Name: Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Keşfedin, Thermotoga maritima membran bağlı pirofosfataz inhibitörlerini taramak için maliyet etkin ve kararlı bir yöntem. Bu protokol, parazit hastalıklarının tedavisinde yeni bileşikler keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı ve BBSRC (BB/M021610) adrian Goldman hibe tarafından desteklenmiştir, Finlandiya Akademisi (No. 308105) Keni Vidilaseris, (No. 310297) Henri Xhaard ve (No. 265481) Jari Yli-Kauhaluoma ve Helsinki Üniversitesi Araştırma Fonları Gustav Boije af Gennäs için. Yazarlar bernadette Gehl'e proje sırasında ki teknik yardımları için teşekkür eder.

1. Protein hazırlama
NOT: TmPPase'nin ifadesi ve arınması başka bir yerde13olarak tanımlanmıştır.
<ol><li>20 mM 2-(N-morfolino)etanesulfonik asit (MES) pH 6.5, %3.5 (v/v) gliserol, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve %0.05 dodecyl maltoside (DDM) içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mL'sini hazırlayın.</li>
	<li>200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl ve 67 mM NaCl içeren reaksiyon karışımının 10 mL'sini hazırlayın. NOT: Mg2+ mPPPAz substrat olarak pirofosfat chelate gereklidir, K+ TmPPase potasyum bağımlı mPPase olduğu gibi enzim aktivitesini artırmak için gereklidir, ve Na+ TmPPase tarafından sodyum iyon translokasyonu sırasında enzim aktivitesi için gereklidir.</li>
	<li>Enzim reaktivasyonu için 30 mg/mL lipozom hazırlayın.<ol>
<li>10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 ile 1 mM DTT ile 0.3 g L-α-fosfatidilkolin in 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8.0 1 mM DTT ile ekleyin.</li>
		<li>Lipozom'u buza koyun ve 1 dakika boyunca 1 saniyelik darbe aralığıyla sonicate edin, 1 dakika duraklayın ve çözelti saydam sarı olana kadar tekrarlayın.</li>
		<li>Aliquot lipozomlar, sıvı nitrojen dondurun ve kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enzimi yeniden çalıştırın.<ol>
<li>Lipozom çözeltisinin 40 μL'sini DDM'nin 22,5 μL'si ile karıştırın.</li>
		<li>Karışımı 55 °C'de 15 dk ısıtın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Reaktivasyon tampon çözeltisinin 36.5 μL'sini ekleyin, karıştırın ve toplam 0.13 mg/mL konsantrasyon yapmak için 1 μL konsantre protein (13 mg/mL) ekleyin. NOT: Protein genellikle saflaştırma dan sonra 10 μL aliquots dondurulur ve kullanmadan önce buz üzerinde çözülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yeniden aktive edilen enzimin 20 μL'sini alın ve reaksiyon karışımının 1.480°L'sine ekleyin, sonra hafifçe karıştırın. NOT: Reaksiyon karışımına yeniden aktive edilen enzimin eklenmesi kullanılmadan hemen önce yapılmalıdır.</li>
</ol>2. Bileşik hazırlama
<ol><li>Bileşiklerin kullanılabilirliğine bağlı olarak 25−100 mM'lik stok çözeltilerini 50−200 μL'de yapmak için bileşikleri dimetil sülfoksit (DMSO) olarak çözün. NOT: Burada kullanılan tüm bileşikler(Şekil 2A) daha önce 9 olarak yayınlanmıştır. Bileşik çözünürlük düşükse, stok konsantrasyonu buna göre ayarlanabilir.</li>
	<li>Suda her bileşiğin üç farklı konsantrasyonları hazırlayın. NOT: Reaksiyon karışımındaki son konsantrasyonlar sırasıyla 1, 5 ve 50 mikromolar veya 1, 5 ve 20 mikromolar olacaktır.<ol>
<li>Çözünen bileşikler için 2 μM, 10 μM ve 100 μM veya alternatif olarak 2 μM, 10 μM ve 40 μM'yi az çözünen bileşikler için vermek için stok çözeltisini mikrotüplerde 1 mL'ye kadar suile seyreltin.</li>
		<li>Uygun karıştırma için stok çözeltisi seyreltilmesinden sonra anında bileşik çözelti girdap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nephelometre kullanarak bileşik toplama olup olmadığını kontrol edin. NOT: Bu üç konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) triplicate olarak incelendi ve 96 kuyu plakasında boşa normalleştirildi.<ol>
<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyon karışımının 75°L'sini her kuyuya dağıtın.</li>
