Name: Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Keşfedin, primer alveolar epitel hücrelerinde mRNA transkript kararlılığını incelemek için pipet elektroporasyonu ile indüklenebilir plazmid ekspresyon sisteminin kullanımını. Bu yöntem hücre fizyolojisini koruyarak transkripsiyon sonrası düzenlemeyi araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Francis Migneault Quebec Solunum Sağlığı Ağı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) akciğer eğitim programı, FRSQ'dan bir öğrencilik ve Faculté des Études Supérieures et'den bir öğrencilik tarafından sağlanan bir burs tarafından desteklendi. Doktora sonrası, Université de Montréal. Bu çalışma Gosselin-Lamarre Klinik Araştırma Başkanı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri [YBMOP-79544] tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine göre yürütülmüş ve Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Araştırma Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. İlgi genini ifade eden yanıt plazmidinin tasarımı ve üretimi (GOI)
<ol><li>pTRE-Tight gibi indüklenebilir bir tetrasiklin-off vektörü kullanın.</li>
	<li>GOI'da dahili olarak bulunmayan MCS'deki kısıtlama sitelerini tanımlamak için GOI'nin ve vektörün birden fazla klonlama alanının (MCS) dizisini analiz edin.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi erkek Sprague-Dawley sıçan akciğerlerinden primer alveoler epitel hücreleri izole19,20.</li>
	<li>Fenol/kloroform ekstraksiyonu veya silika bazlı RNA spin kolonları kullanımı gibi standart bir yöntem kullanarak alveoler epitel hücrelerinden gelen toplam RNA'yı Standart bir yöntemle RNA ekstraksiyonu ile arındırın.</li>
	<li>Oligo(dT) ve yüksek sadakatli ters transkriptaz kullanarak mRNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters yazınız.</li>
	<li>Yüksek sadakatli Taq polimeraz ve standart üst üste pcr tekniklerini kullanarak GOI'yi tasarlanmış astarlar kullanarak seçilen iki kısıtlama enzim tanıma alanı yla kuşatın.<ol>
<li>Ileri astar mRNA stabilitesine paralel olarak protein ekspresyonu çalışması için ifade düzeylerini artırmak için bir Kozak konsensus ribozom bağlama sitesi21 içerir. GOI'nin V5 epitopesini kodlayan bir dizi, transfected GOI'nin ekspresyonunu endojen ifadeden ayırt etmek için eklenmelidir (Tablo 1).</li>
		<li>Stop kodonundan sonra ters astarpoliadenilasyon sinyali içersin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mutantlar, goi 3' UTR'nin 3' ucunu yavaş yavaş silen bir poliadenilasyon sitesini kodlayan ters astarlar kullanarak farklı 3' UTR bölgelerinin GOI'nin mRNA'sının stabilitesi üzerindeki etkilerini incelemek için sıralı silme ile oluşturulabilir (Şekil 6). Alternatif olarak, PCR yönelimli mutagenez 3 'UTR22ilgi belirli bir bölgeyi hedeflemek için kullanılabilir.</li>
	<li>Indüklenen vektörü ve kesici uç, daha önce seçilmiş restriksiyon enzimleri ile 1 saat boyunca uygun kuluçka sıcaklığında sindirin, ardından kendi kendine ligasyondan kaçınmak için 30 dk vektör reaksiyonu sırasında fosfataz ile tedavi edin.</li>
	<li>Sindirilmiş vektörü ve kesici uçları elektroforez ile %1-1,5 agarose jel (kesici uç büyüklüğüne bağlı olarak konsantrasyon) ayırın.</li>
	<li>Bir bıçak ve UV ışığı kullanarak, istenilen kesici uç ve vektör içeren DNA parçalarını toplayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	<li>Bir silika tabanlı PCR arıtma kiti kullanarak agarose jel toplanan segmentleri arındırın ve 260 nm spektrofotometri ile konsantrasyonu ölçmek.</li>
	<li>GI ve T4 DNA ligaz ile indüklanabilir vektör bir vektör kullanarak ligate:ligasyon olasılığını artırmak için 1:3 insert molar oranı. Reaksiyonu oda sıcaklığında (RT) 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ligasyon reaksiyonunu yetkin E. coli'ye (DH5α) dönüştürün.<ol>
<li>100 μL'lik yetkin hücre içeren bir tüpe 1-10 ng vektör ve gen ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve 42 °C'de 45 s. Tüpü 2 dk buzüzerine yerleştirin ve 900 μL RT LB ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca 225 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Dönüştürülmüş bakterileri seçmek için lb agar plakasına uygun bir antibiyotikle (örneğin, pTRE-Tight vektörü için 100 μg/mL ampillin) reaksiyonun 100 μL'sini yayın. Plakayı bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bir aşılama döngüsü veya 20 μL ucu kullanarak tek tek kolonileri seçin ve sallayarak 37 °C uygun antibiyotik içeren 5 mL LB orta gecede kuluçka. Dönüştürülmüş bakteriler gliserol stoklarında -80 °C'de 400:600 LB orta gliserol oranında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plazmid DNA'sını silika bazlı plazmid kolonları kullanarak ayıklayın ve konsantrasyonu 260 nm'de spektrofotometri ile ölçün. GoI'nin restriksiyon analizi, oryantasyonu ve RT-PCR sırasında potansiyel olarak ortaya çıkan mutasyonların olmamasını sıralama ile onaylayın.</li>
</ol>2. İlgi genini ifade eden yanıt plazmidinin (GOI) primer alveoler epitel hücrelerine aktarılması
<ol><li>Sıçan akciğerlerinden tip II alveoler epitel hücrelerini izole edin.</li>
