Name: Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Öğrenin, Drosophila larvalarında oenosit diseksiyonu ve BODIPY 493/503 ile lipid damlacığı boyaması yöntemini. Bu teknik, lipid metabolizmasını ve açlık stresi altında damlacık dinamiklerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31671422, 31529004 ve 31601112), 111 Projesi (D18010), Guangdong Perl River Yetenekler Programı Yerel Yenilikçi Araştırma Ekipleri Projesi (2017BT01S15) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2018M640767).

1. Yumurta Yumurtlama
<ol><li>Yumurta yumurtlamak için standart mısır unu gıda hazırlayın. NOT: Burada kullanılan standart mısır unu için tarifi ve pişirme prosedürü için, daha önce yayınlanan ayrıntıları15bakın .</li>
	<li>50 mL'lik bir santrifüj tüpe 4 g aktif kurumaya 6 mL distile su ekleyerek taze maya macunu hazırlayın. Karıştırmak ve bir hamur yapmak için bir spatula kullanın.</li>
	<li>Mısır unu gıdaşişeiçine doldurarak yumurta yumurtlama şişeleri yapmak ve bir spatula ile mısır unu gıda yüzeyine maya ezmesi yaklaşık 1 g yayıldı.</li>
	<li>İstenilen genotiplerin sineklerini bir yumurtlayan şişeye yerleştirin ve 25 °C sabit sıcaklık ve %60 nem ile bir kuvöze yerleştirin. NOT: İdeal haçlar genellikle 150 bakire sinek ve en az 75 erkek oluşur. Yumurta yumurtlayan şişelerin üzerine ışık geçirmez bir kutu yerleştirerek sinekleri karanlıkta tutmak üreme hızını artıracaktır.</li>
	<li>Yumurta toplama önce, sinekler dişi oviducts saklanan kalan tüm eski yumurta ların kaldırılmasına izin vermek için 1 saat için yumurtlayın.</li>
	<li>Sinekler 1 saat için yeni bir yumurta yumurtlama şişesinde yumurtlamak ve şişe den yetişkinler kaldırmak sağlar. NOT: Tam olarak kontrol edilen bir gelişim aşamasında larva elde etmek için gelişim aralığını en aza indirmek için yumurta yumurtlama süresini kontrol edin.</li>
	<li>Yumurtaların 12 h/12 h ışık/karanlık döngüsü ile 25 °C'de kuvözdeki üçüncü instar larvasına 84 saat boyunca gelişmesine izin verin.</li>
</ol>2. Larvalar için Açlık Tedavisi
NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, üçüncü instar larvalarda, normal beslenme koşullarında oenositlerde az veya hiç saptanabilir lipid damlacıkları vardır, ancak açlık gibi stres koşulları altında oenositlerde çok sayıda büyük lipid damlacıkları indüklenebilir. Bu yöntemi daha fazla doğrulamak için, oenositlerde lipid damlacık biyogenezini indüklemek için bu larvaları pretreat etmek gerekir. Burada, 12 saat, 24 saat ve 36 saat lik bir açlık süresi paradigma olarak seçilmiştir. Özellikle, açlık kısa bir süre (örneğin, 3 saat) oenositlerde saptanabilir lipid damlacıkları neden etmek için yeterlidir. Açlık süresi belirli deneysel hedeflere ve ayarlara göre değişebilir.
<ol><li>Açlık ve kontrol tedavileri için oda olun.<ol>
<li>Açlık işleme odaları için: 6 cm Petri kabına uygun büyüklükte bir filtre kağıdı ve 1 mL PBS pipetini filtre kağıdına yerleştirin.</li>
		<li>Kontrol tedavi odaları için: Petri kabına 5 mL Bloomington standart mısır unu yiyeceği yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hala gıda burrowing ve PBS 5 mL dolu bir Petri kabına aktarmak larva içeren gıda üst tabakası yavaşça kazmak için bir spatula kullanın. Larvalardan herhangi bir gıda kontaminasyonunu gidermek ve mümkün olduğunca temiz hale getirmek için PBS'deki larvaları hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Aynı yaklaşık boyutta 40 üçüncü instar larvaları toplamak için küçük bir paintbrush kullanın. Her biri 20 larva içeren bir açlık veya kontrol odasına rastgele sıralayın.</li>
