Name: Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Keşfedin, bölünmüş luciferase assay sistemi kullanarak HBx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini nasıl belirleyebilirsiniz. Bu yöntem, HPV fonksiyonel tedavisi için yeni terapötik ajanların keşfedilmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Milli Eğitim Bakanlığı'nın hibe-in-Aid tarafından desteklenmiştir, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji, Japonya (#19H03430 ve #17K09405 M.O.'ya, #19J11829,#JP19fk0310102 #JP19fk021005 #18H05024,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Japonya Uygulamalı Enzymoloji Vakfı ve Kobayashi Kanser Araştırmaları Vakfı'ndan (M.O.'ya), GSK Japan Research Grant 2018 (K.S.'ye) ve Miyakawa Memorial Research Foundation'ın (K.S.)'den aldığı bir bağışla.

NOT: Bölünmüş luciferase tamsasının şematik gösterimi Şekil 1A'dagösterilmiştir ve isme işlemi Şekil 1B'deözetlenmiştir. Etkileşim dinamiği hücre lisisi olmadan gerçek zamanlı olarak ölçülebilir.
1. Hücre Hazırlama
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye Eagle'S orta (DMEM) % 10 v / v fetal sığır serum (FBS), 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kültürlü HEK293T hücreleri korumak 37 ° 20% O2 ve% 5 CO2.</li>
	<li>10 mL DMEM ile 100 mm'lik bir tabağa 5 x 106 hücre tohumu ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Aşağıdaki yönteme göre hücrelere bölünmüş luciferases ile HBx ve DDB1 geçici transfect 1 μg. NOT: Transzmid DNA'sının miktarı kullanılan transfeksiyon naibine bağlı olabilir. Hedef proteine kaynaşmış bölünmüş luciferasein optimal pozisyonu önceden belirlenmelidir. Bu durumda, HBx, C-terminus'ta LgBit'e (HBx-LgBit) ve DDB1'de DDB1'in N-terminus'unda (SmBit-DDB1) SmBit'e kaynaşmış olarak erimiş ve en iyi sonuçları (yani en parlak luciferase sinyalleri) sağlamıştır. Bu işlem daha önce ayrıntılı olarak bildirilmiştir7.<ol>
<li>DNA yoğuşma tamponunda(MalzemeTablosu)DNA plazmidini ifade eden 1 μg HBx-LgBit ve 1 μg SmBit-DDB1 toplam 300 μL hacmine seyreltin.</li>
		<li>16 μL arttırıcı çözelti(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 1 s girdap ile karıştırın.</li>
		<li>Numuneyi oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneye 60 μL transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 10 s girdap ile karıştırın.</li>
		<li>Numuneyi 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Kuluçka sırasında, çanak (adım 1.2 hazırlanan) kültür ortamı aspire ve fosfat tamponlu salin (PBS) 5 mL ile hücreleri yıkayın. Aspirasyon aspirasyon ile PBS kaldırın ve DMEM 7 mL ekleyin.</li>
		<li>Transfeksiyon komplekslerini içeren tüpe 3 mL DMEM ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve 10 cm çanak hücre üzerine transfection kompleksleri ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de bir kuvözde %5 CO2'nin altında 10 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Aşağıdaki yönteme göre 50 μL orta/iyi de 50 μL'lik hücrelerde hücreleri beyaz 96 kuyu plakasına yeniden yerleştirin.<ol>
<li>Harcanan hücre kültürünü orta çıkarın ve 5 mL PBS ile hücreleri yıkayın.</li>
		<li>Aspirasyon ile PBS'yi çıkarın, 1 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>4 mL DMEM ekleyin ve hücre tabakasının yüzeyine birkaç kez boru tutarak orta yıkın. Hücre süspansiyonuna bir tüp aktarın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g santrifüj hücreleri.</li>
		<li>Supernatant atın ve PBS 1 mL hücre pelet resuspend.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna 500 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj edin ve süpernatant atın.</li>
		<li>1.0 x 106 hücre/mL bir tohumlama yoğunluğuna% 10 FBS ile desteklenen tamponlu hücre kültür ortamı(Malzeme Tablosu)ile hücre pelet seyreltmek.</li>
		<li>Pipet 50 μL hücre süspansiyonu 96 kuyunun her kuyusu içine ve hücreleri kuvöze geri döndürün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 °C'de %5 CO2'nin altında 10 saat boyunca kuluçka yakan hücreler.</li>
</ol>2. Bileşik Tarama
<ol><li>Kuluçka sırasında, 13.5x konsantrasyonda tarama bileşiklerini(Malzeme Tablosu)ve çözücü (dimetil sülfoksit [DMSO]) seyreltin. Örneğin, stok 10 mM ve tarama konsantrasyonu 10 μM ise, 73,1 μL arabelleğe alsa 1 μL stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Her kuyuya 12,5 μL'lik parlak substrat(Malzeme Tablosu)ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Negatif kontroller olarak plakanın her iki ucundaki kuyular (yani, sütun 1 ve 12) parlak bir substrat içermemelidir.</li>
	<li>Bir luminometre(Malzeme Tablosu)kullanarak temel parlaklığı ölçün.</li>
	<li>İlk ölçümden hemen sonra, 5 μL bileşik ekleyin ve her kuyuya 2,1 adımda seyreltilmiş DMSO'yu kontrol edin. NOT: Son konsantrasyon 10 μM olacaktır.</li>
	<li>Luminesans değerlerini her 30 dk'da 2 saat ölçün. NOT: Plaka oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya yatırılmalıdır.</li>
	<li>Temel sinyallere normalleştirme den sonra kontrol DMSO tedavisi ile karşılaştırıldığında inhibitör etkileri hesaplayın. NOT: Her bileşiğin yinelenen veya üç leme halinde taranması varyasyonu azaltabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+B+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+pathogenesis%3A+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li>
<li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).</li>
<li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5%2F6+to+Enhance+HBV+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li>
<li>Decorsière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5%2F6+complex+as+a+host+restriction+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smc5%2F6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648(2017).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li>
<li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+Methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics.+2014%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li>
<li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li>
<li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomics%3A+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115(2014).</li>
<li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

