Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Bu yöntem nasıl yeni terapötik ajanlar veya stratejiler, etkisi veya pankreas kanseri sırasında sitotoksik T hücre yanıtı artırmak asses için kullanılabilir. Bu teknik tümörlerin hızla sindirilmesine ve in vitro uyarılmasına olanak sağlayarak, T hücre yanıtının birden fazla parametresinin aynı anda analiz edilmesine olanak tanır ve bu da diğer uygulamalara kolayca adapte edilebilir. Başlamak için, forceps kullanın, bir petri kabıüzerine tümör transfer.

Enzim aktivitesinin başlamasını önlemek için 50 mililitrelik bir tüpün üzerine beş mililitre sindirim ortamı saklayın. Petri kabındaki tümörü örtmek için bu çözeltiden küçük bir aliquot alın. Küçük parçalar halinde tümör kesmek için steril bir neşter ve forceps kullanın, uzunluğu yaklaşık üç milimetreden daha az.

Tümör parçalarını tüpe kazıyın ve tüm parçalar sindirim ortamına batırılana kadar tüpü nazikçe ters çevirin. Tüpü sindirmek için 37 derecede 20 dakika sallayarak bir cihaza aktarın. Tümörün tüm parçaları nın batırılmış olduğundan ve tüpün kenarına yapışmadığından emin olun.

Sindirim adımından hemen sonra, enzim aktivitesini yavaşlatmak için tüpü buza yerleştirin. 20 milimolar son konsantrasyonelde etmek için EDTA ekleyin ve kısa bir süre daha fazla enzim aktivitesini yavaşlatmak için karıştırmak için örnek girdap. Tüpü açın ve taze RPMI orta ile tüp kapağı kapalı herhangi bir tümör sindirmek durulayın.

Sonra 70 mikronsüz bir süzgeç hazırlayın, buz üzerinde 50 mililitrelik açık bir tüp üzerine yerleştirin. Önceden orta ile filtre ıslak. Sindirilmiş hücreleri yeniden askıya alın ve 25 mililitre veya daha büyük bir Stripette kullanarak tüpün kenarlarını yıkayın.

Stripette geniş açılış kalın sindirim kolayca geçmesine olanak sağlar. 25 mililitrelik Stripette kullanarak tüm sindirimi süzgeçe aktarın. Bir mililitrelik şırınga pistonkullanarak filtrenin üstündeki tümörü yukarı ve aşağı püre haline getirin.

Hücreleri sürekli olarak RPMI ile süzgeçten yıkayın. Hücreleri itmek için yeterli kuvvetle yıkamak için emin olun. Tüm hücreler süzgeçten geçene kadar yıkamaya devam edin.

Tüpü 5 dakika 300 kez G ve dört santigrat derecede santrifüj edin. Hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın ve RPMI'yi tamamlayın ve hücre dışı matrisleri veya yeterince askıya alınamayan büyük hücre kümelerini kaldırmak için doğrudan başka bir filtreden geçirin. Herhangi bir stimülasyon gerekiyorsa, hemen akış sitometri analizi için izole hücreleri leke, ya da 10% DMSO ve FBS dondurucu ortamda onları yeniden askıya ve eksi 80 santigrat derece saklayın.

Stimülasyon yapmak için önce hücreleri sayın. 100 mikrolitre başına altı iki kat on konsantrasyon elde etmek için tam ortamda hücreleri seyreltin. U dipli 96 kuyu plakasının her kuyusundaki 100 mikrolitre hücreyi kaplayın.

PMA 2X preparat içeren tam orta 100 mikrolitre ekleyin, ve Ionomycin. Plakayı 37 derecede bir kuvöze yerleştirin, ama %5 Karbondioksiti bir saat liğine. Daha sonra, Brefeldin A 10X hazırlık 20 mikrolitre, ve tam medya 1.06 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için, ve 2.0 mikromolar, sırasıyla.

Tabağı dört saat daha kuvöze geri koy. Pankreas içine 1000 TB32048 hücreleri enjekte ettikten sonra, ortotopik tümörler geliştirmek için yaklaşık 30 gün sürer. Hasat edilen ortopik tümörlerin sindirimi ve uyarılmasından sonra, arka plan floresanını belirlemek için floresan eksi bir tane yapıldı.

Ve Brefeldin A Monensin sadece kontrol sitokinlerin bazal üretimini belirlemek için yapıldı. Brefeldin A ve Monensin ile interferon-gama inkübasyonu için, FMO kontrolü üzerinde interferon gama hiçbir artış ile sonuçlandı, hem dalak ve tümör örneklerinde. Ancak, PMA ve iyonomisin eklenmesi, hem dalak ve tümör kaynaklı CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücrelerinde saptanabilir hücre içi interferon gama yüzdesi arttı.

Pozitif kontrol olarak kullanılan splenik CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücreleri tümöre infiltrasyon lu T hücre alt kümelerine göre nispeten daha yüksek interferon gama üretimine sahiptir. İmmünsupresyon gösteren tümör içinde oluşur. TNF alfa için aynı stratejiyi kullanarak, dalak CD4 pozitif T hücrelerinin yüksek yüzdesi hücre içi TNF alfa için pozitif tiyatuvardır.

Tümöre infiltrasyon sağlayan CD4 pozitif T hücreleriile karşılaştırıldığında. Splenik ve tümöre infiltrasyon sağlayan CD8 pozitif T hücreleri benzer düzeyde TNF alfa üretti. Tümörün yeterince doğrandığından ve tüm parçaların sindirim ortamına batırDığından emin olun.

Tümörü ezerken, nazik olduğunuzdan emin olun ve hücreleri iyice yıkayın. Tümör sindirim protokolü ek, fonksiyonel veya gen ekspresyonu analizi için bireysel bağışıklık hücresi alt kümeleri arındırmak için, akış destekli hücre sıralama ile kombine edilebilir. Biz B hücrelerinin pankreas kanseri sırasında bağışıklık yanıtı şekil nasıl karakterize etmek için bu yöntemi kullandık, Hem B hücre nakavt ve B hücre tükenmiş farelerde ortotopik tümörler üreten.