	<li>Hücreleri 100 mm Petri kaplarında 1 x 106 hücre/cm2 yoğunlukta, tam minimum gerekli ortam (komple MEM) ile tohumlayın. Komple MEM% 10 FBS, 0.08 mg / L tobramisin, Septra (3 μg / mL trimetoprim ve 17 μg / mL sulfamethoxazole), 0.2% NaHCO3,0.01 M HEPES (pH = 7.3) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmektedir. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 24 saat eve kültürlendirin.</li>
	<li>Ertesi gün, yeni bir 12 kuyu plakaher kuyuya antibiyotik olmadan tam MEM 500 μL yerleştirin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de plaka önceden ısıtın. Bu adımda, tetrasiklinleri kirletmeden veya inducibility müdahale etmek için çok düşük bir düzeyde fetal sığır serumu kullanmak önemlidir.</li>
	<li>Rt'de her kuyuda 1 μg GOI plazmid ve 1 μg düzenleyici vektör ekleyerek plazmid içeren 1,5 mL tüplerin indüklenebilir GOI (GOI plazmid) ve düzenleyici vektörü (örn. pTet-Off) hazırlayın. RNA bağlayıcı proteinler (RBP) ile birlikte ifade deneyleri için, 1 μg'lık kurucu vektör (örneğin, pcDNA3) RPB'yi ifade eden ve DNA karışımına eklenir (Şekil 7).</li>
	<li>Orta aspire ve yavaşça PBS ile hücreleri durulayın (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 37 °C önceden ısıtılır.</li>
	<li>37 °C'de önceden ısıtılmış %0,05 tripsin 5 mL ekleyin ve hücreler ayrılana kadar hücreleri kuluçkaya yatırın (2-4 dk). Antibiyotik olmadan tam MEM 10 mL ekleyerek tripsin nötralize.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın, Petri kabını 4 mL orta ile yıkayın ve mümkün olduğunca çok sayıda hücre toplayın ve hücre süspansiyonuna 5 dk boyunca 300 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Yavaşça aspire ve supernatant atın ve PBS 1 mL pelet resuspend. Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve hesaplay.</li>
	<li>Hücreleri 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı nazikçe aspire edin ve 4 x 107 hücre/mL konsantrasyonda resuspension tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Adım 2.4'te hazırlanan 1,5 mL'lik tüpün hücrelerini kuyu başına 400.000 hücre konsantrasyonunda ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.</li>
	<li>Tüpü elektroporasyon cihazına yerleştirin ve 3,5 mL elektrolitik tampon ile doldurun.</li>
	<li>Pistonun tamamına basarak bir pipete altın kaplama elektrot ucu yerleştirin. 1,5 mL'lik tüpün içeriğini hafifçe karıştırın ve pilleri pipetle dikkatlice aspire edin. Bu elektroporasyon sırasında elektrik arkneden ve azaltılmış transfeksiyon verimliliğiyol açacaktır gibi, ucu girmesini hava kabarcıkları önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>Bir tıklama sesi olana kadar pipeti elektroporasyon istasyonuna takın.</li>
	<li>1.450 V ve 2 0 ms genişliğinde 2 darbe gerilimine karşılık gelen alveoler epitel hücreleri için uygun elektroporasyon protokolünü seçin ve dokunmatik ekranda Başlat tuşuna basın.</li>
	<li>Transfeksiyondan hemen sonra pipeti çıkarın ve hücreleri önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış antibiyotik olmadan tam MEM ile dolu bir kuyuya aktarın.</li>
	<li>Kalan örnekler için 2.11-2.14 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri kuyu yüzeyine eşit olarak yaymak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. 2 gün sonra orta ortamı tam MEM ile antibiyotiklerle değiştirin.</li>
	<li>EGFP'nin ekspresyonunu floresan mikroskobu altında gözlemleyerek veya bir kontrol vektörü kullanarak akış sitometrisi ile transfeksiyonun başarısını doğrulayın(Şekil 1). NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve pcDNA3-EGFP gibi eGFP'yi ifade eden farklı bir plazmid kullanarak ek bir transfeksiyon adımı gerektirir.</li>
</ol>3. GOI transkripsiyon inhibisyonunun indüksiyonu
NOT: Hücreler, mRNA stabilitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için doksisiklin indüksiyonundan önce istenilen tedavilerle ön tedavi edilebilir (Şekil 5).
<ol><li>Deiyonize suda 1 mg/mL'lik doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini ışıktan korunan -20 °C'de saklayın. Tetrasiklin türevi olan Doksisiklin, tetrasiklin yerine kullanılır, çünkü tetrasiklinden daha uzun bir yarı ömüre (2x) sahiptir. Ayrıca, doksisiklin daha düşük bir konsantrasyon tet operon23tam inaktivasyonu için gereklidir. NOT: Doksisiklin endojen GOI mRNA ekspresyonunu etkileyebilir. Bunu doğrulamak için, doksisiklin ile 24 saattedavinin alveoler hücreler üzerindeki etkisi GOI ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmadığını doğrulamak için test edilmelidir(Şekil 2).</li>
	<li>Tam MEM 72 h posttransfeksiyon da taze 1 μg/mL doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>GOI'nin transkripsiyonuna inhibe etmek için orta yı kuyu başına 1 μg/mL doksisiklin içeren 1 mL tam MEM ile değiştirin.</li>
	<li>GOI'nin mRNA yarı ömrünü değerlendirmek için 15 dakika-6 saat arasında farklı süreler için 37 °C'de %5 CO2'de birden fazla kuyu kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tedavinin sonunda, hücreleri buz gibi PBS ile yıkayın ve iyi başına 500 μL tampon ekleyerek ve hücreleri homojenize etmek için plakasal sallayarak ticari olarak kullanılabilir fenol-kloroform RNA ekstraksiyon kiti ile lyse.</li>
	<li>Üreticinin protokolüne göre RNA'yı izole edin. 230, 260 ve 280 nm spektrofotometri ile RNA verimini ve saflığını belirleyin. Sırasıyla 1,8 ve 2,0 oranları 260:230 ve 260:280 olan RNA örnekleri saf kabul edilir. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>4. GOI'nin mRNA stabilitesinin belirlenmesi