HBx-DDB1 bağlayıcı inhibitörlerini bulmak için split luciferase tsay kullanarak uygun bir tarama yöntemi geliştirdik. Hücre lisisine gerek kalmadan canlı hücrelerde etkileşim dinamiği gerçek zamanlı olarak saptanabilir. HBx-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu Smc5/6'nın restorasyonuna yol açar, bu da viral transkripsiyon, protein ekspresyonu ve cccDNA üretiminin bastırılmasıyla sonuçlanır7. Antiviral eylem bu yeni mekanizma mevcut HBV tedavilerin yetersizlikleri üstesinden gelebilir.
<p class="jove...

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunudur, yıllık tahminlere göre 240 milyon kişi kronik HBV ile enfekte ve 90.000 ölüm enfeksiyon komplikasyonları nedeniyle, siroz ve hepatosellüler karsinom da dahil olmak üzere (HCC)1. Mevcut anti-HBV terapötik ajanlar, nükleos(t)ide analogları, yeterince viral ters transkripsiyon inhibe rağmen, nadiren viral proteinlerin ortadan kaldırılması elde, hangi uzun vadeli klinik hedeftir. Viral protein eliminasyonu üzerindeki kötü etkileri, hepatosit çekirdeğindeki epizomal viral kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA) minikromozomlarından viral transkripsiyon üzerinde doğrudan etki olmamasından kaynaklanmaktadır2.
HBV transkripsiyonu HBV düzenleyici X (HBx) protein3ile aktive edilir. Son çalışmalar HBx kromozomlar yapısal bakım bozunr ortaya 5/6 (Smc5/6), cccDNA HBV transkripsiyon blokları bir konak kısıtlama faktörü, bir DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligaz kompleksi kaçırma yoluyla4,5,6. Bu nedenle, cccDNA viral transkripsiyon teşvik önemli bir adım HBx-DDB1 etkileşimi olduğu düşünülmektedir. HBx ve DDB1 arasındaki bağlanmayı inhibe edebilen bileşikler viral transkripsiyonengelleyebilir, ve gerçekten nitazoxanide bizim laboratuvar da geliştirilen bir tarama sistemi ile HBx-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak tespit edilmiştir7.
Burada, hbx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini tanımlamak için kullanılan uygun tarama sistemimizi sıyoruz, bu da 7,8'likbölünmüş luciferase tamamlayıcıbirteşp. Split luciferase alt birimleri HBx ve DDB1'e kaynaştırılır ve HBx-DDB1 etkileşimi alt birimleri yakınbir yere getirerek parlak parlak bir sinyal üreten işlevsel bir enzim oluşturur. Alt birimler arasındaki etkileşim tersine çevrilebildiği için, bu sistem hbx-DDB1 proteinlerinin hızla ayrıştırıcı olduğunu algılayabilir(Şekil 1). Bu sistemi kullanarak, büyük bir bileşik kitaplığı kolayca taranabilir, hangi verimli HBx-DDB1 etkileşimini inhibe yeteneğine sahip yeni bileşiklerin keşfi neden olabilir.