	<li>Odaları %60 nem oranıyla 25 °C'de kuvöze yerleştirin ve 12 saat, 24 saat ve 36 saat tedavi için geliştirmeye izin verin. NOT: Açlık odasındaki larvalar için, larva dehidratasyonını önlemek için her 12 saatte bir 1 mL PBS ekleyin.</li>
</ol>3. Oenositdisedonu
<ol><li>Uygun yaş larvaları (12 saat, 24 saat veya 36 saat) almak için küçük bir fırça kullanın, ardından bunları 5 mL buz gibi PBS ile dolu yeni bir Petri kabına aktarın. NOT: Herhangi bir gıda kontaminasyonu kaldırmak için bir kontrol odasında larva ile uğraşırken adım 2.2 tekrarlayın.</li>
	<li>Bir diseksiyon plakasını buz gibi PBS ile doldurun ve larvaları yavaşça diseksiyon plakasına aktarmak için çerkes kullanın. Aşağıdaki diseksiyon adımı için diseksiyon plakasını stereo mikroskop altına koyun. NOT: Buz gibi sıcaklık larvaların hareketlerini yavaşlatır ve diseksiyonu kolaylaştırır.</li>
	<li>Larva ventral tarafını yukarı ve dorsal tarafı aşağı doğru çevirin ve forceps kullanarak nazikçe yerinde tutun. Ön uçta farinks ve arka uçta spiracle ile başka bir pin olsa bir diseksiyon pin yerleştirerek diseksiyon plakası için larva güvenli. NOT: Sırt tarafı en kolay trakea dorsal gövdeleri varlığı ile tanımlanır.</li>
	<li>Vannas bahar makası kullanın (uzunlamasına) anterior dan arka sonuna epidermis yoluyla eğim .(uzunlamasına).</li>
	<li>Forceps kullanarak epidermisin iç dokusunu çıkarın. NOT: Epidermisin iç yüzeyinde lokalize olan oenositlerin zarar görmesini önlemek için trakeal dalları çıkarılırken dikkatli olunmalıdır.</li>
	<li>Forceps ile, diseksiyon pimleri almak ve buz üzerinde PBS dolu bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine epidermis aktarın.</li>
	<li>Yukarıda açıklanan prosedürü izleyerek diğer larvaları incelemeye devam edin.</li>
</ol>4. Lipid Damlacık Boyama
<ol><li>Bir rotator üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika (RT) için fiksasyon tampon diseksiyon epidermis inkübül. NOT: Fiksasyon tamponu PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) içerir.</li>
	<li>Sabitleme tamponunu çıkarın ve ardından hızlı bir yıkama. Hızlı bir yıkama yapmak için, PFA'nın çıkarılmasından sonra tüpe RT'de 1 mL PBS ekleyin, dokuları nazikçe yeniden askıya alın ve PBS'yi atın. DİkKAT: Fiksasyon tamponu, insan sağlığına zararlı PfA içerir. Fiksasyon tamponunu tehlikeli atık olarak düzgün bir şekilde bertaraf etmek önemlidir.</li>
	<li>Mümkün olan tüm PFA kalıntısını temizlemek için numuneleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile 3 kat yıkayın.</li>
	<li>Epidermisin imal inkübesini BODIPY 493/503 (1 μg/mL; bkz. Malzeme Tablosu)30 dk boyunca RT'de bir rotator üzerinde kuluçkaya yatırın. NOT: Bu adımdan itibaren, numuneleri ışıktan korumak ve olası fotoğraf beyazlatma işlemini en aza indirmek için mikrosantrifüj tüpünü bir parça alüminyum folyo ile sarın.</li>
	<li>BODIPY 493/503 boyama çözeltisini çıkarın ve artık boyaları tamamen çıkarmak için numuneleri pbs ile her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın.</li>
</ol>5. Montaj ve Görüntüleme
<ol><li>Temiz bir mikroskop slaytına 6 μL montaj ortamı yerleştirin. NOT: Montaj ortamı, antifade özelliklerine göre daha uzun algılama süresi için kullanılır.</li>
	<li>Bir epidermis almak ve hafifçe bir silme ile artık PBS kaldırmak için forseps kullanın.</li>
	<li>Epidermisin montaj ortamına yerleştirin ve oryantasyonunu oenositleri içeren iç yüzeyinin altta, dış yüzeyinin üstte olması için ayarlayın.</li>
