Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi
21 Aralık 2019
Burada, bölünmüş luciferase tsay sistemi kullanarak HBx-DDB1 etkileşimini inhibe eden anti-hepatit B viral ajanların taranması için bir yöntem salıyoruz. Bu sistem protein-protein etkileşimlerinin kolay algılanmasını sağlar ve bu etkileşimlerin inhibitörlerini belirlemek için uygundur.
HBX-DDB1 etkileşimi cccDNA'dan HPV transkripsiyonuna teşvik etmek için çok önemli bir adımdır, bu nedenle bu protokol HPV fonksiyonel tedavisi için yeni terapötik ajanlar keşfetmek için önemli bir varlık haline gelebilir. Prosedürümüz basittir ve ekrana sadece kısa bir süre gerektirir. Karıştırdığım etkileşim hücre lisisi gerektirmeden gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir.
Ayrıca, tarama kalitesi yüksek Z asal puanı ile tatmin edicidir. HBX-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu Smc5/6'nın restorasyonuna yol açar ve bu da HPV transkripsiyonunun, protein ekspresyonunun ve cccDNA üretiminin bastırılmasına neden olur. Antiviral eylemin bu yeni mekanizması mevcut HPV tedavilerinin yetersizliklerinin üstesinden gelebilir.
Protein-protein etkileşimleri ilaç hedeflerinin önemli sınıfıdır. Burada açıklanan, viral ve hasS proteinleri arasındaki etkileşimleri hedefleyen split-luciferase bazlı asit, diğer bulaşıcı hastalıklar için tedavilergeliştirmek için yeni bir strateji sağlayabilir. Protokolümüz basit ve anlaşılması kolay olsa da, bazı adımları görsel gösteri olmadan çoğaltmak zor olabilir.
Böylece, görsel gösteri bizim protokol anlamak için büyük bir yardımcı olacaktır. 5. HEK293T hücrelerini 10 mililitre DMEM ile 100 milimetrelik bir tabağa beş kez 10 tohumlayarak ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırarak başlayın. Ertesi gün, toplam 300 mikrolitre hacim için DNA plazmidleri ve DNA yoğuşma tamponunu ifade eden HBx-LgBit ve SmBit-DDB1'in her birini bir mikrogram seyreltin.
Artırıcı çözelti 16 mikrolitre ekleyin ve bir saniye girdap tarafından tüpleri karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın, ardından 60 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın ve numuneyi sekiz dakika daha kuluçkaya yatırın.
Bu arada, hücreleri ile çanak orta aspire ve PVS beş mililitre ile yıkayın. PVS aspire ve DMEM yedi mililitre ekleyin. Transfeksiyon kompleksleri ile tüpe üç mililitre DMEM ekleyin, pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ve hücrelere karışımı ekleyin.
Sonra, hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın ve 10 saat boyunca %5 karbondioksit. Kuluçkadan sonra harcanan kültür ortamını çıkarın ve hücreleri beş mililitre PVS ile yıkayın. %0,25 tripsin EDTA'nın bir mililitresinde PVS'yi çıkarın ve hücreleri ayırmak için 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, dört mililitre DMEM ekleyin ve ortayı hücre tabakasının yüzeyine birkaç kez borulandırarak dağıtın ve süspansiyonu bir tüpe aktarın. Hücreleri 500 kez G'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatant'ı atın ve hücre peletini bir mililitre PVS'de yeniden askıya alın. Cetrifugation tekrarlayın ve supernatant atın.
Daha sonra, mililitre başına bir milyon hücre bir tohumlama yoğunluğu% 10 FBS ile desteklenen tamponlu hücre kültürü orta ile hücre pelet yeniden askıya. Pipet, 96 kuyulu bir plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresi ve hücreleri 10 saat boyunca 37 derecelik kantine geri döndürün. Hücreler kuluçkaya yatarken, tarama bileşiklerini ve çözücüleri 13,5 X konsantrasyonuna seyreltin.
Her kuyuya 12,5 mikrolitre parlak substrat ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bir luminometre ile temel parlaklığı ölçün ve bileşiklerin beş mikrolitre ekleyin ve hemen sonra her bir iyi DMSO kontrollü. İki saat boyunca her 30 dakikada bir parlaklık ölçün, ardından DMSO tedavisiile karşılaştırıldığında bileşiklerin inhibitör etkilerini hesaplayın.
Temel parlaklık sinyalleri ölçüldü ve sinyal-arka plan oranı 80'den büyük olarak hesaplandı. Z asal 0,5'ten büyüktü ve bu da bu deneme sisteminin yüksek işlem li tarama için kabul edilebilir olduğunu gösteriyordu. DMSO sadece kontrolü ile karşılaştırıldığında% 40'tan fazla inhibisyonu için eşik ayarlayarak, nitazoxanide bir aday ilaç olarak tespit edildi.
Daha önce bu yöntemle bir reaktivite küçük ölçekli bileşik kütüphane taranarak HBX-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak nitazoxanide tespit. Nitazoxanide kullanarak HBX-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu, viral transkripsiyonun azaltılması ve sonraki viral ürün düzeylerinin azaldığını doğruluzduk. Bir hedef proteine kaynaşmış bölünmüş luciferase optimal kısmı önceden belirlenmelidir.
Bu durumda HPX, HPX'in C terminusu olan Large Bit'e ve DDB1'in son terminusunda Small Bit'e kaynaşmış olarak erimiş ve en iyi sonuçları vermiştir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, HBx-DDB1 etkileşimini inhibe eden anti-hepatitle B viral ajanları taramak için bir yöntem sunar ve bu, bölünmüş bir lüsifernaz tahlili sistemi kullanılarak yapılır. Protokol, hücre lizisi olmadan protein-protein etkileşimlerinin gerçek zamanlı tespitini sağlar ve bu da HPV fonksiyonel tedavi ajanlarının keşfini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Viroloji
- Farmakoloji
Arka Plan
- HBX-DDB1 etkileşimi, cccDNA'dan HPV transkripsiyonu için gereklidir.
- Mevcut HPV tedavilerinin bu yöntemle ele almayı amaçladığı yetersizlikleri vardır.
- HBX-DDB1 inhibisyonu yoluyla Smc5/6 restorasyonu HPV transkripsiyonunu baskılayabilir.
- Bölünmüş lüsifernaz tahlili sistemi, tarama kalitesi için yüksek bir Z prime skoru sağlar.
Çalışmanın Amacı
- HBX-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini tanımlamak için bir yöntem geliştirmek.
- HPV için yeni terapötik ajanların keşfini kolaylaştırmak.
- Antiviral araştırmalarda tarama verimliliğini ve kalitesini iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için bölünmüş lüsifernaz tahlili sistemi.
- Hücre lizisi olmadan etkileşimlerin gerçek zamanlı izlenmesi.
- Tarama kalitesi değerlendirmesi için Z prime skoru kullanımı.
- HBX-DDB1'i hedef alan antiviral mekanizmaların değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, HBX-DDB1 etkileşimini gerçek zamanlı olarak başarıyla tespit eder.
- HBX-DDB1 inhibisyonu, Smc5/6 restorasyonuna yol açar.
- HPV transkripsiyonu ve cccDNA üretiminin baskılandığı gözlendi.
- Yaklaşım, antiviral etki için yeni bir mekanizma sağlayabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, yeni HPV tedavilerini keşfetmek için umut verici bir yol sunar.
- HBX-DDB1'i hedef alarak mevcut tedavilerin sınırlamalarını ele alır.
- Bölünmüş lüsifernaz tahlilinin gelecekteki antiviral araştırmalar için değerli bir araç olduğunu göstermektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Targeting the HBx-DDB1 interaction addresses a critical mechanistic bottleneck in hepatitis B virus (HBV) drug discovery, enabling direct intervention at the level of viral protein expression. The split luciferase assay system provides real-time, quantitative readouts for inhibitor screening, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This platform strengthens portfolio triage by enabling high-throughput identification of compounds with novel antiviral mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the HBx-DDB1 protein-protein interaction central to HBV pathogenesis.
- Supports biological de-risking by linking inhibition to restoration of Smc5/6 and suppression of viral transcription.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through real-time, live-cell measurement.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, high Z prime assay suitable for high-throughput compound screening.
- Provides robust, quantitative luminescence outputs for reliable compound ranking.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening libraries against protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by targeting viral protein expression from cccDNA.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular inhibition to functional outcomes.
- Reduces translational risk by focusing on a mechanistically validated antiviral target.
Pipeline & Workflow Integration
This split luciferase assay system integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging target validation and high-throughput screening for HBV and potentially other viral targets.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of protein-protein interaction inhibitors in live cells.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility with high signal-to-background and Z prime metrics.
- Analytics: Generates quantitative inhibition data to compare compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Connects molecular inhibition to restoration of host restriction factors and suppression of viral transcription.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein-protein interaction targets in infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for HBV drug discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of novel antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds with unique mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-protein interaction assays and live-cell luminescence measurements.
- Needs access to cell culture, transfection reagents, and plate-based luminometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis for reproducibility.
- May require optimization of fusion protein constructs for different target pairs.
- Visual protocol demonstration aids reproducibility for complex assay steps.