<ol><li>Sonraki DNA amplifikasyonuna müdahale edebilecek plazmid DNA izlerini gidermek için toplam RNA'nın 1 μg'sini RNa içermeyen DNA I (amplifikasyon derecesi) ile tedavi edin.<ol>
<li>0,2 mL'lik bir PCR tüpünde, toplam 1 000 RNA, 1 0x DNase I reaksiyon arabelleği, 1 μL DNaase I (1 U/μL) ve RNAe içermeyen suyu birleştirerek toplam 10 μL'lik bir hacim elde edin.</li>
		<li>20 dakika RT'de reaksiyon uyguluyor.</li>
		<li>10 μL reaksiyon karışımına 1 μL 25 mM EDTA ekleyerek ve reaksiyonu 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırarak DNAse I'yi etkisiz hale getirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ters transkripsiyon verimliliğini artırmak için oligo(dT) ve rasgele hexamer astarların karışımı ile ticari olarak kullanılabilen bir cDNA sentez kiti kullanarak DNA'ya tükenmiş toplam RNA'yı cDNA'ya ters yazınız.<ol>
<li>Kısaca, 20 μL toplam reaksiyon hacmi elde etmek için DNA tükenmiş toplam RNA karışımının 11 μL'sine 4 μL 5x reaksiyon karışımı, 1 μL ters transkriptaz ve 4 μL RNa içermeyen su ekleyin.</li>
		<li>25 °C'de 5 dk, ardından 46 °C'de 20 dk reaksiyon uyguluyor ve 1 dk boyunca 95 °C'de kuluçkaya yatarak reaksiyonu inkübedin. Her reaksiyon 50 ng/μL cDNA ürünü verecektir.</li>
		<li>20 μL reaksiyon karışımına 180 μL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyerek cDNA reaksiyonunu 5 ng/μL konsantrasyonuna seyreltin. CDNA ürünlerini -80 °C'de saklayın veya hemen gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) yapmaya başlayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>GOI'ye özgü ileri ve geri qPCR astarları tasarla.<ol>
<li>Hücrelerdeki GOI'nin endojen ekspresyonu nedeniyle astarlar, GOI ile birleşen V5 epitopunun 100-150 bp amplicon'unu güçlendirecek şekilde tasarlanmalıdır (Tablo 1).</li>
		<li>Dahili referans gen astarları da normalleştirme kontrolleri olarak kullanılmalıdır. Genellikle beta-aktin ve hipoksantin fosforibosiltransferaz 1 genleri gibi temizlik genleri referans genler olarak kullanılır. Ancak transfeksiyon veriminin değişimi nedeniyle bu indüksiyon sistemi ile bu sistem kullanılamaz. Bunun yerine, tTA-Reklam transkriptinin ifadesi normalleştirme amacıyla değerlendirilir, çünkü ifadesi sitomegalovirüs organizatörünün aktivitesi nedeniyle hücrelerde kurucudur. QPCR ile ölçülen ifadesinde herhangi bir varyasyon transfeksiyon verimliliği temsil edecek (astarlar: ileri 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' ve ters 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) ve transfected klonlar ifade normalleştirilmesi sağlayacaktır(Şekil 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Bir SYBR Yeşil boya ana karışımı kullanarak triplicate her qPCR reaksiyon hazırlayın.<ol>
<li>Moleküler biyoloji sınıfı su kullanarak 5 ng/μL cDNA karışımını 1,25 ng/μL konsantrasyonuna seyreltin.</li>
		<li>5 μL SYBR Yeşil boya ana karışımını (2x), 0,1 μL moleküler biyoloji sınıfı suyu, 0,45 μL 7,5 m ileri astar, 0,45 μL 7,5 m geri astar ve 4 μL 1,25 ng/μL cDNA birleştirerek 96 iyi bir plakada borulama yı karıştırın. Plaka kapağının kapalı olduğundan emin olmak ve kontaminasyon ve buharlaşmayı önlemek için optik yapışkan film kullanın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını kısa bir süre santrifüj le aşağı çevirin ve plakayı bir qPCR termocycler'a yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>V5 etiketli GOI ve tTA-Ad amplicon'ları aşağıdaki qPCR koşullarını kullanarak yükseltin: denatürasyon adımı olarak 10 dk için 95 °C, ardından 10 s için 95 °C 40 devir, 15 s için 58 °C ve 20 s için 72 °C. İstenilen amperatörlerin spesifik erime sıcaklıklarını değerlendirmek ve gürültü amplifikatör zirvelerinin yokluğunu sağlamak için amplifikasyon döngüleri yapıldıktan sonra yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi oluşturulmalıdır.<ol>
<li>Ters transkriptaz olmadan bir şablon olarak RNA ile qPCR gerçekleştirerek qRT-PCR için negatif kontroller ekleyin potansiyel plazmid DNA kontaminasyonu ve qPCR için bir kontrol olarak hizmet vermek için qPCR dahil hiçbir cDNA ile qPCR karışımı astar dimers veya eksikliği sağlamak için Kirletici.</li>
		<li>Optimal cDNA konsantrasyonu, astar verimliliği ve konsantrasyon, GOI'ye göre standart bir eğri testi ile optimize edilmelidir. Bunu yapmak için, tedavi edilmeyen hücrelerden cDNA kullanarak bir seri seyreltme gerçekleştirmek (doksisiklin olmadan kültürlü). Standart eğri cDNA seyreltme faktörünün kütüğüne göre Cq değerlerinin çizilmesiyle oluşturulur ve amplifikasyon verimliliği (E) aşağıdaki formül kullanılarak standart eğrinin eğimine göre hesaplanır: E = 10-1/eğim NOT: Amplifikasyon verimi yaklaşık 0,9 ila 1,05 olmalıdır. Aksi takdirde, astarlar yeniden tasarlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>GoI'nin göreli ifade düzeylerini elde etmek ve goi'nin aynı hayvanın hücrelerindeki mRNA ifadesinin bir yüzdesi olarak ifadesini başlangıç noktasında (t = 0)(Şekil 4)olarak bildirmek için GOI'nin ifade değerlerini tTA-Ad ifadesine normalleştirerek karşılaştırmalı Cq yöntemini kullanarak qPCR verilerini analiz edin.</li>
	<li>Yarılanma ömrü, GOI mRNA bozunma eğrisinin oran sabitinden (K) aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenir: t1/2 = ln 2/K.</li>
</ol>

<ol><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li>
<li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li>
<li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+GADD45+and+JNK%2FSAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li>
<li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+isoforms+of+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%2C+NCX1+and+NCX3%2C+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt%2Fprotein+kinase+B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li>
<li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li>
<li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL%3A+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li>
<li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li>
<li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).</li>
<li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+functions+of+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li>
<li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lengthening+of+3%27UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li>
<li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li>
<li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells%3A+involvement+of+purinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li>
<li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+%27megaprimer%27+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGossen%2C+M+%22Tetracyclines+in+Biology%2C+Chemistry+and+Medicine%22">Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine</a>. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).</li>
<li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells%3A+Involvement+of+its+3%27+Untranslated+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li>
<li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modulation+de+la+stabilit%C3%A9+de+l%27ARNm+alphaENaC+dans+les+cellules+%C3%A9pith%C3%A9liales+alv%C3%A9olaires%3A+d%C3%A9termination+du+r%C3%B4le+des+s%C3%A9quences+3%27+non+traduites%22">Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites</a>. , Université de Montréal. (2015).</li>
<li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li>
<li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li>
<li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation-London%22%5BJournal%5D)">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).</li>
<li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+doxycycline%2C+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Birincil kültürde alveoler epitel hücrelerinin düşük transfeksiyon oranı bu hücrelerde mRNA kararlılığını değerlendirmek için Tet-Off sisteminin kullanımı için ciddi bir sınırlama olmuştur. Ancak bu sınırlama pipet elektroporasyonu ile aşılarak %25-30 transfeksiyon verimi(Şekil 1 ve Şekil 3)26'yaizin verebilmiştir.
Transkript stabilitesinin ölçülmesi, belirli bir mRNA'nın modülasyonunun ve hücre homeostazı ve m...

mRNA'ların yarı ömrünü belirlemek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. MRNA etiketli pulse-chase bozunma tekniği, en az hücresel bozukluk ile mRNA'lar büyük bir havuzun eşzamanlı değerlendirilmesi için izin verir. Ancak, bu yaklaşım tek bir gen transkriptinin yarılanma ömrünün doğrudan tahmin edilmesine izin vermez ve büyüme faktörleri, ROS, alarminler veya inflamasyon1ile uyarılması nı takiben bir mRNA'nın posttransktranskripsiyonel modülasyonunu incelemek için uygulanamaz.
Aktinomisin D ve α-amanitin gibi transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımı, zaman içinde mRNA bozunma kinetiğini ölçmek için nispeten basit bir yöntemdir. Önceki teknikler üzerinde bu yaklaşımın bir ana avantajı, (yani, nabız-kovalamaca) doğrudan belirli bir transkript yarı ömrü tahmin etmek ve farklı tedaviler in bozunma kinetik nasıl etkileyebileceğini karşılaştırmak yeteneğine dayanır. Ancak transkripsiyon inhibitörlerinin hücre fizyolojisi üzerindeki önemli zararlı etkisi2. Gerçekten de, bu ilaçlarla tüm hücre transkripsiyonu inhibisyonu, mikroRNA 'lar (miRNA'lar) gibi mRNA stabilitesinde rol oynayan anahtar elementlerin sentezini ve mRNA bozunması ve stabilitesi için önemli olan RNA bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu ve sentezini perturbingin olumsuz yan etkisine sahiptir. Bu ilaçların gen transkripsiyonunun şiddetli pertürbasyonu bu nedenle artefactually transkript lerin bozulma eğrilerini değiştirebilir.
Organizatör indüksiyon sistemi belirli bir mRNA'nın yarı ömrünü ölçmek için üçüncü bir yaklaşımı temsil eder. Bu yöntem, transkripsiyon inhibitörlerini kullanan yöntemlere benzer şekilde belirli bir mRNA'nın bozulmasını ölçer. İki tip indüksiyon sistemi sıklıkla kullanılmaktadır: seruma bağlı c-fos promotörü3 ve Tet-Off indüklenebilir sistem4. C-fos sistemi ile hücre için toksik olabilecek transkripsiyon inhibitörlerinin kullanılmasına gerek yoktur. Ancak, bu yöntem hücre döngüsü senkronizasyonu gerektirir, hangiinterfaz5 sırasında bir transkript gerçek kararlılığının değerlendirilmesi engeller. Buna karşılık, Tet-Off sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi geninin güçlü ifade sağlar (GOI). Bu sistem işlevsel olması için hücre içine cotransfected gereken iki elementin varlığını gerektirir. İlk plazmid (pTet-Off) düzenleyici protein tTA-Adv ifade, prokaryotik represör TetR oluşan bir hibrid sentetik transkripsiyon faktörü (Escherichia coli itibaren) viral protein HSV VP16 üç transkripsiyon transaktivasyon etki erimiş. GOI sentetik bir promotör kontrolü altında pTRE-Tight plazmid içine klonlanır (PSıkı),sitomegalovirüs minimal dizi oluşan (CMV) promotör tetO operatör dizisinin yedi tekrarları erimiş. PTight geninin transkripsiyonu TetR'in tetO ile etkileşimine bağlıdır. Tetrasiklin veya türevi, doksisiklin varlığında, TetR represörü tetO operatörü için yakınlık kaybeder, transkripsiyon bir kesilmesine yol açan4. Tet-Off sisteminin özellikleri ökaryotik hücrelerde spesifik mRNA ekspresyonunun incelenmesi için ideal bir model oluştururken, ökaryotik hücrede prokaryotik düzenleyici dizilerin yokluğuna sekonder olan potansiyel pleiotropik etkilerden kaçınılmalıdır6. Genellikle, iki kat kararlı Tet-Off hücre hatları (HEK 293, HeLa, ve PC12) kontrol edilebilir gen ekspresyonu7,8,9uygun erişim için regülatör ve yanıt plazmidlerin kopyalarını entegre etmek için bu sistem ile kullanılır .
Alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için kültürdeki alveoler epitel hücrelerinin çeşitli modelleri kullanılmıştır. Yıllardır, araştırmacılar yaygın insan veya kemirgenbirincil hücreleri10,11 yanı sıra insan A549 veya sıçan RLE-6TN hücreleri12,13gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullandık. Genellikle daha az proliferatif ve kültür ve transfect daha zor olmasına rağmen, primer kültür alveoler epitel hücreleri fizyolojik ve patolojik koşullarda alveoler epitel fonksiyonu ve disfonksiyonu çalışma için altın standart olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, A549 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri birincil hücrelerin karmaşık özelliklerini ve fenotiplerini sergilemezken, birincil kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin ana özelliklerini, özellikle de polarize ve sıkı bariyer oluşturma yeteneğini yeniden özetlez14,15. Ne yazık ki, bu hücreler çok zor Tet-Off gibi bir organizatör kaynaklı sistem kullanımı yapma, lipozomkullananlar gibi geleneksel transfeksiyon teknikleri, çok dayanıklıdır.
mRNA'ların posttranskripsiyonel modülasyonu, transkriptin gen ekspresyonunu hızla modüle etmek için en etkili yöntemlerden biridir16. MRNA 3' çevrilmemiş bölge (3' UTR) bu mekanizmada önemli bir rol oynar. 5' UTR'nin aksine, 3' UTR'nin uzunluğu ile bir organizmanın hücresel ve morfolojik karmaşıklıkları arasında üstel bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bu korelasyon, 3' UTR, mRNA kodlama bölgeleri gibi, evrim 17 boyunca giderek daha karmaşık posttranskripsiyonel modülasyon için izin doğal seçilim tabi olduğunu göstermektedir17. 3' UTR, transkriptin stabilitesini ve çevirisini etkileyen proteinler ve miRNA'lar için çeşitli bağlayıcı bölgeler içerir.
Bu çalışmada, transkript kararlılığının kontrolü için bir GOI 3 'UTR son derece korunmuş etki alanlarının rolünü araştırmak için bir araç geliştirdi. Alveoler epitel fizyolojisinde önemli bir rol oynayan epitel sodyum kanalı alfa alt ünitesi (αENaC) üzerinde yoğunlaştık18. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri, diğer protokollerle transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımına kıyasla hücre fizyolojisini ve metabolizmasını en az etkileyen bir sistemle 3' UTR'nin mRNA stabilitesinde rolünün incelenmesine olanak sağlayan Tet-Off sisteminin iki bileşeni ile başarılı bir şekilde transekse edildi. GoI ekspresyonunu endojen genin ekspresyonundan ayırt etmek için endojen bir epitop (V5) kullanarak bir klonlama stratejisi geliştirilmiştir. Yanıt ve düzenleyici plazmidler daha sonra pipet elektroporasyon tekniği kullanılarak alveoler epitel hücrelerine aktarıldı. Daha sonra, transkript infeksiytin ekspresyonu farklı zaman aralıklarında doksisiklin ile hücreleri kuluçka ile ölçüldü. Transkriptin yarılanma ömrü RT-qPCR tarafından normalizasyon için transfected tTA-Ad mRNA ürünü kullanılarak modifiye edilmiş bir Cq yöntemi ile değerlendirildi. Protokolümüz sayesinde, bir transkriptin transkripsiyonel modülasyonunu farklı koşullar altında incelemek ve çevrilmemiş bölgelerin katılımını daha ayrıntılı olarak tanımlamak için uygun bir yol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Aktinomisin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Parlak ÇizgiHematitometre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform - Moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED Faz Kontrastlı Ters Mikroskop</td><td>Leica-DNase</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>I, Amplifikasyon Sınıfı</td><td>İnvitrojen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat tamponlu Salin (D-PBS), kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol - Moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 Konsol Kuluçka MakinesiÇalkalayıcı</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol - Moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Agarlı Et Suyu (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LipopolisakkaritlerPseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, toz</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage Class II Biyolojik Güvenlik Kabinleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-exU elektroforez sistemi</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi 10 & mikro; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi Başlangıç Paketi</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atış OmniMAX 2 T1RChemik Olarak YetkinE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 vektörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP plazmidi</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polimeraz High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Gelişmiş vektör</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight vektör</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış alveolar epitel hücreleri</td><td>n.a.n.a.QIAEX</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>II Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plazmid Maxi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 ve 7 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi Yazılımı</td><td>Applied Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Real-Time PCR Sistemi, 96 Kuyulu Hızlı</td><td>Uygulanan Biyosistemler</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Sıçan TNF-alfa Proteini R</td><td>& Amp; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Karides Alkalin Fosfataz (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Ters Transkriptaz</td><td>İnvitrojen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet Sistemi Onaylandı FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Su, Moleküler biyoloji Sınıfı</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

primer alveolar epitel hücrelerde mrna transkriptlerinin kararlılığının araştırılması için etkili transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyon sistemi

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesi, belirli bir haberci RNA'nın (mRNA) modülasyonunun ve hücre homeostazları ve metabolizması üzerindeki etkisini anlamak için temel dir. Gerçekten de, transkript ifadesindeki dalgalanmalar çeviri verimliliğini ve nihayetinde bir transkriptin hücresel aktivitesini değiştirebilir. Bu yöntemlerden bazılarıposttranskripsiyonel modülasyonun uygun şekilde incelenmesini engelleyen sınırlamalara sahip olsa da, mRNA'nın yarıömrünü araştırmak için çeşitli deneysel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir organizatör indüksiyon sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi genifade edebilir. Bu yöntem, hücre homeostazını rahatsız etmeden herhangi bir deneysel koşul altında belirli bir mRNA'nın yarı-ömür tahminine olanak sağlar. Bu yöntemin en önemli dezavantajlarından biri, konvansiyonel transfeksiyon tekniklerine son derece dirençli izole birincil hücrelerde bu tekniğin kullanımını sınırlayan transfect hücrelerinin gerekliliğidir. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Birincil alveoler hücrelerin benzersiz özellikleri ve fenotip bu hücrelerde ilgi genlerin posttranskripsiyonel modülasyonları çalışma için gerekli olun. Bu nedenle amacımız, primer kültürde alveoler epitel hücrelerine ilgi çeken mRNA'ların posttranskripsiyonel modülasyonlarını araştırmak için yeni bir araç geliştirmekti. Transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemini primer alveoler epitel hücrelerine yerleştirmek için hızlı ve etkili bir geçici transfeksiyon protokolü tasarladık. Bu klonlama stratejisi, yapı etiketlemek için viral bir epitop kullanarak, endojen mRNA'lar bu yapı ifade kolay ayrımcılık sağlar. Değiştirilmiş δδ sayısallaştırma döngüsü (Cq) yöntemi kullanılarak, transkriptin ifadesi yarı ömrünü ölçmek için farklı zaman aralıklarında ölçülebilir. Verilerimiz, primer alveoler epitel hücrelerinde çeşitli patofizyolojik koşullarda posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesinde bu yeni yaklaşımın etkinliğini göstermektedir.

Bu protokol, primer alveoler epitel hücrelerinde transkript stabilitesinin modülasyonunda αENaC 3' UTR'nin farklı bölümlerinin önemini değerlendirmek için transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemi oluşturmak için başarıyla kullanılmıştır.
Bu sistemin uygulanmasında ilk adım, transfect zor birincil kültürde alveoler epitel hücreleri için hızlı, kolay ve verimli transfeksiyon tekniği kurmak oldu. ...

Burada, bir pipet elektroporasyon tekniğiile birleştiğinde indüklenebilir bir ifade sistemi kullanılarak primer alveoler epitel hücrelerinde bir transkript posttranskripsiyonel modülasyonu incelemek için kullanılabilecek bir araç salıyoruz.

Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Yani modelimiz, primer kültürdeki alveoler epitel hücrelerinde belirli bir transkriptin transkripsiyon sonrası modülasyonunun ve bunların fizyolojik ve patofizyolojik durumlarının incelenmesine olanak sağlar. Yani primer alveoler epitel hücrelerinin geçici transfeksiyonu hücre fizyolojisi ve metabolizmaları üzerinde minimal etkiye sahiptir, bu da transkripsiyon inhibitörlerini kullanan klasik protokollere göre açık bir avantaj sağlar. İlgi genini ifade eden bir yanıt plazmidinin üretimi için genin dizilimi ve indüklenebilir vektörün birden fazla klonlama alanı, gende dahili olarak bulunmayan birden fazla klonlama bölgesinde tanıma dizilerini belirlemek için analiz edilmelidir.Yüksek sadakat tak polimeraz ve standart örtüşen PCR teknikleri kullanarak, tasarımcı astarları kullanarak iki seçilmiş kısıtlama enzim tanıma siteleri ile ilgi genini kuşatın. İlgi geninin V5 epitope upstream kodlama bir dizi endojen ifade transfected genin ekspresyonunu ayırt etmek için dahil edilmelidir. Mutantlar, çevrilmemiş bölgenin üç asal ucunu yavaş yavaş silen bir poliadenilasyon sitesini kodlayan ters astarlar kullanarak genin mRNA stabilitesi üzerindeki etkilerini incelemek için sıralı silme ile oluşturulabilir.Sonuç olarak, ilgi geninin eklenmesi kısıtlama analizi ile doğrulanabilir. RtPCR sırasında potansiyel olarak tanıtılan gen oryantasyonu ve mutasyonların yokluğu sıralama ile doğrulanabilir. Birincil sıçan akciğer tipi iki alveoler epitel hücrelerintransfeksiyon için, tam minimum temel orta varlığında 100 milimetre Petri kapları santimetre kare başına altıncı hücrelere bir kez 10 hücreleri tohum.37 santigrat derecede 24 saat boyunca nem oranı %5 karbondioksit. Ertesi gün, yeni bir 12 iyi plaka her iyi antibiyotik olmadan tam orta 500 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece plaka önceden ısıtın. Bu kuluçka sırasında, yanıt plazmid bir mikrogram ve düzenleyici vektör bir mikrogram iyi başına bir 1.5 mililitretüp ekleyin.Kalsiyum veya magnezyum olmadan 37 santigrat derece PBS kuyu başına 10 mililitre ile alveoler epitel hücreleri yıkayın ve hücre kültürü kuluçka iki ila dört dakika boyunca 37 santigrat derece santigrat% 0.05 tripsin başına beş mililitre ile hücreleri tedavi. Hücreler ayrıldığında, antibiyotik olmadan tam orta kuyu başına 10 mililitre ile tripsin nötralize ve yeni bir 50 mililitre tüp içine hücreleri toplamak. Kalan hücreleri toplamak ve santrifüj ile hücreleri tortu taze orta dört mililitre ile çanak yıkayın.Tekrar saymak ve tekrar santrifüj için PBS bir mililitre pelet resuspend. Resuspension tampon mililitre başına yedinci hücrelere dört kez 10 bir yoğunlukta pelet resuspend ve yumuşak karıştırma ile plazmid ve vektör her tüp için beşinci hücrelere dört kez 10 ekleyin. Elektroporasyon cihazına bir tüp yerleştirin ve tüpü 3,5 mililitre elektrolitik tamponile doldurun.Bir pipet içine altın kaplama elektrot ucu eklemek ve yavaşça tüp içeriğini karıştırmak için tamamen piston depress. Hücreleri bir pipetle dikkatlice aspire edin ve bir tıklama sesi duyulana kadar pipeti elektroporasyon istasyonuna takın. Alveoler epitel hücreleri için uygun elektroporasyon protokolünü seçin ve dokunmatik ekranda Başlat tuşuna basın.Transfeksiyondan hemen sonra pipeti çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış 12 kuyuplakasının bir kuyuya aktarın. Tüm hücreler elektroporated ve kaplama olduğunda, iki gün sonra antibiyotikler ile tam orta ile her kuyuda supernatant yerine, hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Transfeksiyonun başarısı, floresan mikroskopi veya akış sitometrisi tarafından kontrol vektörü kullanılarak gözlenen EGFP ifadesi ile doğrulanabilir.İlgi geninin transkripsiyonini inhibe etmek için, 72 saat post-transfection taze hazırlanmış adoksisiklin mililitre başına bir mikrogram ile takviye tam orta kuyu başına bir mililitre ile supernatant değiştirin. MRNA'nın yarı ömrünü faiz geninin yarı ömrünü değerlendirmek için plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine 15 dakikadan altı saate geri döndürün. Bir mililitre buz gibi pBS ile bir kuyu yıkama, hücreleri 500 mikrolitre lysis tamponu ile düzenli hale getirerek, her deneysel zaman noktasında ticari olarak mevcut olan fenol kloroform RNA ekstraksiyon kitinden hafifçe titretin.Daha sonra, Kit talimatlarına göre RNA'yı izole edin ve 230, 260 ve 280 nanometrede spektrofotometri ile RNA verimini ve saflığını belirleyin. İzole RNA'nın stabilitesini belirlemek için, ilk olarak her numuneden toplam RNA'nın bir mikrogramını rna içermeyen DNase ile tedavi edin ve plazmid DNA izlerini çıkarın. Üreticinin talimatlarına göre DNA tükenmiş toplam RNA ters transkripsiyon verimliliğini artırmak için oligo dT ve rasgele heksomer astar karışımı ile ticari olarak kullanılabilir cDNA sentez kiti kullanın.Mikrolitre konsantrasyonu başına beş nanogramdaki cDNA reaksiyonunu seyreltmek için reaksiyon karışımının 20 mikrolitresine 180 mikrolitre moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin ve mikrolitre konsantrasyonu başına 1,25 nanograma ulaşmak için cDNA karışımını taze moleküler biyoloji sınıfı suyla seyreltin. Moleküler biyoloji sınıf su 0.1 mikrolitre ile siber yeşil boya ana karışımı beş mikrolitre birleştirin, 0.45 mikrolitre 7.5 mikromolar ileri astar, 0.45 mikrolitre 7.5 mikromolar ters astar, ve cDNA 1.25gram perlitre toplam reaksiyon hacmi elde etmek için cDNA dört mikrolitre. Numuneleri bir qPCR termocycler'ına yerleştirin ve v5 etiket genini güçlendirin ve belirtildiği gibi qPCR koşullarını kullanarak tetrosikline transaktivatör avans amplikonlarını yükseltin ve istenilen amperatörlerin spesifik erime sıcaklıklarını değerlendirmek ve gürültü amplicon tepelerinin yokluğunu sağlamak için yüksek çözünürlüklü erime eğrisi oluşturun.Bu pipet elektroporasyon tekniği, floresan mikroskobu ve akış sitometrisi ile saptanan EGFP hücrelerinin oranlarında gözlendiği gibi %25-30 transfeksiyon verimlilik oranını kolaylaştırır. Doksisiklin mililitre başına bir mikrogram ile alveoler epitel hücrelerinin tedavisi tedavi süresi boyunca herhangi bir zaman noktasında endojen alfa ENaC mRNA ekspresyonu üzerinde önemli bir etkisi yoktur. Gösterildiği gibi transkripsiyonla kontrol edilen plazmid ekspresyon sistemi kullanılarak, V5 alfa ENaC sinyali tetrasiklin transaktivatör gelişmiş sinyaline göre normalleştirilebilmekte ve çift delta niceleme döngüsü yöntemi kullanılarak transfeksiyonun etkinliğini saptamak gerekir.Alfa ENaC mRNA'nın yarılanma ömrü, tetrasiklin insiyatifinin varlığında, aktinomisin D'nin artifreal alfa ENaC mRNA stabilizasyonuna yol açtığını doğrulayan, tetrasiklin inin insiyatifinin varlığında yedi kata kadar daha kısadır. Ayrıca siklohexamide ve tümör nekroz faktör alfa tedavisi transkriptin stabilitesini önemli ölçüde azaltırken lipopolisakkaritler azalmaz. V5 alfa ENaC mRNA stabilitesi modülasyonunda önemli değişiklikler üç asal çevrilmemiş bölgenin silinmiş ve dahil bölgelere bağlı olarak indüklenebilir.Buna ek olarak, spesifik RNA bağlayıcı proteinlerin aşırı ekspresyonu boş bir pcDNA üç plazmid ile transfeksiyon ile karşılaştırıldığında 5-alfa ENaC mRNA kararlılığını azaltır. Bu araç, alveoler epitelin işlevi ve bunların fizyolojik veya patolojik koşulları ile ilgili anahtar genlerin transkripsiyon sonrası düzenlenmesi ne yeni anlayışlar sorgulamak için yararlı olacaktır.

efficient-transcriptionally-controlled-plasmid-expression-system-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

RNA polimeraz II transkripsiyonel kinetiği canlı hücrelerin belirli genlerin ölçülür. ilgi gen transkripsiyonu mRNA'ların floresan etiketli ve (sıkı bağlamak) in vivo kinetiği transkripsiyonel uzama elde edilir Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak.

Tek Yaşayan Hücreler mRNA Transkripsiyon Kinetik Ölçüm

Bu video, ilgilenilen bir gen ve düzenleyici bir plazmid içeren bir plazmit ile transfeksiyon yoluyla kültürlenmiş hücrelerde gen ekspresyonunu düzenleme yöntemini açıklar. Bu plazmitin ekspresyonu, tetrasiklin veya sentetik analogları tarafından kontrol edilebilir, bu da bu sistemi düzenlenebilir gen ekspresyonunu incelemek için yararlı bir model haline getirir.

İndüklenebilir Tet-Off Düzenlenebilir Sistemi: Tetrasiklin Kapalı Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Gen Ekspresyonunu Modüle Etmek İçin Bir İn Vitro Yöntem

Transgenik farenin ya da viral vektörler, akciğer içinde protein ekspresyonu artırmak için kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler teknik olarak zor, zaman alıcı ve sonuçları etkilemesi hedef dışı etkileri vardır. Bizim protein transfeksiyon protokolü bir lipid tabanlı transfeksiyon reaktif ve düzgün akciğer hücrelerine aktif bir protein sunmak için bir ultra ince Micro kullanır.

Fare Akciğer Protein Transfeksiyon

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin transdüle edilmesi zordur. Bu protokol, lentivirüslerin üretimini ve konsantrasyonlarını ve ayrıca psödostratifiye bir epitele farklılaşma boyunca bu hücrelerde yüksek verimli transdüksiyonlar elde etmek için gerekli olan optimal kültür koşullarını tanımlar.

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Bu protokol, yenidoğan, genç veya yetişkin fare akciğerlerinden (enfekte veya enfekte olmayan) canlı alveolar tip II epitel hücrelerini (AECII) izole etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, AECII'nin akciğer iltihabı ve enfeksiyon sırasında rollerini belirlemeye yönelik moleküler ve/veya fonksiyonel çalışmaların ilerlemesini sağlar.

Yenidoğnan, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden alveolar tip II epitel hücrelerinin enfeksîyonel deneysel ortamlara uyarlanabilir izolyasyonu

Keşfedin, primer alveolar epitel hücrelerinde mRNA transkript kararlılığını incelemek için pipet elektroporasyonu ile indüklenebilir plazmid ekspresyon sisteminin kullanımını. Bu yöntem hücre fizyolojisini koruyarak transkripsiyon sonrası düzenlemeyi araştırır.

Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi (Video) | JoVE Journal

Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi

Daha fazla video keşfet