ve ekran Tamam'ıgörüntülemeli ve çekirdeklemenin başarılı olduğunu belirtmelidir.</li>
		<li>Reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırdıktan sonra süspansiyonu 1,5 mL tüpe aktarmak için çekirdeklik kabına 0,5-1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM)8'i ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kloakal aşılama veya intravenöz enjeksiyon
<ol><li>Çekirdekleri 7 günlük tavuklara dönüştürün. E. necatrix'in merozoitlerini veya E. tenella sporozoitlerini kloakal yol üzerinden aşıla, ancak intravenöz enjeksiyon yoluyla E. acervulina sporozoitleri aşıla. Her tavuk içine yaklaşık 2 x 107 milyon sporozoitler aşılamak ve her kuş için 107 meronitrat.</li>
</ol>5. Yayılma ve FACS sıralama
<ol><li>Transfected sporozoitler ile 5-9 gün post-inoulation dışkı ookistler toplamak. Transfected merozoitler ile aşılama sonra üçüncü gün oocysts toplamak.</li>
	<li>Transgenik popülasyon oranını art arda artırmak için floresan aktif hücre sıralama (FACS) ve 150 mg/kg pirimethamin8 kullanın. NOT: Doğrudan beslemeye ekleyerek pyrimethamine kullanın. Daha rahat kullanım için suda çözünen pirimethamin hazırlayın. 0,2 mL pf H2SO4 ve 9,8 mL N-metil pirolidon (NMP) içinde pirimethamin 1 g çözünür ve sonra kuşlar için içme suyu 1 L içine bu stok çözeltisi 1,5 mL ekleyin.</li>
</ol>6. İsteğe bağlı kolon arınması
NOT: Daha saf sporozoitler veya merozoitler gerekiyorsa, bir diethylaminoethyl-52 selüloz (DE-52 selüloz) sütun yoluyla onları arındırır isteğe bağlı bir yöntem vardır.
<ol><li>DE-52 selüloz sütununu en az bir gün önceden hazırlayın.<ol>
<li>Glisin elüent tamponu/ Glisin elüent tamponunun pH'ını 7,6'dan 8,0'a ayarlayın ve önceden ısıtılmış 41 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>Sütuna 2,5 g DE-52 selüloz ekleyin. Su ekleyin ve bir gecede ıslatın. Supernatant atın.</li>
		<li>Su ekleyin ve 1 saat bekletin.</li>
		<li>0,1 M NaOH ekleyin ve en az 2 saat bekletin. Bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Supernatant'ı suyla değiştirin. Selüloz tamamen dibe yerleştikten sonra (yaklaşık yarım saat), bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Supernatant atın, 0.1 M HCl ekleyin ve en az 2 saat bekletin. Bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Supernatant atın ve glisin elüent tampon ile iki kez selüloz ıslatın.</li>
		<li>0,1 M HCl veya 0,1 M NaOH ekleyerek pH'ı 7,6'dan 8,0'a kadar ölçün ve ayarlayın. NOT: Bu bölümde sıvı, DE-52 selülozunkinden en az 5 kat daha fazla hacime sahiptir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış hızını 40-50 r/dk arasında ayarlayın.</li>
	<li>Selüloz sedimantasyonu tamamlandığında, kromatografik sütuna sporozoit veya merozoit süspansiyon ekleyin. Akış hızını 30-40 r/dk olarak ayarlayın. NOT: Kromatografik kolon eklemeden önce glisin elüent tampon ile sporozoit veya merozoit yağış resuspend.</li>
	<li>50 mL tüpler içine glisin elüent tampon ile toplayın. Elüsasyon işlemi sırasında sporozoitlerin veya meroozitlerin mikroskobik incelemesi sonuçlarına göre koleksiyonu durdurun.</li>
	<li>10 dk. Için 600 x g'de toplanan glisin elüent tamponunu santrifüj edin.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak sporozoitleri veya merozitleri sayın.</li>
</ol>

<ol><li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox%2C+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li>
<li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li>
<li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii%3A+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li>
<li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li>
<li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li>
<li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li>
<li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li>
<li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Eimeria+tenella%3A+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li>
<li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188(2014).</li>
<li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li>
<li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533(2015).</li>
<li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors%3A+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li>
<li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEckert%2C+J+%22Biotechnology%3A+Guidelines+on+techniques+in+coccidiosis+research%22">Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research</a>. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).</li>
<li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+%28Coccidia%2C+Apicomplexa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li>
<li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+magna+Perard%2C+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2(2017).</li>
<li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle%2C+Reproduction+and+Immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807(2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li>
<li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Polytechnica+Hungarica%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li>
</ol>

1990'larda apikompleks parazitler için bir transfeksiyon sistemi geliştirilmiş ve eimerian parazitler üzerinde çalışmalarda kullanılmıştır. Son zamanlarda, kararlı transfeksiyon E. tenella8yapıldı ,9 ve E. nieschulzi15. İkinci nesil merozoitler 11'i dönüştürerek E. necatrix'in kararlı transfeksiyonuna ulaştık. E. acervulina transfected sporozoitlerin kanat damarı ile aşılanmas...

Eimeria spp. koksidoza neden olur ve bu da hayvancılık ve kümes hayvanları endüstrisinde önemli ekonomik kayıplara yol açar. Antikokokidiyal ilaçlar, ve bir ölçüde, zayıflatılmış antikokokidiyal aşılar, coccidiosis kontrolü için yaygın olarak kullanılmaktadır rağmen, hala onların ilaç direnci ile ilgili eksiklikler vardır, ilaç artıkları, ve virülans yeniden aşı suşlarının potansiyel difüzyon1. Moleküler biyolojinin gelişmesiyle transfeksiyon, gen fonksiyonlarını incelemek, yeni aşılar geliştirmek ve Eimeriaiçin yeni ilaç hedeflerinitleme için hayati bir araç haline gelmiştir.
Son yıllarda, transfeksiyon plazmodium ve Toxoplasma gondii2,3,4,5,6gibi apicomplexan parazitler için başarıyla uygulanmıştır. E. tenella transfection için bir muhabir olarak β-gal kullanarak bir çalışma Eimeria7gibi çalışma pilot . E. tenella8transfeksiyon ,9, E. mitis10, ve E. acervulina (Zhang ve ark., yayınlanmamış veri) tavukbaşarılı oldu. Son zamanlarda, biz nükleofection11ile E. necatrix merozoitler kullanarak transfeksiyon elde etti.
Çalışmalar eimeria heterolog antijen ifade bir rekombinant aşı olarak geliştirilebilir potansiyeline sahip olduğunu gösterdi, bu campylobacter jejuni antijen A ifade gibi (CjaA) veya tavuk interlökin 2 (chIL-2)12,13. Bu nedenle, bu protokol tavuklarda Eimeria spp. bir nükleofection çalışma açıklar. Prosedür, sporozoitlerin veya merozoitlerin saflaştırılmasını, plazmid DNA ile nükleofeksiyonu, kloakal aşılama/intravenöz enjeksiyonu ve araştırmacıların transgenik Eimeria parazitleri üzerinde çalışmalara başlamalarına yardımcı olmak için in vivo yayılımı tanımlar.

<table><tbody><tr><td>ATP-disodyum</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz DE-52</td><td>Solarbio</td><td>C8350</td><td></td></tr><tr><td>Sabit Akış Pompası</td><td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td><td>HL-2B</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MACGENE</td><td></td><td></td></tr> CM15019 <tr><td>Cam boncuklar</td><td>Sigma</td><td>Z250473-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>No. V900116</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Biyotopped</td><td>G6200</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>MACGENE</td><td>CC016</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>No. V900041</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Hızlı Santrifüj</td><td>PEKİN ERA BEILI SANTRIFÜJ CO., LTD.</td><td>DT5-2</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı</td><td>SCILOGEX</td><td>MS-H280-Pro</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Sigma</td><td></td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo hücre ayırıcı</td><td>BeckMan Coulter, ABD</td><td>201309995</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Nükleofeksiyon cihazı</td><td>LONZA/amaxa</td><td>90900012 (Nükleofektör II)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (DG gradyan stok çözeltisi)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum taurodeoksikolat hidrat</td><td>Sigma</td><td>T0875</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Mikrosantrifüj</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bileşimi: sodyum piruvat, L-glutamin ve 25 mM HEPES ile 4,5 g / L glikoz.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td>Pekin Kuzey TZ-Biotech Develop.co.</td><td>HQ-60-II</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu Termostatı</td><td>Hibe Aletleri (Cambridge), Ltd.</td><td>GD120,GM0815010</td><td></td></tr></tbody></table>

tavuk eimeria parazitlerinin nükleofeksiyon uyup in vivo propagation

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfeksiyon, DNA ve çift iplikli RNA gibi genetik materyalin ilgi genini değiştirmek için hücrelere teslim edildiği teknik bir süreçtir. Şu anda, transgenik teknoloji Eimeriaçalışma için vazgeçilmez bir araç haline geliyor , kümes hayvanları ve hayvancılık koksidoz nedensel ajanlar. Bu protokol eimerian parazitlerde kararlı transfeksiyonun ayrıntılı bir tanımını sağlar: sporozoitlerin veya ikinci nesil merozitlerin saflaştırılması ve nükleofeslenmesi ve transfected parazitlerin in vivo yayılımı. Bu protokolü kullanarak, Eimeriaçeşitli türlerde transfection elde etti. Birlikte ele alındığında, nükleofection eimerian parazitlerde genetik manipülasyon kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.

