Name: Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Öğrenin, katı tümör hücre hatlarında yan popülasyon analizi yaparak kanser kök hücrelerini izole etme ve tanımlama yöntemini. Bu hızlı ve uygun maliyetli teknik, tümör hücrelerinin köklülük özelliklerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin doğa bilimleri vakfı tarafından finanse edildi 81572599, 81773124 ve 81972787; Tianjin Şehri Doğa Bilimleri Vakfı (Çin) 19JCYBJC27300; Tianjin Halk Hastanesi & Nankai Üniversitesi İşbirlikçi Araştırma Hibesi 2016rmnk005; Nankai Üniversitesi Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları 63191153.

1. Hücre hazırlığı
<ol><li>Hücre sindirimi ve nötralizasyon<ol>
<li>Tohum tümör hücreleri (MDA-MB-231 hücreleri gibi) 6 kuyu plakasında ve % 5 CO2ile birlikte verilen 37 °C inkübatörde kültüre edilir.</li>
		<li>Yoğunlukları yaklaşık% 90'a ulaştığında hücreleri hasat edin. Kültür ortamını iyice emiş ve hücreleri 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2x yıkayın. NOT: Sinyal yolu inhibitörlerinin (örneğin FRA1 inhibitörü) veya aktivatörlerin (örneğin STAT3 aktivatör) tümör hücrelerinin sap özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için tümör hücreleri 6 kuyu plakasında tohumlanır ve hasat öncesi belirli bir süre inhibitörler veya aktivatörlerle ön işlemden geçirilir.</li>
		<li>6 kuyu plakasının her kuyusuna 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin, plakayı 37 ° C'de bir inkübatöre 1-3 dakika (dk) yerleştirin ve hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun. NOT: Hücre canlılığındaki değişiklikler nedeniyle uzun süreli sindirim SP profilini etkileyecektir.</li>
		<li>Sindirimi sonlandırmak için 6 kuyu plakasının her kuyusuna% 2 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 3 mL PBS ekleyin ve hücre kümelerini dağıtmak için hücreleri 3-5x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin.</li>
		<li>Yeni bir 6 kuyu plakasının bir kuyusuna 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve mikroskop altında inceleyin. Hücre kümeleri gözlenirse, hücre süspansiyonunu 70 μM hücre süzgecinden geçirin. NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır.</li>
		<li>Hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücreleri. Üstnatantı çıkarın ve % 2 FBS ile desteklenmiş 3 mL PBS'de yeniden dürt. Hücreleri iyice karıştırmak için 3-5x yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre sayıları<ol>
<li>1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve 50 μL trippan mavi çözelti ile karıştırın. Pipet 10 μL karışımın hemositometre gibi standart bir yöntem kullanarak canlı hücre sayısını saymak için.</li>
		<li>PBS'deki hücreleri %2 FBS ile birlikte 1 x 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. 5 mL polistiren yuvarlak alt test tüpüne 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve iki numune tüpü hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hoechst 33342 ile hücre boyama
<ol><li>Uygun bir son konsantrasyona ulaşmak için Hoechst 33342'yi bir tüpe ekleyin. NOT: Örneğin, Hoechst 33342'nin uygun konsantrasyonu MDA-MB-231 hücreleri için 3 μg/mL'dir.</li>
	<li>Uygun bir son konsantrasyona başka bir tüpe bir bloker (örneğin, Fumitremorgin C, Verapamil veya Reserpine) ekleyin ve 2.1 adımında açıklandığı gibi hoechst 33342 konsantrasyonunun aynısını eklemeden önce tüpü 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: MDA-MB-231 hücreleri için uygun engelleyici Reserpine'dir (40 μM). Reserpine, geçişli SP alanında hücre olmadığını doğrulamak için engelleme denetimi olarak kullanılır.</li>