<table><tbody><tr><td>Hücre kültürü mikroplakası, 96 kuyulu, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3176</td><td></td></tr><tr><td>Effectene transfeksiyon reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>DNA yoğunlaştırma tamponu, arttırıcı çözelti ve transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Nichirei</td> <td>içerir</td><td></td>175012</tr><tr><td>GloMax 96 mikroplaka luminometre</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>HBx&ndash; DNA plazmidini eksprese eden</td><td>LgBit Laboratuvarımız</td><td></td><td>İstek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI başlangıç sistemleri</td><td>Promega</td><td>N2015</td>, <td>Nano-Glo Canlı Hücre Reaktifi</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td> içerir <td>Makalede "tamponlu hücre kültürü ortamı" olarak tanımlanmıştır</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Screen-Well FDA onaylı ilaç kitaplığı V2 sürüm 1.0</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>BML-2841</td><td>Burada kullanılan bileşikler şu şekildedir: mekinol, merkaptopurin hidrat, mesna, mestranol, metaproterenol hemisülfat, metaraminol bitartrat, metaksol, metakolin klorür, metazolamid, metenamin hippurat, metokarbamol, metotreksat, metokssalen, metskopolamin bromür, metsoksijenid, metilclothiazid, metil aminolevulinat ve middot; HCl, metilergonovin maleat, metolazon, metirapon, meksiletin ve orta nokta; HCl, mikafungin, mikonazol, midodrin ve orta nokta; HCl, miglitol, milnasipran ve orta nokta; HCl, mirtazapin, mitotan, moeksipril ve orta nokta; HCl, mometazon furoat, mupirosin, nadolol, nafsilin ve orta nokta; Na, naftifine&middot; HCl, naratriptan ve orta nokta; HCl, natamisin, nebivolol ve orta nokta; HCl, nelarabin, nepafenak, nevirapin, niasin, nikotin, nilotinib, nilutamid, nitazoksanid, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidin, nortriptilin ve middot; HCl, olsalazin ve orta nokta; Na, orlistat, oksaprozin, oktripilin, oksibutinin Klorür, oksitetrasiklin ve orta nokta; HCl, paliperidon, palonosetron ve orta nokta; HCl, paromomisin sülfat, pazopanib ve middot; HCl, pemetreksed disodyum, pemirolast potasyum, penisilamin, penisilin G potasyum, pentamidin izetiyonat, pentostatin, perindopril erbumin, permetrin, perfenazin, fenelzin sülfat, fenilefrin, fitonadion, pimekrolimus, pitavastatin kalsiyum ve podofilox</td></tr><tr><td>SmBit&ndash; DDB1 eksprese eden DNA plazmidi</td><td>Laboratuvarımız</td><td></td><td>İstek üzerine temin edilir</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

bölünmüş luciferase assay sistemi kullanarak hbx-ddb1 etkileşiminin inhibitörlerinin belirlenmesi

