Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması
November 28th, 2019
Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.
Membran ve hücre duvarı seçici floresan boyalar organel dinamiği ve yaşayan mantar hücrelerinin analizi için önemli araçlardır. Protokollerimiz, bu boyaların seçiminin gerçekten hayati lekeler olarak uygulanması için temel teorik arka plan ve pratik kılavuzlar sağlamaktadır. Bunun için önemli nokta hala yüksek kaliteli, uzun vadeli canlı hücre görüntüleme için gürültü oranları için iyi sinyal sağlarken doygunluk veya boya toksisitesi ile ilgili hücresel eserler neden olmayan çok düşük boya konsantrasyonları kullanmaktır.
Tıp Üniversitesi Nükleer Tıp Bölümü'nden meslektaşlarımızla, yakın zamanda bu boyama tekniklerini kullanarak aapergillosis'in görüntü güdümlü tanısı için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Membran ve hücre duvarı yapılarını gerçek zamanlı olarak izleyebilme yeteneği, deneysel ilaç bileşiğinin alım dinamiklerini belirlemek için çok önemliydi. Bu prosedüre başlamak için, öncelikle hazırlanmış bir önkültür edinin.
Prekültür koloni kenarından sporlaşmayan misel taşı taşıyan küçük bir agar bloğunu kesmek için steril bir neşter kullanın. Deneysel kültürü aşılamak için agar bloğunu taze, katı bir orta plakanın ortasına yerleştirin. Kuluçkaya yatılması amaçlanan gelişim aşamasına göre deneysel kültürü kuluçkaya yatırın.
Örnek hazırlama biraz hassas ve görüntü edinme ayarları optimizasyonu oldukça karmaşıktır. Sözlü açıklama eşliğinde her iki yordamın görsel gösterimi büyük ölçüde çoğaltılamazlığı kolaylaştırır. Numuneleri monte etmek için, temiz bir 24 by 60 milimetrecam kapak kayma hazır tutmak ve merkezi üzerine sıvı minimal orta veya fizyolojik tuz çözeltisi 18 mikrolitre ekleyin.
Hazırlanan 20 mikromografi boyasının iki mikrolitresini kapak kayar ortasındaki sıvıya ekleyin ve hava kabarcıklarının üretimini önlerken birkaç kez yukarı ve aşağı borular atarak iyice karıştırın. Temiz bir neşter kullanarak, koloninin çevresinden 15 ila 15 milimetrelik bir numune kesip kapak kapağındaki orta damlanın yanına dikey olarak yerleştirin. Bloğun üst kenarını ve bloğun arka tarafını yerinde tutmak için parmağınızı desteklemek için neşter kullanın.
Daha sonra miselyumu sıvının üzerine taşıyan tarafı yavaşça indirin. Hazırlanan örneği mikroskop aşamasına monte edin. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi tek tek hyphae ayakta dinamikleri yakalamak için temel görüntü edinme ayarlarını ayarlayın.
Endositoz alımı tahlilleri için, mikroskopi sisteminde bulunan FM 143 veya FM 464 için en iyi uyarma ve emisyon ayarlarını belirlemek ve sistemdeki bu ayarları buna göre ayarlamak için şekil 1'e ve metin protokolünden birine başvurun. Önceden ayarlanmış ayarları kullanarak görüntü kaydına başlayın ve sonuçları değerlendirin. Daha sonra, denemenin odaklandığı plazma zarı veya endositon dinamiği nin yönünü yakalamak için gereken mekansal ve zamansal çözünürlüğe görüntü kazanım ayarlarını optimize edin.
Hücre duvarı dinamiği için, uygulanan hücre duvar boyası için en iyi uyarma ve emisyon ayarlarını belirlemek ve mikroskopi sistemindeki ayarları buna göre ayarlamak için şekil 4 ve tablo bir metin protokolüne başvurun. Önceden ayarlanmış ayarları kullanarak görüntü kaydına başlayın ve sonuçları değerlendirin. Daha sonra, denemenin odaklandığı hücre duvarı morfogenezinin yönünü yakalamak için gereken mekansal ve zamansal çözünürlüğe görüntü edinme ayarlarını optimize edin.
Sadece hücresel süreçleri görselleştirmenin yanı sıra, canlı hücre görüntüleme kaydedilen verilerden nicel bilgilerin çıkarılmasını sağlar. FM 464 alım testlerinin bir örneğinde, mantar örnekleri koloni olarak yetiştirilir ve ters agar blok yöntemi ile monte edilir. Tahliller gen delemesi ve gen aşırı trichoderma atroviride mantar spesifik protein SFP 2 mutantlar aşırı ifade endositoz in spatio-temporal organizasyon kusurları tespit.
Endositik kompartmanlara yönelik floresan füzyon proteinlerinin FM 464 birlikte boyama örnekleri burada gösterilmiştir. Bu co-boyama iki gelişmiş yeşil floresan protein transmembran proteinleretiketli hücre altı dağılımı ile ilgili istihdam edilir, SFP 2 ve GPR 1, trichoderma atroviride endositik yol. Morphogenetik farklılıkların belirlenmesi için FM 464 ortak boyama bir örnek bu co-boyama unescently etiketli BUD-6 polarizm karmaşık protein subsellüler lokalizasyon dinamikleri daha fazla ilişki sağlar septa ve polarize hipüf ucu büyüme oluşumu gibi bazı insan ticaretine bağlı süreçlerin sonuna kadar gösterir.
Ayrıca nörospora crassa vahşi tip ve mutant suşları arasında hücre altı organizasyon ve hiphal mimarisi farklılıkları karakterize eder. Temsili hücre duvarı boyama gösteriyor ki calcofluor beyaz farklı etkileşim özellikleri, solofenil flavine, ve hücre duvarı polimerleri ile kongo kırmızısı delta SFP 2 mutant ve trichoderma atroviride vahşi türü arasındaki morfogenetik farklılıkları vurgulamak. Yüksek boya konsantrasyonları tarafından neden hücre duvarı stresinin artırılması daha hızlı oluşur ve vahşi türüne göre mutant daha belirgindir.
Buna ek olarak, aynı görüntüler her iki suş arasında hiphal çapı ve septal mesafe ile ilgili morfogenetik farklılıkların nicelleştirilmesi için izin verir. Hücre duvarı biyosentezinin gerçek zamanlı olarak izlenmesi, çok düşük kalkoflor beyaz konsantrasyonunun hücre duvarının boya molekülleri ile doygunlaşmasını engellediğini ve hücre duvarı biyosentezinin kantitatif gerçek zamanlı izlenmesine olanak sağladığını gösterir. Bu yeni hücre duvar materyalinin birikimi tek düze olmadığını ortaya koymaktadır, ancak nörospora crassa dermalinfüzyon önce hücre-hücre eki üzerine bir hücre-hücre eki üzerine bir hücrenin göreli yerinden kaynaklanan lokalize fiziksel streslere çok hızlı yanıt verir.
Daha az daha fazladır. Floresan belirteçlerin hücresel süreçlere müdahalesini engellemek için mümkün olduğunca az boya kullanın. Bu işlemden sonra, taşıma ve biyogenez kinetik ölçmek için foto-beyazlatma deneyleri sonrası flourescence kurtarma yapılabilir.
Milenyumun başında ipliksi mantarlarda membran ve hücre duvarı boyamaöncü giriş kelimenin tam anlamıyla mantarlara bakmak şekilde devrim yaptı. Calcofluor beyaz göz tahrişlerine neden olabilir ve sınıflandırılmış bir kanserijendir. Kongo kırmızısı kanserli ve teratojeniktir, bu yüzden lütfen bu boyaları kullanırken göz ve cilt koruması takın.
Genel Bakış
Bu çalışma, filamentli mantarlarda plazma zar dinamiklerini, endo-/ekzositozu ve hücre duvarı morfogenezini izlemek için canlı hücre görüntülemede floresan boyaların kullanımını araştırmaktadır. Hücresel artefaktlar oluşturmadan çeşitli boyaların uygulanması için pratik kılavuzlar sunarak hücresel süreçlerin doğru gözlemlenmesini sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Canlı hücre görüntüleme
- Mantar hücre biyolojisi
- Hücre zar ve duvar dinamiği
Arka Plan
- Hücresel süreçlerin incelenmesinde hayati floresan boyaların önemi
- Hücresel artefaktları önlemek için düşük boya konsantrasyonlarının gerekliliği
- Dinamik hücresel davranışların gerçek zamanlı izlenmesi
Kullanılan Yöntemler
- Floresan boyama teknikleri
- Trichoderma atroviride ve Neurospora crassa gibi filamentli mantarlar
- Görüntü elde etme ve analiz protokolleri
Ana Sonuçlar
- Membran dinamiklerinin ve endositozun başarılı bir şekilde izlenmesi
- Floresans eş boyama yoluyla morfogenetik farklılıkların belirlenmesi
- Strese yanıt olarak hücre duvarı biyosentezini kantitatif izleme
Sonuçlar
- Çalışma, mantarlarda canlı hücre görüntüleme için etkili teknikler göstermiştir.
- Sonuçlar, mantar biyolojisindeki hücresel organizasyon ve dinamiklere değerli bilgiler katmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging of filamentous fungi using selective fluorescent dyes enables mechanistic de-risking of target validation by resolving spatiotemporal dynamics of endocytosis and cell wall biogenesis. Quantitative imaging supports predictive confidence in phenotypic screening and assay development for antifungal target identification. The approach provides a disease-relevant system for evaluating compound effects on fungal morphology and trafficking pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genetic mutants to defects in endocytic spatio-temporal organization.
- Operational Value: Enables functional target validation through co-localization of GFP-labeled proteins with endocytic compartments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying morphogenetic cell wall defects in mutants via differential dye interaction with cell wall polymers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated fungal systems for downstream screening by establishing artifact-free staining protocols at low dye concentrations.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through optimized excitation/emission settings for FM dyes and cell wall stains.
- Scalability: Facilitates platform reuse across filamentous fungal species with adaptable cultivation conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time monitoring of cell wall biosynthesis in response to localized physical stresses, informing mechanism of action studies.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation by quantifying hyphal diameter and septal distance as morphodynamic biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing differential cell wall deposition dynamics between wild-type and mutant strains under stress.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical morphodynamic profiling in filamentous fungal models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying endocytosis defects in genetic mutants via FM dye uptake assays.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized sample preparation using inverted agar block mounting and low-dose dye working solutions.
- Analytics: Enables quantitative extraction of transport and biogenesis kinetics via fluorescence recovery after photo-bleaching (FRAP) compatible protocols.
- Translational Research: Connects to preclinical work by monitoring real-time cell wall biogenesis and its response to cell-to-cell attachment stresses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for longitudinal studies of fungal cellular organization across multiple strains and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by resolving subcellular dynamics of membrane and cell wall processes.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through low-dye protocols that prevent saturation and toxicity while maintaining signal-to-noise ratio.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative morphodynamic readouts that reduce late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through comparative characterization of shared and distinct protein localization in endocytic pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fungal culture maintenance, sterile technique, and live-cell microscopy.
- Needs fluorescence microscopy with configurable excitation/emission settings and environmental control for long-term imaging.
- Demands cross-team standardization of dye working concentrations and mounting procedures to ensure reproducibility.
- Requires adaptation of incubation conditions and sample preparation for species-specific filamentous fungal models.
- Limited by photobleaching at high acquisition frequencies and potential dye-induced stress at supra-vital concentrations.