	<li>Yavaşça epidermisin üzerine bir kapak kayması yerleştirin. NOT: Gerekirse kapak altından sızan ekstra montaj ortamını bir mendille çıkarın. Görüntülemeyi kolaylaştırmak için, mikroskoptaki slaytı gözlemlerken oenosit kümesinin tek bir düzlemde kolayca görüntülenebilmeleri için coverslip'i pİşplerle hafifçe aşağı doğru itin. Alternatif olarak, dokuları monte ederken tüm epidermisin yuvarlanmasını önlemek için epidermisin orta hattan iki yarı epidermisin içine kesilmesi uygulanabilir.</li>
	<li>Mühür kapağının kenarlarına açık oje uygulayın.</li>
	<li>Bir ışık geçirmez örnek kutusuna slaytlar koyun ve 5-10 dakika sürebilir RT, kuruoje izin verin.</li>
	<li>Mikroskobik analize devam edin. En aza indirgenmiş arka planile temiz ve hassas sinyaller elde etmek için konfokal mikroskop (optimize GFP veya FITC filtre ayarları, uyarma = 488 nm, emisyon = 503 nm ile 63x büyütme) kullanarak görüntü alın.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila: development and disease.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Cheng, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+fly+research+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Fruit fly research in China.</a> Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).</li>
<li>Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+and+Drosophila+models+to+investigate+the+mechanistic+links+between+diet%2C+obesity%2C+type+II+diabetes%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).</li>
<li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).</li>
<li>Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+functions+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">The development and functions of oenocytes.</a> Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+suppresses+age-dependent+ectopic+fat+accumulation+by+maintaining+the+proteostasis+of+PLIN2+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila.</a> Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+lipid+droplet+turnover+in+response+to+nutrient+deprivation+via+p62-mediated+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).</li>
<li>Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+roles+of+intracellular+lipid+droplets%3A+from+archaea+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals.</a> Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nile+red%2C+a+fluorescent+hydrophobic+probe%2C+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections%3A+comparison+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).</li>
<li>Gocze, P. M., Freeman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+underlying+the+variability+of+lipid+droplet+fluorescence+in+MA-10+Leydig+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells.</a> Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials (Basel). 11 (9), (2018).</li>
<li>BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).</li>
<li>Milon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+estrogens+regulate+lipid+status+in+testicular+steroidogenic+Leydig+cell%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?</a> Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).</li>
<li>Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+alters+astrocyte+fatty+acid+metabolism+and+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Yukarıda özetlenenler arasında, bu protokolde birkaç kritik adım vardır ve yumurtlama süresi bunlardan biridir. Bir lipid-mobilize doku olarak, oenosit beslenme durumuna son dereceduyarlıdır 6,8. Uzun süre yumurtlama süreleri kargalarva ve artan gıda rekabetine neden olabilir, yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu protokolde kullanılan 1 saatlik yumurta yumurtlama süresi larvaların beslenme rekabeti olmadan gelişmesini sağlar. Daha uzun yumurtlama sürelerinden kaynak...