		<li>Her bileşiğin 75 μL'sini ekleyin (boş için, bunun yerine 75°L su kullanın) ve 5×'lik yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.</li>
		<li>Mikroplaka nephelometre kullanarak her kuyu300 V'de ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Asayi hazirlama için reaktifler
<ol><li>Arsenit-sitrat çözeltisini hazırlayın.<ol>
<li>Tartmak 5 g sodyum arsenit ve trisodyum sitrat dihidrat 5 g. DİkKAT: Sodyum arsenit toksiktir, bu nedenle uygun koruyucu ekipman kullanın ve özel bir özenle saplanır. Önlem olarak, gerekli tüm güvenlik önlemleri okunmadan ve anlaşılmadan işlemeyin. Bileşiğin veya çözeltisinin tozunu/buharını teneffüs etmemek için sadece bir duman kaputunda teşrinverin. Solunduğunda, temiz havaya geçin ve tıbbi yardım alın. Yutma ve göz/cilt temasından kaçınmak için uygun kimyasal güvenlik gözlüğü, koruyucu eldiven ve giysi takın. Yutulursa, hemen bir zehir merkezi veya doktor /doktor arayın. Deriye veya göze girerse, bol su yla yıkayın ve tıbbi yardım alın.</li>
		<li>100 mL suya çözün.</li>
		<li>5 mL buzul asetik asit ekleyin, karıştırın ve 250 mL su ekleyin.</li>
		<li>Işıktan korunan oda sıcaklığında saklayın. NOT: Çözüm bir yıldan uzun süredir stabildir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A çözeltisi ve B çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>A çözeltisi için, 0,5 M HCl ile 0,3 g askorbik asit için 10 mL buz soğuk ekleyin. Girdap ederek askorbik asidi çözün.</li>
		<li>B çözeltisi için, 70 mg amonyum heptamolybdate tetrahidrat ve girdap çözünmek için buz soğuk su 1 mL ekleyin. NOT: Her iki çözümü de kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Sonuç sonuçlarının tutarlılığı için, her iki çözüm de en fazla bir hafta boyunca buzda saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrasyon için 0 μM, 62,5 μM, 250 μM ve 500 μM konsantrasyonu ile fosfat (Pi)standardını hazırlayın.<ol>
<li>Reaksiyon karışımının 370 μL'sini içeren dört mikrotüpe 0 μL, 25 μL, 50 μL ve 100 μL 5 mM Na2HPO4 dihidrat ekleyin.</li>
		<li>1 mL'ye kadar su ile toplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bir 96 kuyu plakası için faaliyet telbettei
NOT: Tişin şematik iş akışı için Şekil 1'e bakınız.
<ol><li>1 mL b çözeltisi ekleyin 10 mL çözelti A, girdap ile karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın. NOT: Bu çözüm saydam ve sarı olmalıdır. A + B çözeltisini kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca buzüzerinde tutun. Ancak, uzun süreli depolama sonra kötü gidecek gibi 3 saat içinde çözüm kullanın.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak trikifat taki tüp şeritlere 40 μL 0 μM, 62,5 mM, 250 μM ve 500 μM Pi standardı ekleyin. NOT:P olmayan reaksiyon karışımı boş olarak kullanılacaktır.</li>
	<li>Çok kanallı pipet kullanarak tüp şeritlere 25 μL bileşik çözelti ekleyin. NOT: Her bileşiğin triplicate üç farklı konsantrasyonu olan yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50)ilk tahmini için yeterlidir. Daha doğru bir IC50 tayini için sekiz farklı bileşik konsantrasyonu kullanılabilir. Sınır tanımayan enzim için bileşik çözelti eşit miktarda su ile değiştirilir. Pozitif kontroller olarak 2.5 μM, 25 μM ve 250 μM imidodiphosphate (IDP) sodyum tuzu kullanıldı.</li>
	<li>Çok kanallı pipet kullanarak tüp şeritlere (Pi standardı içeren tüpler hariç) 15 μL mPPase çözeltikarışımı ekleyin.</li>
	<li>Boru şeritlerini yapışkan sızdırmazlık levhasıyla kapatın. Her tüp şerit ayırmak için sızdırmazlık levha kesin.</li>
	<li>Numuneleri 71 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın. Sonraki adımlarda zaman tüketimini en aza indirmek için numuneleri her şerit arasında 20 s aralığı olan ısıtma bloğuna yerleştirin.</li>
	<li>Her şerit için yapışkan sızdırmazlığı açın. Çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL 2 mM sodyum pirofosfat dibasic ekleyin ve 5× için yukarı ve aşağı boru ile karıştırın. Aynı sızdırmazlığı kullanarak tüp şeridini tekrar kapatın. NOT: Bu adımı başlangıçta 20 s gerçekleştirmek zor olabilir; ancak, bazı tahliller sonra daha kolay olacaktır.</li>
	<li>71 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneleri her şerit arasında 20 s aralığı olan soğutma aparatı üzerine yerleştirin. Onları 10 dakika soğutun ama kısa bir süre soğutma 5 dakika sonra her şerit santrifüj, sızdırmazlık levha altında su damlaları decant, sonra soğutma aparatı geri koymak ve sızdırmazlık kaldırın. NOT: Soğutma aparatı, su yla doldurulmuş ve en az 1 saat dondurulmuş polistiren Petri kabına (boyut 150 mm × 15 mm) 96 iyi PCR plaka yerleştirilerek yapılabilir. Cihaz, tayın başlamasından yaklaşık 5 dakika önce dondurucudan çıkarılmalıdır. Reaksiyon karışımını donduracak ve renk gelişimini engelleyecek şekilde numune soğutmadan hemen önce soğutma aparatı çıkarmayın.</li>
	<li>10 dk soğuduktan sonra 60 μL çözelti A + B ekleyin, 5× için yukarı ve aşağı borular karıştırarak karıştırın ve 10 dakika boyunca soğutma aparatı üzerinde tüp şeritler tutun.</li>
	<li>Arsenit-sitrat çözeltisinin 90 μL'sini ekleyin ve sabit bir mavi renk üretmek için en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun. DİkKAT: Toksisitesi nedeniyle sodyum arsenit içeren tüm çözeltiler her zaman ekstra özenle kullanılmalıdır. Bu nedenle, arsenit-sitrat çözeltisi ilavesi bir duman başlık yapılmalıdır.</li>
	<li>Her reaksiyon karışımından 180 μL'yi 96 kuyu polistiren mikroplakaya dağıtın.</li>
	<li>Mikroplaka spektrofotometre kullanarak her kuyunun emiciliğini 860 nm olarak ölçün.</li>
</ol>5. Sonuç analizi
<ol><li>Her numunenin ve Pi standartlarının ortalama triplicates'i. Ardından arka plan sinyalini ortadan kaldırmak için boş ile çıkarın.</li>
	<li>Pi standardı (nmol) miktarına göre emicilik (A860)değerlerini çizerek bir kalibrasyon eğrisi yapın ve aşağıdaki formülü kullanarak eğilim çizgisi işlevini elde etmek için doğrusal bir regresyon gerçekleştirin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>Yukarıdaki doğrusal regresyon formülüne göre enzimatik reaksiyondan salınan fosfat miktarını (nmol) hesaplayın.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak belirli etkinliği hesaplama: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> nPi reaksiyondan salınan fosfat miktarı (nmol), t reaksiyon süresidir (min) ve mTmPPPase ise, istiyatuarında (mg) kullanılan saf TmPPPPaz miktarıdır.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak her inhibitör konsantrasyonu için yüzde aktivitesini hesaplayın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> saiinhibitör ve SAun ile bir örnek özel aktivite s sınır tanımayan numunenin özgül aktivitesidir.</li>
	<li>LogIC50 (tahmin) ve IC50 (tahmin) aşağıdaki formülü kullanarak dört parametredoz-yanıt eğrisi bir doğrusal olmayan regresyon uygun hesaplayın: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> X'in konsantrasyon kütüğü olduğu (μM), Y aktivite (%), Üst ve Alt y ile aynı birimdeki platolardır (%sırasıyla 0 ve %0), logIC50 X ile aynı log birimlerine sahiptir ve HillSlope = eğim faktörü veya birbiri olmayan tepe eğimi. NOT: Montaj için yazılım(Malzeme Tablosu)kullanılır. Sıfırloarithm tanımlı olmadığı gibi inhibitör olmadan örnek için 0,01 μM (0,00 μM yerine) konsantrasyonu kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada Vidilaseris ve ark14dayalı bir 96 iyi plaka formatında T. maritima membran bağlı pirofosfatse için inhibitörleri basit tarama için ayrıntılı bir protokol rapor . Bu protokol ucuz dur ve asidik koşullarda ortofosfat ve molybdate oluşan ve farklı bir mavi renk 12 ile fosfathomolybdenum türlerine indirgenmiş12fosfathomolybdic asit, dayanmaktadır. Bu yöntem diğer protokoller üzerinde tercih edilir, daha hassas malakit yeşil test16gibi , B...

Toplam hücresel proteinlerin yaklaşık %25'i membran proteinleridir ve bunların yaklaşık %60'ı ilaç hedefleri1,2'dir. Potansiyel ilaç hedeflerinden biri3, membrana bağlı pirofosfatlar (mPPases), iki ortofosfat içine pirofosfat hidrolizi ile membran boyunca proton ve / veya sodyum iyon pompa dimerik enzimlervardır 4. mPPases çeşitli organizmalarda bulunabilir5 bakteri gibi, arke, bitkiler, ve protist parazitler, insanlar ve hayvanlar hariç4. Protist parazitlerde, örneğin Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii ve Trypanosoma brucei, mPPases parazit virülans için gerekli 6 ve parazitlerde bu ifadenin nakavt dış temel pH maruz kalma sırasında hücre içi pH bakımında başarısızlığa yol açar7. Omurgalılarda homolog protein ve önemi nedeniyle, mPPases protistal hastalıklar için potansiyel ilaç hedefleri olarak kabul edilebilir3.
Bu çalışmada mPPase inhibitörlerinin in vitro taraması TmPPase model sistemine dayanmaktadır. TmPPase, T. maritima'dan gelen sodyum iyon pompalama ve potasyum iyne bağımlı mPPase olup 71 °C8'deoptimum aktiviteye sahiptir. Bu enzimin faydaları örneğin üretim ve arınma kolaylığı, iyi termal stabilite ve yüksek özgül aktivite vardır. TmPPase pozisyon tam koruma yanı sıra protist mPPases3,9 ve Vigna radiata10 mPPase çözülmüş yapısına tüm katalitik artıkların kimliğini yanı sıra yüksek benzerlik gösterir. Farklı konformasyonlarda TmPPase mevcut yapıları da yapı tabanlı uyuşturucu tasarım deneyi için yararlıdır (sanal tarama ve de novo tasarım olarak).
Burada TmPPase inhibitörlerinin 96 kuyu plaka biçiminde taranması için ayrıntılı bir protokol sunarız (Şekil 1). Protokol ilk Fiske ve Subbarow11tarafından geliştirilen mobibdenum mavi reaksiyon, kolorimetrik yöntemine dayanmaktadır. Bu yöntem, ortofosfat ve molybdate asidik koşullar altında 12 fosfathomolybdic asit oluşumunu içerir, daha sonra karakteristik mavi renkli fosfathomolybdenum türleri vermek için azalır12.

<table><tbody><tr><td>Yapışkanlı sızdırmazlık levhası</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum heptamolibdat tetrahidrat</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Çok Çanaklı</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>8 oyuklu PCR Tüp Şeritleri 0.2 ml kapaksız (120)</td><td>Nippon genetiği</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>Dodesil maltozit (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>İmidoidifosfat sodyum tuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Soya fasulyesi lesitininden fosfatidil kolin</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>Çok Plakalı 96 Kuyulu PCR Plakaları</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Tırmanış (Tip 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistiren Petri kabı (boyut 150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 yazılımı</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 Isıtma bloğu</td><td>Hibe Aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum meta-arsenit</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Pi)</td> <td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pirofosfat dibazik</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trisodyum sitrat dihidrat</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

thermotoga maritima membran bağlı pirofosfataz inhibitörleri için tarama

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Membrana bağlı pirofosfatazlar (mPPases) bakterilerde, arkelerde, bitkilerde ve protist parazitlerde oluşan dimerik enzimlerdir. Bu proteinler pirofosfatı iki ortofosfat molekülüne ayırırlar, bu moleküller proton ve/veya sodyum iyonile birleştiğinde membran boyunca pompalanırlar. Hayvanlarda ve insanlarda homolog protein oluşmadığından, mPPP'ler potansiyel ilaç hedeflerinin tasarımında iyi adaylardır. Burada 96 kuyu plaka sisteminde mobibdenmavi reaksiyon kullanan mPPase inhibitörleri için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Termofilik bakteri Thermotoga maritima (TmPPase) mPPase'yi model enzim olarak kullanıyoruz. Bu protokol basit ve ucuzdur ve tutarlı ve sağlam bir sonuç verir. Testin başlangıcından emici ölçüme kadar etkinlik test protokolünü tamamlamak sadece bir saat sürer. Bu çıktıda üretilen mavi renk uzun bir süre için kararlı olduğundan, sonraki tsay(lar) önceki toplu işlemden hemen sonra gerçekleştirilebilir ve emicilik daha sonra tüm gruplar için aynı anda ölçülebilir. Bu protokolün dezavantajı, elle yapılır ve böylece yorucu yanı sıra pipetting ve zaman tutma iyi beceriler gerektirir olabilir. Ayrıca, bu istihda kullanılan arsenit-sitrat çözeltisi sodyum arsenit içerir, toksik ve gerekli önlemler ile ele alınmalıdır.

Bu protokolde, pirofosfatazların ortak inhibitörü olan IDP ile birlikte sekiz bileşik (Şekil2A)pozitif kontrol olarak test edildi. Her bileşik üç farklı konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) trilikat olarak test edildi. Taramanın iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir , numune ve reaktif hazırlığından başlayarak 860 nm'de emici ölçüme kadar.
Bu protokolün sonunda, Çözelti A + B ve arsenit-sitrat eklendikten sonra, çözeltiler gözlemlenebili...

Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Protokolümüz membranbağlı pirofosfatazın aktivitesini engelleyen bileşikleri bulmak için bir araç olarak çalışır. Ve bu inhibitörleri çeşitli parazit hastalıkların tedavisinde kullanılabilir. Bu protokol enzim reaktivasyonu için gerekli yüksek fosfolipid konsantrasyonu varlığında herhangi bir girişim göstermeden uzun bir süre için ucuz ve basit istikrarlı renk üreten.PH 6.5'te 20 milimolar M-E-S, hacim gliserol ile %3.5 hacim, iki milimolar D-T-T ve %0.05 D-D-M içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mililitresini hazırlayın. PH 8'de 200 milimolar tris hidroklorür içeren 10 mililitre reaksiyon karıştırıcıhazırlayın. Sekiz milimolar magnezyum klorür, 333 milibün potasyum klorür ve 67 milimolar sodyum klorür.Enzim reaktivasyonu için mililitre lipozom başına 30 miligram hazırlamak. İlk olarak, PH sekiz tris hidroklorür 20 milimolar 10 mililitre ekleyin, bir milimolar D-T-T ile 0.3 soya fasulyesi L alfa fosfatidilkolin gram. Bir dakika için bir saniye sonrası aralıklarla buz ve sonicate üzerinde lipozom koyun.Bir dakika duraklatın ve çözüm saydam sarı olana kadar tekrarlayın. Aliquot 100 mikrolitre lipozomlar, sıvı nitrojen dondurma kıvrak ve negatif 80 santigrat derece kullanılana kadar saklayın. Enzimi yeniden etkinleştirmek için lipozom solüsyonu oda sıcaklığında eritin.Lipozom çözeltisinin 40 mikrolitresini 22,5 mikrolitre 20%D-D-M ile karıştırın. Karışımı 55 derecede 15 dakika bekletin. Ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Ardından, yeniden etkinleştirme arabellek çözeltisinin 36,5 mikrolitresini ekleyin. Mix. Ve mililitre başına 0.13 miligram toplam konsantrasyon yapmak için konsantre protein bir mikrolitre ekleyin. Daha sonra, reaksiyon karışımının 1480 mikrolitresine yeniden aktive enzimin 20 mikrolitresini aktarın.Yavaşça karıştırın ve hemen kullanın. İlk olarak, 200 mikrolitre de 50 milimolar stok çözümleri yapmak için D-M-S-O bileşikleri çözün. Çözünür bileşikler için iki, 10 ve 100 mikromolar vermek için, mikro tüpler de bir mililitre su ile stok çözeltisi seyreltmek.Her seyreltme için, uygun karıştırma için bileşik çözelti girdap. Bundan sonra, bileşik ayrışma için kontrol edin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, 96-iyi plaka her kuyuiçine reaksiyon karışımı 75 mikrolitre dağıtmak. Trilicate kontrol olarak her bileşik ve su 75 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı beş kez pipetleme tarafından karıştırın.Bir mikroplaka nephelometre kullanarak 300 volt her iyi ölçün. Arsenit sitrat çözeltisi hazırlamak için, ağırlık beş gram sodyum arsenit ve trisodyum sitrat dihidrat beş gram, su 100 mililitre içine her iki bileşikleri çözün. Sonra, buzul asetik asit beş mililitre ekleyin.Karıştırın ve 250 mililitre su ekleyin, ışıktan korunan oda sıcaklığında saklayın. Daha sonra, askorbik asit 0,3 gram askorbik asit 10 milimetre buz soğuk 0,5 molar hidroklorik asit ekleyerek çözelti a. 70 miligram amonyum tetrathiomolybdate tetrahidrat ve çözünmek için girdap bir mililitre buz gibi su ekleyerek b çözeltisini hazırlayın.A ve B çözeltilerini buzüzerinde saklayın. Fosfat standardını kalibrasyon için sıfır, 62.5, 250 ve 500 mikromolar konsantrasyonu ile hazırlamak. Reaksiyon karışımının 370 mikrolitresini içeren dört mikro tüpe sıfır mikrolitre, 12,5 mikrolitre, 50 mikrolitre ve 100 mikrolitre 5 milimolar disodyum fosfat dihidrat ekleyin.Su ile bir mililitre kadar top. Şimdi 10 mililitre çözelti A'ya bir mililitre B çözeltisi ekleyin, elle karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tüp komut larına 40 mikrolitre sıfır, 62,5, 250 ve 500 mikromolar fosfat standardı ekleyin.Daha sonra 25 mikrolitre bileşik çözelti ve 15 mikrolitre M-P-P-A çözeltisi karışımı ekleyin. Fosfat standardı içeren tüpler hariç. Boru şeritlerini yapışkan sızdırmazlık levhasıyla kapatın.Her tüp şerit ayırmak için sızdırmazlık levha kesin. Sonra, numuneyi 71 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Her şerit arasında 20 saniye aralıklarla ısıtma bloğu üzerinde örnek yerleştirin.Her şerit için yapışkan sızdırmazlığı açın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, iki molar sodyum pirofosfat dibasic 100 mikrolitre ekleyin. Ve beş kez yukarı ve aşağı borular karıştırarak.Aynı sızdırmazlığı kullanarak tüp şeridini tekrar kapatın. Tekrar 71 derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, her şerit arasında 20 saniye lik aralıklarla numuneleri soğutma aparatı üzerine yerleştirin.Onları beş dakika soğumasını bekleyin ve sonra sızdırmazlık levha altında su damlaları decant için kısa bir süre her şerit santrifüj. Şerit geri soğutma aparatı koyun, sızdırmazlık çıkarın ve onları başka bir beş dakika soğumaya bırakın. Daha sonra 60 mikrolitre a ve b çözeltisi ekleyin, beş kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın ve soğutma cihazındaki tüp şeritlerini 10 dakika daha tutun.Bir duman kaputunda, arsenit sitrat çözeltisi 90 mikrolitre ekleyin ve en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun. Kararlı bir mavi renk üretmek için. Her reaksiyon karışımından 180 mikrolitreyi 96 kuyulu polistiren mikroplakaya dağıtın.860 nanometre de her kuyunun emiciliğini ölçmek için bir mikroplaka spektrofotometre kullanın. Bu protokolde, sekiz bileşikler i-D-P ile birlikte test edildi, pozitif kontrol olarak piro fosfataz ortak bir inhibitörü. Çözelti A ve B eklenmesinden sonra, ve arsenit sitrat, oda sıcaklığında kuluçka 30 dakika içinde mavi bir renk.İnhibe etmeyen bileşiklerin her üç konsantrasyonu da aynı mavi renk yoğunluğunu göstermiştir. E-1'den E-3'e kadar herhangi bir inhibitör olmadan. Her test bileşiğin konsantrasyonuna karşı enzimatik aktivitenin arsa, inhibisyon aktivitesi ile bileşik doğrusal olmayan bir eğri uydurma oluşturduğunu gösterir.Pozitif kontrol olarak I-D-P'nin çizimi, yüksek konsantrasyonlarda aktivitede bir azalma olduğunu açıkça göstermektedir. Bileşikler bir, beş, altı, yedi ve sekiz için inhibisyon eğrisi. Sırasıyla 1.7 mikromolar, 21.4 mikromolar, 58.8 mikromolar, 239.0 mikromolar ve 500'den fazla mikromolar olarak yarım maksimal inhibitör konsantrasyonları gösterir.Hazırlamayı unutmayın, M-P-P-A çözümü. Tayın başlamasından hemen önce.