Bu protokol eimerian parazitleri nakletmek için kullanılmıştır. Bu çalışmada Şekil 2A ve Şekil 2B'de E. necatrix'in 2. nesil meront ve merozoitleri gösterilmiştir, Şekil 2C ve Şekil 2D yoğunluk gradyan çözeltileri kullanılarak E. tenellasporocysts ve sporozoitleri gösterilmiş...

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Eimeria türleri için transfeksiyon protokollerinin oluşturulması gen fonksiyonlarının incelenmesine, yeni aşıların geliştirilmesine ve Eimeria için yeni ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniği kullanarak, Eimeria'nın çeşitli türlerinin transfeksiyonuna ulaştık ve nükleofeksiyon eimerian parazitlerde genetik manipülasyon uygulamasını kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır. Eimeria'nın çekirdekleri, in vitro olarak kültüre geçirilemeyecek diğer parazitlerin transfeksiyonu için bir referans sağlar ve genetik manipülasyon çalışmalarını hızlandırır.Bu tekniği ilk kez denerseniz, deney sırasında çırpınmamak için transfeksiyon başlamadan önce tüm reaktifleri ve aletlerini iyi hazırlamalısınız. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi, Eimeria'nın transfeksiyonuna odaklanan insanların bu deneyin karmaşık ayrıntılarını görmelerine yardımcı olur. Sporokistlerin salınımı ile başlamak için, potasyum dikromat çözeltisi içinde yedi sporlu ookistler bir kez 10 2, 5 dakika için 300 kez g santrifüj.PBS ile üç kez yıkayın. PBS bir mililitre ile pelet resuspend ve 15 mililitrelik bir tüp karışımı aktarın. Bir milimetre çapında cam boncuk eşit hacim ekleyin ve sporokistler serbest bırakmak

nucleofection-and-in-vivo-propagation-of-chicken-eimeria-parasites

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların...

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

Kaynak: Yates, J. G. E., et al. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (202)Video, virüsle enfekte edilmiş embriyolu tavuk yumurtalarından toplanan berraklaştırılmış allantoik sıvıdan virüs partiküllerinin saflaştırılmasını ve konsantre edilmesini göstermektedir. Videoda, bütün virüsleri izole etmek için derinlemesine filtrasyon, teğetsel akış filtrasyonu ve yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjasyonu içeren bir dizi filtrasyon ve ayırma...

Embriyonasyonlu Tavuk Yumurtalarının Allantoik Sıvısından Virüs Purifikasyonu

Bu videoda, floresan raportör proteini kodlayan plazmit DNA'sını tavuk Eimeria parazitinin sporozoit formuna iletmek için elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon prosedürü olan nükleofeksiyonu açıklıyoruz.

Parazit Formlarının Nükleofeksiyonu: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Sporozoit Çekirdeğine Vermek için Elektroporasyon Tabanlı Bir Transfeksiyon Yöntemi

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Bereketli tavuk yumurtaları, yüksek miktarda insan influenza A virüsü üretmek için yaygın olarak kullanılır, çünkü yüksek virüs verimini kanıtlamak için uygun ve uygun maliyetli bir sistem sağlarlar.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Tavuklarda Eimeria enfeksiyonu teşhisi zorlu olmaya devam etmektedir. Parazit morfolojisi ve konak patolojisi odaklı yaklaşımlar genellikle sonuçsuz kalırken, PCR'ye dayalı moleküler yaklaşımların maliyet ve uzmanlık açısından zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolün amacı, eimerian enfeksiyonu için basit bir moleküler tanı olarak döngü aracılı izotermal amplifikasyonu (LAMP) oluşturmaktır.

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Bu yöntem, tavuk embriyosunu, bakteriyel patojen L. monocytogenes'i yaşayabilir ancak kültürlenemeyen (VBNC) bir durumdan canlandırmak ve bakteri uyku hali mekanizmalarının anlaşılmasında potansiyel olarak daha fazla kullanım sağlamak için basit ve uygun maliyetli bir in vivo model olarak göstermektedir.

Canlı Ancak Kültürlenemeyen Patojenleri Canlandırmak için İn Vivo Model Olarak Tavuk Embriyosu

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Öğrenin, tavuk Eimeria parazitlerinde nükleofeksiyon ile genetik manipülasyon ve transfeksiyon protokolleri. Bu yöntem, aşı geliştirme ve ilaç hedefi taraması için genetiği değiştirilmiş parazitler oluşturmayı mümkün kılar.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Daha fazla video keşfet