Lipidler hücre hayatta kalmak için gereklidir. Hücre zarı sistemlerinin ayrılmaz bileşenleri olarak geleneksel rolüne ek olarak, lipidler de enerji kaynağı ve tek tek hayvanların yaşam döngüleri boyunca transdüksiyon sinyal önemli işlevleri oynamak1. Bu nedenle, lipid metabolizması hücrelerde fizyolojik hemostaz korumak için sıkı düzenlemelere uygun olmalıdır. Lipid metabolizmasının disregülasyonunun diyabet ve yağlı karaciğer gibi çeşitli hastalıklara neden olduğu bilinmektedir. Lipid metabolizmasının hayvan sağlığındaki büyük önemine rağmen, lipid metabolizması regülasyonunun altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.
Drosophila, profesör Thomas H. Morgan'ın genetik ve diğer temel biyolojik soruları içeren çalışmalarda kullanmaya başlamasından bu yana yıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır2. Son birkaç on yıl içinde, ortaya çıkan kanıtlar Drosophila obezite gibi birçok lipid metabolizması ile ilişkili hastalıkların çalışmada mükemmel bir model organizma olduğunugöstermiştir,gibi1,3. Özellikle, Drosophila insanlar ile son derece korunmuş metabolik genleri paylaşır ve lipid metabolizması için benzer ilgili doku / organ ve hücre tipleri sahip.
Örneğin, Drosophilayağ vücut , hangi triasilgliserit depolama sorumludur, insan yağ dokusuna benzer işlevleri. Son zamanlarda, insan karaciğerine fonksiyonel bir analog olduğu bildirilen özel hepatosit benzeri hücreler (yani, oenositler), meyve sinekler yağ asidi ve hidrokarbon metabolizması dahil olduğu gösterilmiştir bir küme4,5. Memeli karaciğerlerinde olduğu gibi, oenositler hem larva hem de erişkin Drosophilalipid damlacık oluşumunu aktive ederek açlık yanıt , oenositlerde lipid damlacık birikimi ile sonuçlanan4,6,7,8. Anatomik olarak, oenositler sıkıca abdominal hemisegment başına yaklaşık altı hücre kümeleri lateral epidermisin bazal iç yüzeyine bağlı, hangi epidermis oenosit kümeleri izole etmek için uygulanamaz hale getirir. Bu nedenle, diseksiyon ve boyama sırasında oenositler epidermis bağlı olmalıdır.
Lipidler lipid damlacıkları şeklinde depolanır, hangi hücrelerde tek katmanlı membranlar ile organeller olan9. Lipid damlacıkları farklı türler arasında hemen hemen tüm hücre tiplerinde var10. Lipid damlacık dinamiği, büyüklüğü ve sayısı da dahil olmak üzere, çevresel strese yanıt olarak değişir. Bu strese yanıt olarak metabolik durumun bir yansıması olarak kabul edilir, yaşlanma ve açlık gibi7,8. Bu nedenle, gelişim sırasında ve stresli koşullar altında oenositlerde lipid damlacık dinamiklerini nitel olarak belirlemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem geliştirmek büyük önem taşımaktadır. Özellikle, üçüncü instar larva, oenositler beslenen koşullar altında az veya hiç saptanabilir lipid damlacıkları içeren, ancak beslenme yoksunluğu sonra çok sayıda büyük lipid damlacıkları içerir4. Bu yöntemin etkinliğini doğrulamak için, aç koşullar altında oenositlerde lipid damlacık boyama gerçekleştirmek için önerilmektedir.
Şu anda, birkaç lipophilic boyalar lipid damlacıkları boyama için kullanılabilir, nonfloresan boyalar Sudan Siyah ve Yağ Red O ve floresan boyalar Nil Kırmızı ve BODIPY 493/50311gibi . Sudan Siyah ve Petrol Red O yaygın doku kolesteril esterleri ve triasilgliseroller için kullanılan ve kolayca ışık mikroskopisi ile tespit edilebilir. Ancak, nispeten yüksek arka plan boyama ve nispeten düşük çözünürlük lipid damlacık dinamikleri nitel analizinde uygulamaları için iki sınırlayıcı faktörlerdir. Floresan olmayan boyaların sınırlamalarını aşmak için Nil Kırmızısı ve BODIPY 493/503 lipid damlacık boyamaiçin ideal bir ikame olarak kullanılmaktadır. Bu Nil Kırmızı da bazı unesterified kolesterol tespit edebilirsiniz bildirilmiştir, hangi BODIPY yapar 493/503 hücresel lipid damlacıkları için daha spesifik bir boya, bir ölçüde12,13,14.
Her şeyden önce, oenositlerde lipid damlacıklarının hızlı ve hassas analizi ihtiyacını karşılamak için, bu protokol leke boyası olarak BODIPY 493/503 kullanarak fiksatif tabanlı lipid damlacık özgü boyama uygulanabilir ve son derece tekrarlanabilir bir yöntem sunar. Bu raporda, oenositler kesilir ve BODIPY 493/503 oenositlerde lipid damlacık boyama için kullanılır, hangi lipid damlacıkları konfokal mikroskopi ile tespit edilir. Bu yordamın kolaylığı ve karşılanabilirliği, akış sitometrisi gibi diğer uygulamalarda modifikasyon ve daha fazla kullanım için idealdir.

