Name: Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Öğrenin farelerde Leishmania amazonensis ile kutanöz leishmaniasis enfeksiyonunu değerlendirme yöntemini. Bu protokol, konak inflamatuar yanıtı ve parazit replikasyonunu eşzamanlı analiz ederek virülans çalışmalarına sistemik bakış sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Merkezi'nden Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara'ya destek için ve Prof. Dr. Silvia Reni Uliana'ya cam doku öğütücüsünü temin ettiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sao Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP - MFLS hibe 2017/23933-3) tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler São Paulo Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (CEUA 342/2019) ve São Paulo Eyaleti Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili öneriler ve politikalara uygun olarak yürütülmüştür (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) ve Brezilya hükümeti (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Bölüm 1-5'te açıklanan tüm adımlar laminar akış dolaplarıiçinde aseptik olarak yapılmalıdır. Canlı Leishmania parazitleri kullanılırken kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılmalıdır.
1. In Vitro Farklılaşma L. amazonensis Promastigotes içine Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38
NOT: Bu istetkide L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) paraziti kullanılmıştır. Çalışma amacına bağlı olarak, enfektif parazit formu ya daha önce açıklandığı gibi, bir yoğunluk gradyanı kullanarak metasiklik formun saflaştırılması ile elde edilebilir14, veya axenic amastigotes içine promastigotes farklılaşması, aşağıdaki protokole göre.
<ol><li>Promastigotes (pro-medium) (pH = 7.0) için orta 10 mL içeren 25 cm2 hücre kültürü şişesi nde La promastigotes büyümek.</li>
	<li>25 °C'de 3 gün kuluçkaya yatırın. NOT: Parazitlerin39, 40 ,41,42,43,44virülans ve aneuploidi değişikliklerinin kaybını önlemek için 10x'ten daha az in vitro olarak geçen promastigote kültürleri kullanın.</li>
	<li>Yeni bir 25 cm2 şişe içine logaritmik büyüme fazı promastigot ekolünün pipet 5 mL.</li>
	<li>Axenic amastigotes (ama-medium) (pH = 5.2) için orta 5 mL ekleyin.</li>
	<li>34 °C'de 3-4 gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1:3 oranında ama-orta ile seyrelterek kültürü yeni bir 25 cm2 şişeye bölün.</li>
	<li>34 °C'de 3-5 gün kuluçkaya yatırın. NOT:37.olgunlaşmanın sonunu temsil eden axenic amastigotes'i 5 güne kadar kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. L. amazonensis ile C57BL/6 Ayak Takımı Enfeksiyonu
NOT: Kadın C57BL/6 fareler (6-8 haftalık) São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Merkezi'nde elde edildi ve bakımı yapıldı. Hayvanlara yiyecek ve su reklamı libitum aldı.
<ol><li>PBS'de seyreltilmiş parazit süspansiyonunun bir aliquot'u Neubauer odasına (yani hemositometre) aktararak axenic amastigotes kültürünü sayın. Amastigotes formlarını temsil eden kamçısız parazitleri sayın. NOT: Alternatif olarak, Trypan mavisi (1:1) uygun amastigotes sayısını saymak için kullanılabilir (yani, Bu Trypan mavi ile boyanmış değil).</li>