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu için yeni terapötik ajanlara acil ihtiyaç vardır. Şu anda mevcut nükleos(t)ide analogları viral replikasyonu güçlü bir şekilde inhibe etseler de, viral kovalent olarak kapalı dairesel DNA'dan (cccDNA) transkripsiyonu yapılan viral proteinlerin ekspresyonu üzerinde doğrudan bir etkiye sahip değildirler. Yüksek viral antijen yükü bu kronik ve HBV ile ilişkili karsinogenezde rol oynayabileceğinden, HBV tedavisinin amacı viral proteinleri ortadan kaldırmaktır. HBV düzenleyici protein X (HBx) kromozomların yapısal bakımını bozacak şekilde konak DNA hasar bağlayıcı protein 1 (DDB1) proteinine bağlanır (Smc5/6), cccDNA'dan viral transkripsiyon aktivasyonu ile sonuçlanır. Burada, bölünmüş luciferase kompleman teşeleme sistemi kullanarak, HBx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini belirlemek için kapsamlı bir bileşik tarama sistemi salıyoruz. Protokolümüz, etkileşim dinamiklerinin canlı hücreler içinde gerçek zamanlı olarak kolayca algılanmasını sağlar. Bu teknik HBV enfeksiyonutedavisi için yeni terapötik ajanlar keşfetmek için önemli bir tetki olabilir.

Bu protokolün kullanımını izleyen temsili sonuçlar Şekil 2A,B'degösterilmiştir. Sinyal-arka plan oranı 80'den büyüktü ve Z' faktörü9 (yüksek işlem taraması için altın standart kalite endeksi) 0,5'ten büyüktü ve bu da bu test sisteminin yüksek işlem taraması için kabul edilebilir olduğunu gösteriyordu. Eşik olarak belirlenen &gt;40% inhibisyon kontrol ile karşılaştırıldığında (Sadece DMSO), biz bir aday ilaç olarak nita...

Burada, bölünmüş luciferase tsay sistemi kullanarak HBx-DDB1 etkileşimini inhibe eden anti-hepatit B viral ajanların taranması için bir yöntem salıyoruz. Bu sistem protein-protein etkileşimlerinin kolay algılanmasını sağlar ve bu etkileşimlerin inhibitörlerini belirlemek için uygundur.

Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

HBX-DDB1 etkileşimi cccDNA'dan HPV transkripsiyonuna teşvik etmek için çok önemli bir adımdır, bu nedenle bu protokol HPV fonksiyonel tedavisi için yeni terapötik ajanlar keşfetmek için önemli bir varlık haline gelebilir. Prosedürümüz basittir ve ekrana sadece kısa bir süre gerektirir. Karıştırdığım etkileşim hücre lisisi gerektirmeden gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir.Ayrıca, tarama kalitesi yüksek Z asal puanı ile tatmin edicidir. HBX-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu Smc5/6'nın restorasyonuna yol açar ve bu da HPV transkripsiyonunun, protein ekspresyonunun ve cccDNA üretiminin bastırılmasına neden olur. Antiviral eylemin bu yeni mekanizması mevcut HPV tedavilerinin yetersizliklerinin üstesinden gelebilir.Protein-protein etkileşimleri ilaç hedeflerinin önemli sınıfıdır. Burada açıklanan, viral ve hasS proteinleri arasındaki etkileşimleri hedefleyen split-luciferase bazlı asit, diğer bulaşıcı hastalıklar için tedavilergeliştirmek için yeni bir strateji sağlayabilir. Protokolümüz basit ve anlaşılması kolay olsa da, bazı adımları görsel gösteri olmadan çoğaltmak zor olabilir.Böylece, görsel gösteri bizim protokol anlamak için büyük bir yardımcı olacaktır. 5. HEK293T hücrelerini 10 mililitre DMEM ile 100 milimetrelik bir tabağa beş kez 10 tohumlayarak ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırarak başlayın. Ertesi gün, toplam 300 mikrolitre hacim için DNA plazmidleri ve DNA yoğuşma tamponunu ifade eden HBx-LgBit ve SmBit-DDB1'in her birini bir mikrogram seyreltin.Artırıcı çözelti 16 mikrolitre ekleyin ve bir saniye girdap tarafından tüpleri karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın, ardından 60 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın ve numuneyi sekiz dakika daha kuluçkaya yatırın.Bu arada, hücreleri ile çanak orta aspire ve PVS beş mililitre ile yıkayın. PVS aspire ve DMEM yedi mililitre ekleyin. Transfeksiyon kompleksleri ile tüpe üç mililitre DMEM ekleyin, pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ve hücrelere karışımı ekleyin.Sonra, hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın ve 10 saat boyunca %5 karbondioksit. Kuluçkadan sonra harcanan kültür ortamını çıkarın ve hücreleri beş mililitre PVS ile yıkayın. %0,25 tripsin EDTA'nın bir mililitresinde PVS'yi çıkarın ve hücreleri ayırmak için 37 derecede kuluçkaya yatırın.Daha sonra, dört mililitre DMEM ekleyin ve ortayı hücre tabakasının yüzeyine birkaç kez borulandırarak dağıtın ve süspansiyonu bir tüpe aktarın. Hücreleri 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatant'ı atın ve hücre peletini bir mililitre PVS'de yeniden askıya alın. Cetrifugation tekrarlayın ve supernatant atın.Daha sonra, mililitre başına bir milyon hücre bir tohumlama yoğunluğu% 10 FBS ile desteklenen tamponlu hücre kültürü orta ile hücre pelet yeniden askıya. Pipet, 96 kuyulu bir plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresi ve hücreleri 10 saat boyunca 37 derecelik kantine geri döndürün. Hücreler kuluçkaya yatarken, tarama bileşiklerini ve çözücüleri 13,5 X konsantrasyonuna seyreltin.Her kuyuya 12,5 mikrolitre parlak substrat ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bir luminometre ile temel parlaklığı ölçün ve bileşiklerin beş mikrolitre ekleyin ve hemen sonra her bir iyi DMSO kontrollü. İki saat boyunca her 30 dakikada bir parlaklık ölçün, ardından DMSO tedavisiile karşılaştırıldığında bileşiklerin inhibitör etkilerini hesaplayın.Temel parlaklık sinyalleri ölçüldü ve sinyal-arka plan oranı 80'den büyük olarak hesaplandı. Z asal 0,5'ten büyüktü ve bu da bu deneme sisteminin yüksek işlem li tarama için kabul edilebilir olduğunu gösteriyordu. DMSO sadece kontrolü ile karşılaştırıldığında% 40'tan fazla inhibisyonu için eşik ayarlayarak, nitazoxanide bir aday ilaç olarak tespit edildi.Daha önce bu yöntemle bir reaktivite küçük ölçekli bileşik kütüphane taranarak HBX-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak nitazoxanide tespit. Nitazoxanide kullanarak HBX-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu, viral transkripsiyonun azaltılması ve sonraki viral ürün düzeylerinin azaldığını doğruluzduk. Bir hedef proteine kaynaşmış bölünmüş luciferase optimal kısmı önceden belirlenmelidir.Bu durumda HPX, HPX'in C terminusu olan Large Bit'e ve DDB1'in son terminusunda Small Bit'e kaynaşmış olarak erimiş ve en iyi sonuçları vermiştir.

identifying-inhibitors-hbx-ddb1-interaction-using-split-luciferase

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

MicroRNA (miRNA'lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Bu video, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için bölünmüş lusiferaz tamamlama testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen proteinler, lusiferaz enziminin küçük ve büyük parçalarına etiketlenir. Proteinler etkileşime girdiğinde, büyük ve küçük fragmanlar, belirli bir substratın varlığında ölçülebilen parlak ışıldama açığa çıkaran aktif bir enzim kompleksi oluşturmak üzere birleşir.

Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Burada büyük tümör baskılayıcı (Latı) kinaz aktivitesinin ölçmek için bir luciferase tabanlı biyoalgılayıcı mevcut-Merkez kinaz yolu sinyal Hippo içinde. Bu biyoalgılayıcı temel ve translasyonel araştırma Hippo yol regülatörleri vitro ve in vivoaraştıran yönelik çeşitli uygulamalar vardır.

Hippo Luciferase tabanlı büyük tümör baskılayıcı (Latı) biyoalgılayıcı kullanarak yolu etkinliğini sinyal izleme

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Keşfedin, bölünmüş luciferase assay sistemi kullanarak HBx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini nasıl belirleyebilirsiniz. Bu yöntem, HPV fonksiyonel tedavisi için yeni terapötik ajanların keşfedilmesine yardımcı olur.

Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet