Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi
25 Temmuz 2020
Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.
Burada açıklanan protokol, in vivo kanser modellerini kullanarak tedavi etkinliğini test etmek için bir algoritma göstermeyi amaçlamaktadır. Protokol çeşitli tekniklerin bir kombinasyonundan oluşur. İnsan tümör örneklerinin tüm genom biyo-dizilimi genomik değişiklikleri tanımlamak için kullanılır.
Bunlar hem gen rearrangements hem de gen kopya numarası değişikliklerini içerir. Bu yüzden, potansiyel olarak uyuşturucu verilebilen değişiklikleri seçmek için tanımlanmış değişikliklerin analizi yapılır. Genomik analize dayalı olarak seçilen ilaçlar daha sonra immünazlarda yetişen ilgili tümörlerin in vivo tedavisinde kullanılır.
Geliştirilen algoritma kanser hastalarının bakımı için tedavi kararlarına yardımcı olmak için umut verici bir yaklaşım temsil eder. Hedeflenebilir değişiklikleri belirlemek için Panda aracını veya benzer bir yazılımı kullanın. Mikrosedikleme ile tanımlanan genleri standart kabul görmüş gen sembolleri kullanarak basit bir sekme olarak tanımlanan dosya olarak sıralayabiliriz.
Tablo üstbilgisinin yazılımın U yol seviyesine aktarıldığından emin olmak için listenin üstbilgisine pound işaretini ekleyin. İlgili gezinti sekmesine tıklayarak dosyayı yükleyin. Seçim simgesine tıklayarak ve sonra sonlandırma sekmesine tıklayarak temel verileri temsil edecek tek bir simge atayın.
Hasta dosyaları yüklendikten sonra, yol başına açıklamalı gen sayısını görüntüleyen bir sütunu tanımlamak için sayfayı önizleyin. Bu sağdaki son sütun. İlgi genleri içeren yollar ayarı için ana pencerenin sol üst kısmında bir yol filtresi kullanın.
Şans eseri beklenenden daha fazla gen açıklamalı olan yolları belirlemek için zenginleştirme sekmesinin altında bulunan bir işlev kullanın. Daha sonra bir sütun, fisher'ın tam testinden karşılık gelen p değerini gösteren ana tabloya eklenir. Ana pencerenin solundaki uygun simgeyi kontrol ederek önceden ayarlanmış ek açıklamalardan potansiyel ilaçlanabilir genleri görüntülemek için veritabanını seçin.
Görselleştirme için bir yol seçmek için, yol görüntüleyici sayfasında görüntülenen adını tıklatın. Her ek açıklama kümesini temsil eden simgeler ilişkili genin yanında görüntülenir. Patikadaki herhangi bir genin üzerine tıkladığınızda ilgili gen kartları sayfası açılır.
Daha fazla analiz için ilgi ve potansiyel ilaçlar için isabet açıklamalı genler gösterdi yolları seçin. Steril koşulları korumak için bir laminar akış kaputunda doku çalışması gerçekleştirin. Soğuk PBS veya rpmi, DMEM gibi antibiyotik içeren doku kültürü ortamı içeren bir çanak içinde tümör dokusu lay.
Bir patolog yardımıyla komşu normal ve nekrotik dokudan canlı tümör materyalini belirleyin ve izole edin. Bir patolog tarafından işaret nekrotik malzeme kaldırmak için steril çerte ve neşter kullanın. Deri altı engraftment gerçekleştirmek için, küçük parçalar halinde steril forceps, neşter veya cerrahi makas ile tümör dokusu kesilmiş, boyutu kabaca 2 x 2 x 2 milimetre.
Parçalanmış dokuyu buz üzerinde önceden soğutulmuş bir petri kabına aktarın. Parçalanmış doku ile çanak içine soğuk matrigel izin, doku 10 adet başına yaklaşık 200 mikrolitre. Iyice karıştırın ve doku parçaları 10 dakika matrigel emmek sağlar.
Bir farenin her iki yan üzerinde 5-10 milimetre dikey deri kesi yapmak için steril cerrahi makas ve forseps kullanın. Bir tümör parçası yağ yastığı nın altına yerleştirilecek kadar büyük bir cep oluşturmak için deri altı boşluğa yavaşça düz forseps yerleştirin. Beş farenin her birine önceden hazırlanmış cebine tümör parçaları yerleştirmek için steril düz forceps kullanın.
Doku tutkal kullanarak deri kesi kapatın. İmplantasyondan sonra, lenfosit proliferasyonunu inhibe etmek için, her fareye 100 mikrolitre ritukimab enjekte edin. Farenin arka derisini çimdikleyerek ve farenin baş ve dudakları hareketsiz hale getirilmiş olacak şekilde geriye doğru bükerek fareyi oral gavage için hazırlayın.