	<li>PBS'deki axenik amastigotları istenilen inokül dozuna ve amaçlanan inokül sayısına göre seyreltin (50 μL PBS'de 1 x 106 axenic amastigotes önerilir).</li>
	<li>Hazırlanan parazit süspansiyonu ile 27 G iğne ile bir tüberkülin şırınga yükleyin.</li>
	<li>Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi45tarafından tavsiye edilen% 3-5 izoflurankullanarak bir C57BL/6 fare anestezik. Farenin bir parmak kıskacına yanıtını test ederek anestezi derinliğini değerlendirin.</li>
	<li>Homojenize parazit süspansiyonunun 50 μL'sini (1 x 106 axenic amastigotes veya istenilen inokül dozu) sol arka ayak alt dipdokusunda, önceden yüklenmiş tüberkülin şırıngını kullanarak (adım 2.3) inceleyin.</li>
</ol>3. Fare Ayak Takımı Lezyon Gelişimi
<ol><li>Bir kaliper kullanarak sol (enfekte) ve sağ (enfekte olmayan) ayak lıklarının kalınlığını ölçerek haftada bir lezyonun ilerlemesini ölçün.</li>
	<li>Lezyon progresyonunu değerlendirmek için haftalık olarak sol ve sağ arka ayak altlıkları arasındaki kalınlık farkını hesaplayın.</li>
	<li>Hesaplanan farkları Y ekseni ve bulaşmasının zamanı üzerinde X ekseninde çizin ve istatistiksel anlamlılığı hesaplayın. NOT: Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin tavsiyeleri doğrultusunda, deri ülserleri ikincil enfeksiyona yol açabileceğinden, enfekte lezyon ülsere hale gelmeden önce hayvanlar kurban edilmelidir. Ek Şekil 1'degösterildiği gibi, lezyonların bu protokolde kullanılan parazit dozu (106 axenic amastigotes) ve konak suşu (C57BL/6) ile ülserasyon belirtileri göstermesi yaklaşık 10 hafta sürmelidir. Ülserasyon belirtileri gözlemlenmeden önce fareler lezyon ekstraksiyonu için kurban edilmelidir.</li>
</ol>4. Fareler Footpad Lezyon Ekstraksiyon ve Parazit Sınırlayıcı Seyreltme
<ol><li>Tüm kuyulara 180 μL pro-medium ekleyerek limitli seyreltme teşbi46,47 için 96 kuyu plakası (düz alt) hazırlayın. NOT: Her hayvan için dört lüzumlu tahlilleri (yani, hayvan 1 = a-d şeritleri; hayvan 2 = e-h şeritleri) temsil eden dört plaka şeridi (plakanın yarısı) kullanın.</li>
	<li>Lezyon başına cam doku öğütücü tüp pro-orta 1 mL ekleyin ve tüp tartın. NOT: Tüp steril tutulmalıdır, bu nedenle steril bir kapak kullanın ve kapalı kapaklı tüpü tartın, laminar akış dolabının dışında tartılırsa.</li>
	<li>Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin tavsiyelerine uyarek hayvanı CO2 odasında kurban edin. % 70 etanol ile püskürtme hayvan dezenfekte.</li>
	<li>Enfekte footpad ayıklamak ve dezenfeksiyon için ayak takımı% 70 etanol sprey için topuklar hayvanın ayak çıkarmak. Makas ve forceps sterilizasyon% 70 etanol içinde ıslatılmış tutarak emin olun.</li>
	<li>Bir steril Petri çanak enfekte footpad yerleştirin ve tüm yumuşak dokuları toplamak için steril forceps ve bir neşter kullanarak incelemek. Kemikleri atın. NOT: Diseksiyon basamağı nda tekdüzelik önyargılı doku iyileşmesini önlemek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Toplanan dokuları pro-medium ile cam doku değirmeni tüpüne aktarın, sonra lezyon ağırlığını belirlemek için tüpü tekrar tartın. NOT: Küçük hacimler çıkarılabildiğiniz için, çalgılar ve neşterleri doğrudan ortama yerleştirmekten kaçının, bu da doku ağırlığının hafife alınmasına neden olabilir. Lezyonun ağırlığı, pro-orta içeren tüpün ağırlığı ile toplanan dokunun sadece pro-orta içeren tüpün ağırlığından çıkarılarak hesaplanır.</li>
	<li>Tam doku bozulması için değirmeni kullanarak doku 10x homojenize.</li>
	<li>10 dakika boyunca tortu karışımı izin verin, sonra supernatant 20 μL toplamak.</li>
	<li>Adım 4.1'de hazırlanan 96 kuyu plakasının 1inci şeridinin 1inci sütunundaki süpernatantın 20 μL'sini yükleyin. Sonraki üç şerit için her hayvan için dört katına çıkmak için bunu tekrarlayın (örneğin, hayvan 1 için her kuyuya 20°L ekleyin ve A1, B1, C1 ve D1 etiketini etiketleyin).</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak 1inci sütun 10x'teki her kuyuyu homojenize edin. Daha sonra seyreltilmiş numunelerin 20 μL'sini 1inci sütundan 2sütuna aktarın. NOT: Her kuyu10x'ü bir sütundan diğerine homojenize etmek önemlidir.</li>
	<li>Kalan tüm sütunlara kalan tüm sütunlara 4.10 adımını son sütuna (12th)kadar tekrarlayın ve seyreltilmiş numunenin son 20 μL'sini atın. NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için her seyreltmeden sonra uçları değiştirin.</li>
	<li>Plakaları bir filmle kapatın ve 25 °C'de nemli bir odada 7 gün kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>5. Lezyon Parazit Yükü Tayini
<ol><li>Her şerit için son parazit içeren kuyuyu belirlemek için ters bir mikroskop kullanarak 7 günlük kuluçkadan sonra plakaları analiz edin. NOT: Ortamın renk değişimleri ve bulanıklığının görsel analizi ile parazitlerin veya hücre yoğunluğunun büyümebelirtisine de sahip olmak mümkündür.</li>
	<li>Lezyon ağırlığı başına seyreltme faktörü bölerek her şerit için parazit doku yükünü hesaplayın. NOT: Belirli bir şeritte, parazitler sadece 1-5 sütunlarında mevcutsa (yani, A1-A5 kuyuları parazit büyümesi için pozitiftir), bu sütun 5'te sadece 1 parazit, sütun 4'te 10 parazit ve benzeri on katlarda bulunduğu anlamına gelir. Sütun 1, supernatantın ilk 20 μL'indeki parazit sayısını temsil eden 104 parazit içerecektir (adım 4.7'deki seyreltilmemiş numune). Bu 20 μL pro-orta 180 μL ile seyreltilmiş olduğundan, ilk tüp 5 x 105 parazit içeriyordu: (1 x 104) / (0.02 mL) = 5 x 105 parazit/1 mL. Daha sonra, bu lezyondaki parazit yükü, parazitin başlangıç konsantrasyonunun lezyon ağırlığına bölünmesi ile hesaplanabilir: (5 x 105) / lezyon ağırlığı (bkz. adım 4.6).</li>
	<li>Bir günlük Y-ölçeği ile her hayvan için dörtlü sonucun ortalamasını çizin.</li>
</ol>6. İstatistiksel Analiz
<ol><li>Verileri, kopyaolarak deney grubu başına en az beş hayvan kullanarak ortalama ± standart sapma olarak temsil edin.</li>
	<li>P değeri < 0,05'in önemli olduğunu göz önünde bulundurarak, eşleşmemiş iki kuyruklu testi kullanarak istatistiksel analiz yapın.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Bu protokolde açıklanan in vivo enfeksiyon test sistemik bir senaryoda konak-parazit etkileşimi dikkate alınarak herhangi bir araştırmacı in vivo kutanöz leishmaniasis değerlendirmek için izin verir. Bu tahliller birçok grup tarafından kullanılmıştır22,24,27,29,31,32,34,<sup class...