<table><tbody><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>6 cm Petri kabı</td><td>Thermo Fisher</td><td>150326</td><td>6 cm</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td>Sinek yemi için</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Akçaağaçı ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Lipid damlacık boyama boyası</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica TSC SP5</td><td>Konfokal görüntüleme</td></tr><tr><td>Sinek yemi için</td><td>Mısır şurubu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sinek yemi için</td><td>Mısır unu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 & kez; 20 mm, 0.13-0.17 kalınlık</td></tr><tr><td>Diseksiyon pimi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon plakası</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Çap: 11 cm</td></tr><tr><td>Sabitleme tamponu</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>4x PBS'de %1 Paraformaldehit (PFA)</td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>#5</td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>Sinek kültürü için</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Mikroskopi slaytı</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>VECTASHIELDAntifade Montaj ortamı</td><td>H-1000</td><td>Antifade montaj ortamı</td></tr><tr><td>Oje</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>Lameli kapatın</td></tr><tr><td>Boya fırçası</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4, pH 7.4)</td></tr> <tr><td>Rotator</td><td>Kylin-Bell Lab Instruments</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Smartdata Medical</td><td>SR81</td><td>Vannas baharlı makas</td></tr><tr><td>Soya unu</td><td></td><td></td><td>Sinek yemi için</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Standart mısır unu yemeği N/A N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Bloomington standart mısır unu yemek tarifine göre</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>Doku diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Kağıdı silin</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Maya</td><td></td><td></td><td>Sinek yemeği için</td></tr><tr><td>yw</td><td>Laboratuvar stoğu olarak tutulur</td><td>N/A</td><td>Drosophila</td></tr></tbody></table>