screening-for-thermotoga-maritima-membrane-bound-pyrophosphatase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Kaynak: Vidilaseris, K., ve diğerleri. Thermotoga maritima Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin taranması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ortofosfat salınımını ölçerek bakteriyel membrana bağlı pirofosfataz (mPPaz) inhibitörlerini taramak için kolorimetrik bir tahlil göstermektedir. Yöntem, potansiyel bir antimikrobiyal ilaç hedefi olan Thermotoga maritima'dan mPPaz'ı inhibe eden bileşiklerin tanımlanmasını sağlar.

Kolorimetrik Bir Test Kullanılarak Bakteriyel Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin Taranması 

Mevcut rapor, Leishmania hücre ekstraktları kullanılarak fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivitesini ölçmek için in vitro enzimatik bir testi açıklamaktadır. Bu tahlil, bir radyoaktif metil grubunun S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden endojen fosfatidiletanolamin üzerine transferine dayanmaktadır.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Toll benzeri reseptör (TLR) sinyali birçok insan iltihaplı hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır ve biyoaktif nanoparçacıklar ile TLR yanıtlarının düzenlenmesinin pek çok iltihaplanma koşulunda faydalı olacağı öngörülmektedir. THP-1 hücre bazlı raportör hücreleri, TLR sinyallemesinin yeni inhibitörlerini tanımlamak için çok yönlü ve sağlam bir tarama platformu sağlar.

Toll benzeri Reseptör Sinyali Önleyicileri İçin Fagositik Bağışıklık Hücrelerinde Biyoaktif Nanopartiküllerin Taranması

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Bu protokol, protein sentezinin doğal ürün/küçük molekül inhibitörlerini belirlemek için optimize edilmiş bir florometrik tarama metodolojisi tanıtmaktadır. Pratikliği, hem ilaç keşif teknikleri lisans eğitimi için hem de tıbbi kimya kampanyalarında uygulanması için uygun hale getirir.

Doğal Kaynaklardan Protein Sentezi İnhibitörlerinin Ön Taraması için Flüoresans Tabanlı Protokol

Keşfedin, Thermotoga maritima membran bağlı pirofosfataz inhibitörlerini taramak için maliyet etkin ve kararlı bir yöntem. Bu protokol, parazit hastalıklarının tedavisinde yeni bileşikler keşfetmeye yardımcı olur.

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Daha fazla video keşfet