Leishmaniases gelişmekte olan ülkelerde önemli sorunları temsil eden dünya çapında yaygın paraziter bulaşıcı hastalıklar ve Dünya Sağlık Örgütü1,2tarafından en önemli ihmal tropikal hastalıklardan biri olarak kabul edilmektedir. Leishmaniases kutanöz ile karakterizedir, mukozal, ve / veya visseral belirtileri. Kutanöz leishmaniasis genellikle L. amazonensisneden olur , L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica ve L. aethiopica3. Hastalığın Bu formu genellikle koruyucu hücresel immün yanıt indüksiyon nedeniyle insanlarda kendi kendine iyileşme olduğunu. Ancak, hücresel immün yanıt başarısız olabilir, ve hastalık yaygın kutanöz leishmaniasis ilerleyebilir4,5. Leishmania türleri ve ev sahibi genetik arka planlar arasında çeşitlilik nedeniyle kullanılabilir bir aşı yoktur6,7. Tedavi seçenekleri de şu anda mevcut ilaçların çoğu ya pahalı, toksik, ve / veya uzun süreli tedavigerektirebilirolarak sınırlıdır 8,9. Ayrıca, mevcut tedavilere karşı ilaç direnci raporları olmuştur10,11.
Leishmaniases ve nedensel ajan protozoon parazit Leishmaniaolduğunu. Parazit yaşam döngüsünde iki farklı morfolojik form sunar: promastigotes, kum sinalarda bulunan kamçılı form; ve amastigotes, memeli konak makrofajlar parasitophorous vakuollerde bulunan hücre içi formu12,13. Amastigotes 'yeteneği işgal etmek, hayatta kalmak ve omurgalı konak makrofajlar savunma mekanizmaları rağmen çoğaltmak birçokçalışmalaratabidir 14,15,16,17. Sonuç olarak, çeşitli araştırma grupları belirli çevresel faktörlerin yanı sıra parazit ve konak genlerin parazit enfektiliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu tahlilleri tarif edilmiştir. Bu tahlil, yüksek iş verime biçimine çalışmaları uyarlama yeteneği, sonuç elde etmek için nispeten daha kısa bir süre ve18kurban edilen laboratuvar hayvanı sayısının azalması gibi çeşitli avantajlar sunar. Ancak, in vitro tahlil bulguları her zaman in vivo çalışmalarda çoğaltmak değil çünkü sınırlıdır14,19,20,21. In vivo tahliller tam in vitro tahliller tarafından taklit edilemez konak-parazit etkileşimi, sistemik fizyolojik bir bakış sağlar. Örneğin, immünolojik çalışmalar toplanan footpad doku bölümlerinden immünohistokimyasal tahliller yoluyla ve hatta kurtarılan bağışıklık hücrelerinin analizi için popliteal lenf düğümlerinden yapılabilir22.
Hayvanlar genellikle biyolojik ve biyomedikal araştırmalarda insan hastalıkları için bir model olarak daha iyi hastalıkların altında yatan fizyolojik mekanizmaları anlamak için kullanılır23. Leishmaniasis durumunda, rota, site, veya aşı lama dozu hastalık sonucu etkisi24,25,26,27. Ayrıca, duyarlılık ve insanlar ve farelerde enfeksiyona direnç son derece konak ve parazit genetik arka planlar tarafından düzenlenir4,5,22,28,29,30,31. BALB/ c fareler l. amazonensis kutanöz enfeksiyona son derece duyarlıdır, lenf düğümleri, dalak ve karaciğer 32 parazitlerin yayılması ile hızlı bir hastalık ilerlemesi gösteren32. Hastalık kutanöz metastazlara doğru ilerleyebileceğinden, enfeksiyon ölümcül olabilir. Buna karşılık, C57BL/6 fareler genellikle L. amazonensis enfeksiyonu tahlilleri kalıcı parazit yükleri ile kronik lezyonlar geliştirmek33. Böylece, Bu özel fare türleri ile L. amazonensis enfeksiyon insanlarda kutanöz leishmaniasis kronik formları çalışmak için mükemmel bir model olarak kabul edilmiştir, bu BALB / c fareler enfeksiyon modeli daha iyi hastalık ilerlemesini taklit çünkü5,34.
Bu nedenle, biz in vivo enfeksiyon murine insan hastalığı için geçerli Leishmania virülans fizyolojik çalışmalar için yararlı bir yöntem olduğunu önermek, konak-parazit etkileşimsistemik bir görünüm sağlayan. Iyi kurulmuş tahliller22revisiting , burada axenic amastigotes içine parazit farklılaşması nı oluşturan L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu bir derlenmiş adım adım protokol mevcut, fareler ayak takımı kutanöz aşılama, lezyon gelişimi, ve parazit yük tayini. Bu protokol kutanöz leishmaniases neden diğer fare suşları ve Leishmania türlerine adapte edilebilir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntem yenianti-Leishmania ilaç hedefleri ve aşıları belirlenmesinde çok önemlidir, yanı sıra leishmania enfeksiyonuna konak bağışıklık ve metabolik tepkiler fizyolojik çalışmalarda.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>Seyreltme testini sınırlamak için düz tabanlı bir plaka</td></tr><tr><td>adenin</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td>M199 hücre kültürü ortam</td></tr><tr><td>kaliperine</td> eklenen ek <td>Mitutoyo</td><td>700-118-20</td><td>Ayak pedi hücre kültürü şişesinin kalınlığını ölçmek için bir kumpas</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Leishmania parazit santrifüjünü yetiştirmek için 25 cm2 hacimli hücre kültürü şişesi</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Numuneleri yoğunluğuna göre ayırmak için kullanılan bir ekipman</td></tr><tr><td>CO2 inkübatör 34 &derece; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>Amastigot farklılaşması için bir inkübatör</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Merck</td><td>K50237083820</td><td>Genel ürünler için bir dezenfektan</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>M199 hücre kültürü ortamına eklenen</td></tr><tr><td>takviye cam doku öğütücü tüp</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431 E04</td><td>Enfekte ayak pedi dokusunu</td></tr> <tr><td>toplamak ve bozmak için bir tüpglikoz</td><td>Synth</td><td>G1008.01.AH</td><td>Takviyesi M199 hücre kültürü ortamına eklendi</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Yazılımı</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Verileri çizmek ve istatistiksel anlamlılığı hesaplamak için kullanılan bir yazılım</td></tr><tr><td>hemin</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>Takviyesi M199 hücre kültürü ortamına eklendi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td><td>Takviyesi M199 hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>inkübatörüne eklendi 25 &deg; C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>Promastigot yetiştiriciliği için bir inkübatör</td></tr> ters <tr><td>mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Promastigot ve amastigot kültürlerini görsel olarak analiz etmek için kullanılan bir ekipman</td></tr><tr><td>izofluran</td><td></td><td></td><td>Fareler için bir inhalan anestezik (%3-5)</td></tr><tr><td>laminer akış kabini</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>Aseptik çalışma alanı için kullanılan bir biyogüvenlik kabini</td></tr><tr><td>M199 hücresi kültür ortamı</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>Leishmania yetiştirme mikrosantrifüj tüpü için bir hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>Numune toplama, işleme ve saklama için kullanılan bir mikrotüp</td></tr><tr><td>multichanel pipet</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>Seyreltme testini sınırlamak için kullanılan çok kanallı bir pipet</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>M199 hücre kültürü ortamına ek eklendi</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>M199 hücre kültürü ortamına ek eklendi</td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>HBG</td><td>2266</td><td>Paraziti saymak için bir hemositometre süspansiyon</td></tr><tr><td>optik mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>Parazit parafilmini saymak için kullanılan bir optik ekipman</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>349</td> Hücre kültürü ortamını <td>kapatmak için esnek ve dayanıklı bir plastik plaka</td></tr><tr><td>penisilin/streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>M199 hücre kültürü ortamına eklenen</td></tr><tr><td>takviye Petri kapları</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Ayak pedi dokusunu incelemek için steril bir kap</td></tr><tr><td>pipetman kiti</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td>Dört pipetleyici içeren bir mikropipet kiti (P2, P20, P200, P1000)</td></tr> <tr><td>terazisi</td><td>, Quimis</td><td>BG2000</td><td>Toplanan ayak tabanını tartmak için kullanılan bir ekipman lezyonlar</td></tr><tr><td>neşter</td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>Ayak tabanı dokusunu kesmek ve toplamak için bir neşter</td></tr><tr><td>serolojik pipet 10 mL</td><td>Yuva</td><td>327001</td><td>Mililitre hacim uçlarını aktarmak için kullanılan steril bir pipet</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td></td><td>Mikrolitre hacimleri aktarmak için kullanılan bir pipet ucu</td>Tripan</tr><tr><td>mavisi</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Canlı parazitleri saymak için kullanılan bir boya</td></tr><tr><td>triptikaz pepton</td><td>Merck</td><td></td><td>Takviyesi, M199 hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>tüberkülin şırıngasına</td><td></td> eklendi <td>BD 305945</td><td>Parazit süspansiyonunu aşılamak için 27G iğneli bir şırınga</td></tr></tbody></table>

farelerde parazit virülans değerlendirmek için leishmania amazonensis ile vivo enfeksiyon

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. leishmaniases neden protozoan parazitler, kutanöz visseral lezyonlar için klinik bulgular geniş bir yelpazede mevcut hastalıklardır. Şu anda, 12 milyon kişi Leishmania dünya çapında enfekte olduğu tahmin edilmektedir ve 1 milyardan fazla insan enfeksiyon riski altında yaşıyor. Leishmania amazonensis Orta ve Güney Amerika'da endemik ve genellikle doğrudan bir hayvan modelinde görselleştirilmiş olabilir hastalığın kutanöz formuna yol açar. Bu nedenle, L. amazonensis suşları kutanöz leishmaniasis çalışmaları için iyi modeller de kolayca in vitro yetiştirilen çünkü. C57BL/6 fareler insanlarda gözlenen L. amazonensisgüdümlü hastalık ilerlemesini taklit eder ve kutanöz leishmaniasis için en iyi fare suşları modeli olarak kabul edilir. Omurgalı konak, bu parazitler bu hücrelerin savunma mekanizmaları rağmen makrofajlar yaşıyor. Çeşitli çalışmalarda farklı koşullar altında parazit enfekte değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu testleri kullanın. Ancak, in vitro yaklaşım organizmanın tepkisini göz ardı izole bir hücre sistemi ile sınırlıdır. Burada, konak-parazit etkileşimine sistemik fizyolojik bir bakış sağlayan in vivo murine enfeksiyonu yöntemini derlemekteyiz. L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu için ayrıntılı protokol enfektif amastigotlar, fareler ayak takımı kutanöz inokülasyon, lezyon gelişimi ve parazit yük tayini içine parazit farklılaşması nı kapsar. Bu köklü yöntemi, konakçının immün ve metabolik yanıtlarının kutanöz leishmaniasis'e karşı fizyolojik çalışmalar için en uygun yöntem olarak öneriyoruz.

Leishmania protozoan parazitler omurgasız ve omurgalı konaklarında yaşam döngüsü boyunca iki gelişimsel formlarda bulunurlar: promastigotes, dişi kum sineğinin lümeninde bulunan proliferatif formlar; ve amastigotes, memeli konak hücrelerin parasitophorous vakuollerde bulunan proliferatif formları. Promastigotes yaklaşık 1.5 μm genişliğinde ve 20 μm uzunluğunda uzun bir gövdeye sahiptir ve genellikle ön ekstremiteden çıkan bir kamçı vardır. Amastigotes boyutu 2-6 μm uzunluğunda ve...

Burada, Leishmania amazonensisile farelerin kutanöz enfeksiyon değerlendirmek için derlenmiş bir protokol sıyoruz. Bu parazit virülans çalışma için güvenilir bir yöntemdir, enfeksiyona omurgalı konak yanıtı sistemik bir görünüm sağlayan.

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Bu protokol Leishmania virülansını incelemek için uygundur, çünkü kutanöz enfeksiyona omurgalı konak sistemik bir görünüm sağlar. Bu protokolü benimseyen en büyük avantajı, araştırmacıların konak inflamatuar yanıtı ve parazit replikasyonlarını aynı anda değerlendirmelerine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, kutanöz leishmaniasis kontrolüne yeni anlayışlar getirebilecek virülans ile ilgili çeşitli hedeflerin ve tedavilerin karakterize edilmesinde kullanılabilir.Ayrıca kutanöz leishmaniasis neden diğer fare suşları ve Leishmania türlerine uygulanabilir. Bu teşp, farelerle rahat çalışan ve bulaşıcı materyale kazara maruz kalmamak için subplantar enjeksiyonları gerçekleştirme deneyimine sahip eğitimli personel gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Prosedürü gösteren Dr.Ricardo Zampieri, laboratuvarımdan bir teknisyen.25 santimetre kare hücre kültürü şişesinde L.amazonensis promastigotes büyüterek başlayın, pro-orta 10 mililitre içeren, 25 santigrat derece üç gün boyunca. Kuluçkadan sonra, pipet logaritmik büyüme fazı promastigot e-kültür yeni bir şişe içine beş mililitre. Şişeye beş mililitre ama-orta ekleyin ve 34 santigrat derecede 3-4 gün kuluçkaya yatırın.Yeni bir şişede taze ama-ort

in-vivo-infection-with-leishmania-amazonensis-to-evaluate-parasite

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Intradermal enjeksiyonu ile kutanöz leishmaniasis için deneysel Hamster model...

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

Bu video, makrofajları metasiklik promastigotlarla tedavi ederek Leishmania'nın virülansını araştırır ve bu da hücre içi amastigotların oluşumuyla sonuçlanır. Leishmania'nın virülansının doğrulanması, nükleik asit floresan boya boyası ile elde edilir. Bu içgörü, leishmaniasis için yeni tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Kültürlenmiş Makrofajlarda Leishmania Virülansının Değerlendirilmesi

Bu video, kemik iliği kaynaklı makrofajlardaki (BMM'ler) parazitlerin hücre içi büyümesini ölçmek için bir testi göstermektedir. Makrofaj hücreleri, sırasıyla Leishmania'nın motil ve non-motil invaziv evreleri, metasiklik promastigotlar ve amastigotlar ile enfekte olur. Parazitler makrofajları istila eder, parazitoforöz bir vakuol içinde içselleşir ve içinde çoğalır. Hücre içi parazit büyümesi, makrofaj ve parazit çekirdeklerinin floresan olarak boyanması üzerine bir mikroskop kullanılarak...

Makrofajlarda Parazitin Hücre İçi Büyümesini Ölçmek için Bir İn Vitro Test

Bu makale, görüntü elde etme ve analiz için özel bir metodoloji ile birlikte intravital mikroskopi görüntüleme kullanılarak fare karaciğer damar sisteminin tek tek kan damarları içindeki kan akış hızının dinamik ölçümü ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir yöntem hakkında ayrıntılı bir yöntem hakkında rapor vermektedir.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.

In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi

Strongyloides ratti , laboratuvar farelerinde geçici enfeksiyonlara neden olan, doku göçü ve bağırsak yaşam evrelerini gösteren parazitik bir nematoddur. Burada, sıçanlarda parazit döngüsünün sürdürülmesi ve kafa, akciğer ve bağırsakta parazit miktar tayini dahil olmak üzere farelerin deneysel enfeksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Farelerin Parazitik Nematod Strongyloides ratti ile Deneysel Enfeksiyonu

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm...

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Öğrenin farelerde Leishmania amazonensis ile kutanöz leishmaniasis enfeksiyonunu değerlendirme yöntemini. Bu protokol, konak inflamatuar yanıtı ve parazit replikasyonunu eşzamanlı analiz ederek virülans çalışmalarına sistemik bakış sağlar.

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Daha fazla video keşfet