drosophila larvalarında oenositlerin diseksiyonu ve lipid damlacık boyaması

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipidler hayvan gelişimi ve fizyolojik homeostaz için gereklidir. Lipid metabolizmasının disregülasyonu obezite ve yağlı karaciğer gibi çeşitli gelişimsel bozukluklar ve hastalıklarla sonuçlanır. Genellikle, lipid damlacıkları saklanır, hangi hücrelerde çok fonksiyonlu lipid depolama organelleri olan. Lipid damlacıkları farklı dokularda ve farklı koşullar altında boyut ve sayı değişir. Bu lipid damlacıkları sıkıca biyogenez ve bozulma nın düzenlenmesi ile kontrol edildiği bildirilmiştir. Drosophila melanogasterolarak , oenosit lipid metabolizması için önemli bir dokudur ve son zamanlarda strese yanıt lipid seferberliği ile ilgili bir insan karaciğer analog olarak tespit edilmiştir. Ancak, oenositlerde lipid damlacık metabolizmasının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmalar zor olmaya devam etmektedir. Bu sorunu çözmek için, geliştirme sırasında ve stresli koşullar altında oenositlerde lipid damlacık dinamik değişiklikleri doğrudan görselleştirmek için güvenilir ve hassas bir yöntem geliştirmek son derece önemlidir. Lipofilik BODIPY 493/503 yararlanarak, bir lipid damlacık özgü floresan boya, burada açıklanan diseksiyon ve açlık yanıt olarak Drosophila larvaların oenositler sonraki lipid damlacık boyama için ayrıntılı bir protokoldür. Bu konfokal mikroskopi ile çeşitli koşullar altında lipid damlacık dinamikleri nitel analizi için izin verir. Ayrıca, bu hızlı ve son derece tekrarlanabilir yöntem de oenositler ve diğer dokularda lipid damlacık metabolizması içeren yeni genetik faktörlerin girintisi için genetik ekranlarda kullanılabilir.

Bu işlemin başarılı bir şekilde yürütülmesi, oenositlerde lipid damlacıklarının sayısını ve boyutunu ortaya çıkaran açık lipid damlacıklarının boyanması ile sonuçlanmalıdır. Şekil 1A,A',A'' farklı gelişim evrelerinde normal beslenme larvalarının oenositlerinde az sayıda saptanabilir lipid damlacıkları (yeşil nokta) olduğunu göstermektedir. Şekil 1B,B',B'' 12 h (B), 24 h (B') ve 36 h (B'') açlık d...

Burada, lipit damlacılığa özgü floresan boya olan BODIPY 493/503 kullanılarak Drosophila larvalarında oenositlerin diseksiyon ve lipid damlacık boyama sıyrıklarının diseksiyonu ve lipid damlacık boyaması için ayrıntılı yöntemler sunulmuştur.

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Oenosit diseksiyonu ve lipid damlacık boyama bu yöntem normal ve stresli koşullar altında drosophila larvaosit lipid damlacık görünümünü gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem sadece böceklerde değil, sadece birkaç küçük değişiklik ile memelilerde de lipid metabolizması incelenmesi için yararlı bir araç sağlar. Yumurtlamak için, 150 bakire dişi sinek ve istenilen genotiplerden 75 erkeği bir yumurtlama şişesine yerleştirin ve şişeyi %60 nem oranına sahip 25 derecelik santigrat derecede ışık geçirmez bir kutunun altına yerleştirin.Bir saat sonra, yeni bir şişe sinekler aktarın ve sinekler yetişkinler çıkarmadan önce bir saat için yeni şişe de yumurtlamak sağlar. Daha sonra, yumurta12 saatlik açık-koyu döngüsü ile 25 derece Celcius 84 saat boyunca üçüncü instar larvaiçine geliştirmek için izin verin. Açlık tedavisini başlatmadan önce, altı santimetrelik petri kabına uygun büyüklükte bir filtre kağıdı yerleştirin ve bir açlık odası oluşturmak için kağıda bir mililitre PBS ekleyin.Bir kontrol tedavi odası yapmak için, altı santimetre Petri çanak içine Bloomington standart mısır unu gıda beş mililitre yerleştirin. Odalar hazır olduğunda, yumurta döşeme şişeaynı yaklaşık boyutta instar larvaları toplamak için küçük bir boya fırçası kullanın. Ve her açlığa ve kontrol odasına rastgele 20 larva.Daha sonra 12, 24 veya 36 saat boyunca kuvözdeki odaları yerleştirin ve/veya açlığı azdir. Tedavi süresinin sonunda, larvaları her odadan buz gibi pBS içeren bir diseksiyon plakasına nazikçe aktarmak ve plakayı stereo mikroskop altına yerleştirmek için çersepskullanın. Orient ilk larva ventral tarafı yukarı ve yavaşça yerde larva tutmak için forceps kullanın.Larvayı tabağa sabitlemek için bir iğneyi yuvara, diğer iğneyi de spiracle'den geçirin. Vannas bahar makası kullanın ve epidermisin içinden ön simetreden hayvanın arka ucuna kadar uzunlamasına bir kesi yapın. Epidermisin iç dokusunu çıkarmak için forceps kullanın, epidermisin iç yüzeyinde oenositlerin zarar görmesini önlemek için özen.Daha sonra diseksiyon pimlerini almak ve epidermisin buz üzerindeki 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarılması için forceps kullanın. Lipid damlacık boyama için, bir rotator oda sıcaklığında 30 dakika fiksasyon tampon diseksiyon epidermis inkübül, PBS bir mililitre hızlı bir resuspension takip. Daha sonra herhangi bir artık fiksatif kaldırmak için yıkama başına PBS bir mililitre üç beş dakikalık yıkar ile örnekleri yıkayın.Son yıkamadan sonra epidermal numuneleri uygun bir lipofilik probu ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında rotator üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, dokuları ışıktan korumak için numune tüplerini folyoya sarın ve numuneleri bir mililitre PBS'de yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Oenositleri görüntülemek için, her epidermis örneğini temiz bir mikroskop slaytına monte eden altı mikrolitreye aktarın, dokunun yönünü ayarlayın, böylece oenositleri içeren iç yüzey slaytın dibine dokunuyor.Yavaşça epidermisin üzerine bir kapak yerleştirin ve kenarları açık oje ile kapatın. Cila kuruduğunda, bir konfokal mikroskop üzerinde görüntü örnekleri, uygun uyarma ve emisyon dalga boyları ile 63 X büyütme koymak. Farklı gelişim evrelerinde normal beslenme larvalarının oenositlerinde birkaç saptanabilir lipid damlacıkları vardır.Ancak bu temsili görüntülerde de görüldüğü gibi, 12, 24 ve 36 saatlik açlık perilerine yanıt olarak oenositler içinde lipid damlacıklarının sayısı artmaktadır. Bu yöntem, genetik veya çevresel manipülasyonların hücrelerde lipid damlacık değişikliklerine neden olup olmadığını araştırmak için ilgili araştırma alanlarındaki araştırmacılariçin kolay ve uygulanabilir bir protokol sağlar.

dissection-lipid-droplet-staining-oenocytes-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Böcekler, oenocytes cuticular hidrokarbon bileşikleri üretir. Bu bileşikler kuruma karşı korumak ve kimyasal iletişimi kolaylaştırmak. Burada yetişkin oenocytes izole etmek için kullanılan bir diseksiyon tekniği...

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

Nişler ve kök hücre gelişimi sırasında formu nasıl pratik etkileri olan önemli bir soru.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

Yetişkin hazırlamak için standart bir...

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

Bu video, lipofilik floresan BODIPY bazlı boya kullanılarak Drosophila larva oenositlerinde (hepatosit benzeri hücreler) lipid damlacık lekelenmesini göstermektedir. Bu hücreler, gelişim sırasında ve açlık gibi çevresel strese yanıt olarak lipid metabolizmasını incelemek için bir model görevi görür.

Larva Drosophila Oenositlerinin Lipid Damlacık Boyaması: BODİPY Bazlı Boya Kullanılarak Normal ve Stresli Koşullarda Lipid Damlacık Birikiminin Değerlendirilmesi İçin Bir Teknik

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Öğrenin, Drosophila larvalarında oenosit diseksiyonu ve BODIPY 493/503 ile lipid damlacığı boyaması yöntemini. Bu teknik, lipid metabolizmasını ve açlık stresi altında damlacık dinamiklerini incelemek için kullanılır.

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Daha fazla video keşfet