Gavaj sondasını farenin boğazının arkasına, sonda yemek borusuna ulaşana kadar yerleştirin. Sondanın çok uzağa yerleştirildiğinden emin olun çünkü farenin akciğerleri ölüme neden olabilir. Temsili genom şamandırası bir tümördeki genomik değişikliklerin manzarasını göstermektedir.
Yüksek dereceli serosubtip tümörler için tipik, birden fazla kazanım mavi çizgiler ve kayıplar kırmızı çizgiler, genomik instabilite yüksek düzeyde gösteren tespit edildi. OC101 tümöründe terapötik girişim için en önemli eğilim değişikliği, HER2 reseptörünü kodlayan bir gen olan ERBB2'yi içeren kromozom 17'de bir amplifikasyondu. DNA düzeyindesonuçları doğrulamak için, özel astar çeşitli setleri yükseltilmiş bölgenin kenarları için tasarlanmıştır.
Ve PCR gerçekleştirildi. Kontrol insan DNA'sı kullanıldığında hiçbir amplifikasyon ürünü absorbe edilemedi. OC101 tümör DNA'sı için spesifik bantlar saptandı.
Başka bir varyant tümör, T14, çok sayıda DNA kazanımları gözlendi. Bunlar arasında RICTOR genlerinde AKT2 de yer almıştır. Protein düzeyinde yapılan doğrulamada, immünolotlama kullanılarak RICTOR'da yüksek düzeyde AKT saptandı.
Altıncı hafta sonuna kadar kemoterapi tedavisi yapılan grupta tümör yükünde önemli bir azalma gözlendi. Kombinasyon tedavisi alan gruplarda tek başına kemoterapiye göre ekstra bir fayda vardı. Tedavi denemesi sonunda tedavi yanıtının moleküler analizi için tümör dokusu toplandı.
İmmünoblotting kullanılarak S6, AKT ve mTOR'un total ve fosforiile düzeyleri belirlendi. Tedavi edilmeyen, kemoterapi ile tedavi edilen ve AKT veya mTOR inhibitörü ile tedavi edilen bu proteinlerin düzeylerinin karşılaştırılması, son iki protein için belirgin bir azalma gösterdi. Sunulan yaklaşım PDX modellerinde klinik deney yapmak için çok yararlıdır.
Test için en iyi ilaç seçimini belirlemek için genomik profilleme ile elde edilen tümörün moleküler özelliklerinden yararlanır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, tümörlerin genomik yapısına dayalı hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için kullanılan bir algoritmayı göstermektedir. Protokol, yapısal DNA yeniden düzenlemelerinin tanımlanmasını ve ilaç yanıtı testleri için hasta tümörlerinin farelere nakledilmesini içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Onkoloji
- Genomik
- Farmakoloji
Arka Plan
- Hedefe yönelik tedaviler, genomik değişikliklere göre seçilir.
- DNA yeniden düzenlemelerinin anlaşılması, tedavi seçenekleri hakkında bilgi sağlayabilir.
- İlaç etkinliğinin test edilmesi için in vivo modeller temel öneme sahiptir.
- Tümör nakli için immün yetmezliği olan fareler kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Genomik analiz yoluyla seçilen ilaçların etkinliğini doğrulamak.
- Hedefe yönelik tedavilerin in vivo testi için bir protokol oluşturmak.
- Tümörlerin belirli tedavilere verdiği yanıtların anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan tümör örneklerinin tüm genom biyosekanslaması.
- Gen yeniden düzenlemeleri dahil olmak üzere genomik alterasyonların belirlenmesi.
- Analize dayalı olarak potansiyel olarak ilaçla hedeflenebilir değişikliklerin seçimi.
- İmmün yetmezliği olan farelerde tümörlerin in vivo tedavisi.
Ana Sonuçlar
- Yapısal DNA yeniden düzenlemelerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Seçilen ilaçların fare modellerinde doğrulanması.
- Genomik analize dayalı tedavi etkinliğinin gösterilmesi.
- Hedefe yönelik terapilere yanıt olarak tümör davranışına ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, hedefe yönelik tedavilerin test edilmesi için bir çerçeve sunmaktadır.
- Genomik analiz, etkili tedavilerin seçilmesi için kritik öneme sahiptir.
- İn vivo modeller, ilaç yanıtlarının anlaşılması için değerlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin, genomik profilleme rehberliğinde hasta kaynaklı ksenogreft modellerini kullanarak hedefe yönelik tedavileri değerlendirmelerine olanak tanıyarak, preklinik geliştirmede hipotez odaklı ilaç seçimini ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Yapısal DNA değişikliklerini fonksiyonel ilaç yanıtıyla ilişkilendirerek, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır ve kombinasyon terapileri için devam/durdur kararlarına temel oluşturur. Bu yaklaşım, özellikle standart tedavilerin başarısız olduğu ve endikasyon dışı ilaç kullanımının düşünüldüğü, yüksek genomik instabiliteye sahip tümörler için oldukça uygundur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gen amplifikasyonları ve yeniden düzenlemeler gibi yapısal DNA değişikliklerini ERBB2/HER2 ve AKT2 gibi ilaçla hedeflenebilir hedeflerle ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: PDX modelleri kullanarak in vivo fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler ve ön aday optimizasyonu öncesindeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Genomik öngörüler ile gözlemlenen tümör yanıtları arasındaki korelasyonu ortaya koyarak, hedef güvenilirliğine dayalı portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt akış taramalarında güvenilir bileşik değerlendirmesi için karakterize edilmiş genomik profillere sahip doğrulanmış biyolojik sistemler (PDX modelleri) hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tümör nakli ve tedavi protokollerini standartlaştırarak çalışmalar arasındaki tekrarlanabilirliği artırır ve ölçeklenebilir preklinik testlere olanak tanır.
- Analiz Hazırlığı: Yolak inhibisyonunu ve tedavi yanıtını değerlendirmek için immunoblotting yoluyla kantitatif moleküler okumalar (örneğin, fosforile S6, AKT, mTOR) üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastadan türetilmiş tümörleri kullanarak hastalıkla olan ilgiyi korur ve insan örneklerinden elde edilen genomik bulgular ile in vivo modeller arasında köprü kurar.
- Preklinik Validasyon: Tümör yükündeki azalmayı ve yola özgü ilaç etkilerini in vivo olarak göstererek risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen etkinliğin monoterapiye mi yoksa kombinasyon tedavisine mi bağlı olduğunu açıklığa kavuşturarak klinik çalışma tasarımına bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, genomik analizi in vivo etkinlik testiyle bütünleştirerek, veri odaklı bir şekilde preklinik gelişime geçişi mümkün kılmak amacıyla, keşif sürekliliğinde hedef belirleme ile öncü optimizasyon aşamaları arasına konumlandırılmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Yapısal olarak değiştirilmiş genlerin in vivo ortamda fonksiyonel olarak ilaçla hedeflenebilir olduğunu doğrulayarak hipotez testlerini ve yolak netleştirmeyi destekler.
- Tarama: Bilinen genomik sürücülere sahip, analize hazır PDX modelleri oluşturarak güvenilir bileşik taraması ve kombinasyon terapisi değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Ekiplerin ilaç etkilerini karşılaştırmasına ve hedef etkileşimini değerlendirmesine imkan veren kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (tümör yükü, protein fosforilasyonu) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hasta tümöründen preklinik modele kadar sürekliliği koruyarak biyobelirteç uyumunu ve klinik yanıtın öngörücü modellemesini destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı tümör tiplerinde hedefe yönelik tedavileri test etmek için yeniden kullanılabilir bir iş akışı oluşturarak mükerrer model geliştirmeyi azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: DNA düzeyindeki değişikliklerin in vivo fonksiyonel ilaç duyarlılığına dönüştüğünü doğrulayarak hedef validasyonundaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış doku işleme, engraftman ve ilaç uygulama protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: In vivo etkinliği kanıtlanmış hedeflere öncelik vererek sermaye verimliliğini artırır ve geç aşamadaki biyolojik riski azaltır.
- Portföy Etkisi: Genomik öngörü ile PDX yanıtı arasındaki uyuma dayalı olarak, ilaç adaylarının riske göre ayarlanmış önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Canlı tümör dokusunu doğru şekilde izole etmek ve genomik değişiklikleri yorumlamak için kanser genomiği, patoloji ve in vivo modelleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Yapısal değişiklik analizleri ve yolak zenginleştirme çalışmaları için yeni nesil sekanslama altyapısına ve biyoinformatik araçlara (örneğin Panda aracı) bağımlıdır.
- Tutunma başarısını sağlamak için steril tümör fragmantasyonu, Matrigel karıştırma ve subkütan engraftman için standardize prosedürler gereklidir.
- Farmakodinamik çıktıları olarak alt yolak modülasyonunu (örneğin AKT/mTOR/S6) değerlendirmek için immunoblotting kapasitesi gerektirir.
- PDX model oluşturma sürecinin zaman ve kaynak yoğunluğu nedeniyle sınırlıdır; bu durum, geniş ölçekli tarama kampanyaları için işlem hacmini kısıtlayabilir.