	<li>Hücre içeren birkaç tüp hazırlayın ve farklı konsantrasyon gradyanlarına Hoechst 33342 ekleyin. Akış sitometrisi test edildikten sonra SP profiline ve oranına göre uygun konsantrasyonu seçin. NOT: Bu, Hoechst 33342'nin uygun konsantrasyonunun tanımlanmasında kullanılan isteğe bağlı bir adımdır.</li>
	<li>Hücre içeren birkaç tüp hazırlayın, blokeri farklı konsantrasyon gradyanlarına ekleyin, tüpleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından uygun bir konsantrasyona Hoechst 33342 ekleyin. Akış sitometrisi test edildikten sonra, kapılı SP alanında hücrelerin yokluğuna göre uygun konsantrasyonu seçin. NOT: Bu, uygun engelleyici konsantrasyonunun tanımlanması için kullanılan isteğe bağlı bir adımdır.</li>
	<li>Tüpleri 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve tüpleri her 10 dakikada bir sallayarak 60 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Tüpleri iyice sallamak lekeleme için önemlidir, çünkü daha iyi boyama sonuçları için hücreler ve boya arasında tam temas sağlar.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, hücreleri 200 x g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice emiş edin, çünkü hücreler çok gevşek ve dengesiz peletler oluşturur.</li>
	<li>Her tüpün hücrelerini% 2 FBS ile desteklenmiş 1 mL buz gibi PBS'de yeniden depolayın ve hücreleri iyice karıştırmak için 3-5x yukarı ve aşağı pipetleyin. Ölü hücreleri tanımlamak için her tüpün süspansiyonuna 1 μL 1 mg/mL propidium iyodür (PI) ekleyin. NOT: Bu adımdaki tüm prosedürler, Hoechst 33342'nin tümör hücrelerinden efflux'ını inhibe etmek için 4 °C'de yapılmalıdır. Tüpler ışığa doğrudan maruz kalmaktan korunmalıdır.</li>
</ol>3. Akış sitometrisine göre analiz
NOT: Akış sitometresi yazılımının kullanım talimatları (bkz. Malzeme Tablosu)bu bölümde açıklanmıştır ve Ek Şekiller 1–10.
<ol><li>Akış sitometresi yazılımında KLASÖR düğmesini tıklatın. Deney düğmesini tıklatın, sonra Yeni Deneme 'yi tıklatın ( Tamamlayıcı Şekil1A,B).</li>
	<li>Tamam düğmesini tıklatın. "Experiment_001" KLASÖR altında görünecektir (Ek Şekil 2A,B).</li>
	<li>Klasör adını belirli bir adla (örneğin, "20191118-SP") değiştirmek için Experiment_001 düğmesini tıklatın. Enter 'ıtıklatın. Yeni ad ("20191118-SP") FOLDER (Ek Şekil 3A,B)altında görünecektir.</li>
	<li>Yeni deneme klasörüne örnek eklemek için Yeni Örnek düğmesini tıklatın ("20191118-SP"). Numuneye tüp eklemek için Yeni Tüp düğmesini tıklatın. Ok Ucu düğmesini tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 4A-C).</li>
	<li>Parametreler düğmesini tıklatın ve akış sitometresinin parametrelerini ayarlayın (Tamamlayıcı Şekil 5).<ol>
<li>Emisyon dalga boylarını ayırmak için 610 nm dikroik ayna kısa geçişi (DMSP) kullanın. Mavi floresan toplamak için 450/20 nm BP filtre ve kırmızı floresan toplamak için 675 nm EFLP kullanın. NOT: Hoechst 33342 355 nm'de UV lazer ile, PI ise 488 nm'de heyecanlanıyor.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometreslerindeki hücre örneklerini çalıştırın. NOT: SP hücreleri steril koşullar altında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile sıralanabilir. Takip deneyleri için toplam 100.000-500.000 hücre toplanmalıdır.<ol><li>Akış sitometresinde Hoechst 33342 ile boyanmış hücreleri çalıştırın.<ol>
<li>Hoechst 33342 ile boyanmış hücreleri içeren tüpleri sitometreye yerleştirin.</li>
			<li>Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, sonra X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "PI-A" olarak ayarlayın. PI floresansına (logaritmik ölçeğe ayarlanmış Y ekseni) karşı ileri dağılım darbe alanının (FSC-A, doğrusal moda ayarlanmış X ekseni) nokta çizimini görüntüleyin. Sağ taraftaki canlı hücreleri ve pi ile parlak bir şekilde lekelenmiş canlı olmayan hücreleri sol üst köşede gösterecek şekilde voltajları ayarlayın. Ardından, FSC-A, PI-A alt kümesi ( TamamlayıcıŞekil 6A,B)olarak da bilinen P1 alt kümesini kapıya almak için Çokgen Kapı düğmesini tıklatarak ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını dışlamak için bir çokgen kapı kurun (Şekil 1A).</li>
			<li>Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Grafiği düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "FSC-W" olarak ayarlayın. FSC-A'nın (X ekseni) nokta çizimini ileri dağılım darbe genişliğine (FSC-W, Y ekseni) karşı görüntüleyin. Nokta çizimini sağ tıklatın, Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P1 düğmesini tıklatın. P2 alt kümesini (FSC-A, FSC-W alt kümesi olarak da bilinir) geçirmek için dikdörtgen bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu, büyük hacimli hücreleri hariç tutacaktır(Ek Şekil 7A-C ve Şekil 1A).</li>
			<li>Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "SSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "SSC-W" olarak ayarlayın. Yan dağılım darbe alanının (SSC-A, X ekseni) yan dağılım darbe genişliğine (SSC-W, Y ekseni) karşı nokta çizimini görüntüleyin. Nokta çizimini sağ tıklatın ve Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P2 düğmesini tıklatın. Ardından, P3 alt kümesini (SSC-A, SSC-W alt kümesi olarak da bilinir) geçirmek için dikdörtgen bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu, tekdüze tanecikli bir hücre popülasyonu elde edecektir(Ek Şekil 8A-C ve Şekil 1A).</li>
			<li>Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "Hoechst Red-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "Hoechst Blue-A" olarak ayarlayın. Hoechst Red-A (X ekseni) ile Hoechst Blue-A (Y ekseni) arasındaki nokta çizimini görüntüleyin. Nokta çizimini sağ tıklatın, Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P3 düğmesini tıklatın. P4 alt kümesini (Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesi olarak da bilinir) kapıya bir çokgen kapı oluşturmak için Çokgen Kapı düğmesini tıklatın. Nokta çizimini sağ tıklatın, nüfus hiyerarşisini göstermek için Nüfus Hiyerarşisini Göster düğmesini tıklatın. NOT: Nokta çizimi üç farklı popülasyon gösterecektir: 1) grafiğin merkezine yakın bir G0-G1 faz popülasyonu; 2) sağ üst köşeye yakın bir S-G2/M faz popülasyonu; 3) SP. SP daha sonra daha fazla analiz için kapılıdır(Ek Şekil 9A-D ve Şekil 1A). Hoechst Red-A vs Hoechst Blue-A'nın nokta çizimi Şekil 1A'dagösterilene benzer bir SP profili göstermiyorsa, benzer bir profil görülene kadar voltajlar ayarlanmalıdır. Bu arada, yukarıdaki kapıların tümlerini buna göre ayarlayın.</li>
			<li>SP hücrelerinin kapı bölgesini belirledikten sonra, SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20.000-100.000 olay toplamak için Veri Al'ı tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 10).</li>
		</ol></li>
		<li>Akış sitometresinde bloker ile işlenmiş Hoechst 33342 lekeli hücreleri çalıştırın.<ol>
<li>Bloker içeren tüpleri sitometreye yerleştirin ve voltajların ve kapıların uygun şekilde seçilip seçilmediğini daha fazla kontrol etmek için aynı voltajları ve kapıları kullanarak hücreleri çalıştırın. NOT: Sadece Hoechst 33342 boyama ile karşılaştırıldığında, varsa hücrelerin sadece çok küçük bir kısmı SP'nin kapılı bölgesinde görünmelidir (Şekil 1B).</li>
			<li>SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20.000-100.000 olay toplayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi
NOT: Akış sitometri analiz yazılımının kullanımına ilişkin talimatlar (bkz. Malzeme Tablosu)bu bölümde açıklanmıştır ve Ek Şekiller 11–16.
<ol><li>Dosyaları fcs biçiminde bir bilgisayara kopyalayın, akış sitometri analiz yazılımını açın ve bir örnek dosyayı yazılıma sürükleyin (Tamamlayıcı Şekil 11A,B).
</li>
	<li>Ağ hücreleri ve SP hücrelerinin yüzdesini elde edin.<ol>
<li>Bu örnek dosyayıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "PI-A" olarak ayarlayın. Ardından, bir çokgen kapı oluşturun ve FSC-A, PI-A alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 12A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.</li>
		<li>FSC-A, PI-A alt küme dosyasınıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "FSC-W" olarak ayarlayın. Ardından, dikdörtgen bir kapı oluşturun ve FSC-A, FSC-W alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 13A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.</li>
		<li>FSC-A, FSC-W alt küme dosyasınıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "SSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "SSC-W" olarak ayarlayın. Ardından, dikdörtgen bir kapı oluşturun ve SSC-A, SSC-W alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 14A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.</li>
		<li>SSC-A, SSC-W alt küme dosyasınıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "Hoechst Red-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "Hoechst Blue-A" olarak ayarlayın. Ardından, bir çokgen kapı oluşturun ve Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 15A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Düzen Düzenleyicisi'ni Aç düğmesini tıklatarak Düzen Düzenleyicisi'ni açın. SSC-A, SSC-W alt küme dosyasını Düzen Düzenleyicisi'ne sürükleyin, sonra görüntü sonuçlarını kaydetmek için düzen penceresini dosyaya kaydetmek için tıklatın düğmesini tıklatın ( Tamamlayıcı Şekil16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazılımı kapatırken gating bilgilerini korumak için çalışma alanını kaydedin.</li>
	<li>İki grup arasındaki farkı karşılaştırmak için istatistiksel analiz yazılımı ile t-test analizleri gerçekleştirin. P değeri 0.05'< istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlandı.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li>
<li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B+CD24%28-%29+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor%2Fstem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90%2B+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology%3A+can+we+translate+into+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncolcology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16(2015).</li>
<li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18(2005).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells%3A+Beyond+Chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li>
<li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2%2FBCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li>
<li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp%2C+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li>
<li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+side+order+of+stem+cells%3A+the+SP+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li>
<li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+is+enriched+in+tumorigenic%2C+stem-like+cancer+cells%2C+whereas+ABCG2%2B+and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li>
<li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK2%2FSTAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44%28%2B%29CD24%28-%29+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li>
<li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Lead+to+Drug+Candidate%3A+Optimization+of+3-%28Phenylethynyl%29-1H-pyrazolo%5B3%2C4-d%5Dpyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicnal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li>
<li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li>
<li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+%28SP%29+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li>
<li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+the+side+population+%28SP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23(2013).</li>
<li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li>
<li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624(2019).</li>
<li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+%3A+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li>
<li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity%3A+A+Quantitative%2C+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188(2016).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li>
<li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+minor+groove-binding+ligands%3A+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

SP tahlilleri için akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, her hücre hattı için Verapamil veya Reserpine gibi uygun bir engelleyicinin seçilmesidir, çünkü SP hücrelerinin "kapı" konumu, engelleyicinin eklenmesinden sonra çok sayıda SP hücresinin kaybolduğu konuma göre belirlenir. MDA-MB-231 hücre hattı için Reserpine iyi çalışır. Ancak, diğer hücre hatları için farklı engelleyiciler daha iyi çalışabilir.
İkincisi Hoechst 33342 konsantrasyonudur. Temsili verilerin göster...

Kanser kök hücreleri (CSC' ler), tümör büyümesi, metastaz ve nüks1,2'dehayati rol oynayan, kendini yenileme yeteneğine ve çoklu farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerin alt kümeleridir. Şu anda, CSC'lerin akciğer, beyin, pankreas, prostat, meme ve karaciğer kanserleri 3, 4 , 5 ,6,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli kötü huylu tümörlerde varolduğutanımlanmıştır. Bu tümörlerde CSC'lerin tanımlanması esas olarak CD44, CD24, CD133 ve Sca-19,10 'un yüksek ve/veya düşük ekspresyosu gibi yüzey belirteç proteinlerinin varlığına dayanmaktadır, ancak CSC'leri CSC olmayanlardan ayırt edebilecek benzersiz bir belirteç şimdiye kadar bildirilmemiştir. Şu anda tümör dokusunda veya tümör hücre hatlarında CSC'leri tanımlamak ve arındırmak için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bu teknikler CSC'lerin belirli özelliklerine göre tasarlanmıştır. Bunlar arasında, yan popülasyon (SP) hücrelerinin tahlilleri ve sıraları yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir.
SP hücreleri başlangıçta Goodell ve ark.11, fare kemik iliği hücrelerinde hematopoetik kök hücreleri karakterize ettiklerinde keşfedildi. Fare kemik iliği hücreleri floresan boya Hoechst 33342 ile etiketlendiğinde, bir akış sitometrisi testinin iki boyutlu nokta grafiğinde hoechst 33342 loş lekeli hücrelerin küçük bir grubu ortaya çıktı. Hoechst 33342 DNA bağlayıcı bir boyadır ve farklı spektral özelliklere yol açan en az iki bağlama moduna sahiptir. Floresan emisyonu aynı anda iki dalga boyunda görüntülerken, birden fazla popülasyon ortaya çıkabilir12. Tahlillerinde Hoechst 33342 350 nm'de heyecanlandı ve floresan 450/20 nm bant geçişi (BP) filtresi ve 675 nm kenar filtresi uzun geçiş (EFLP)11kullanılarak ölçüldü. Kemik iliği hücrelerinin tüm popülasyonu ile karşılaştırıldığında, bu hücre grubu SP hücreleri11adı verilen hematopoetik kök hücreler ile zenginleştirilmiştir. SP hücreleri Hoechst 33342'yi hızla dışarı atabilir. Bu boyanın efflux ile ilgilidir ATP bağlayıcı kaset (ABC) transporters13Fumitremorgin C14, Verapamil ve Reserpine 15,16gibi bazı ajanlar tarafından inhibe edilebilir. Bundan sonra, çeşitli dokularda, organlarda, tümör dokularında ve tümör hücre hatlarında farklı oranlarda SP hücreleri tespit edildi17,18,19. Bu SP hücreleri kök hücrelerin birçok özelliğine sahiptir17,19.
Bu makalede Hoechst 33342 kültürlü tümör hücrelerinin etiketlenerek boyanması ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile analizi açıklanmaktadır. Ayrıca Hoechst 33342 konsantrasyonunun optimizasyonu ve bu yaklaşım kullanılarak belirli bir tümör hücre hattı için uygun bloker seçimi gösterilmiştir. Son olarak, saplanma terfisi veya inhibisyon sinyallerinin tümör hücrelerindeki SP oranı üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Deneysel örnekler, SP'nin analizinin gen ekspresyatörleri, küçük inhibitörler, aktivatörler, sitokinler ve kemokinler gibi çeşitli sinyallerin tümör saplığı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. CD44+/CD24– popülasyonun sıralenmesi, aldehit dehidrogenaz (ALDH) analizi ve tümör küre oluşumu tahlilleri gibi CSC'lerin izolasyonu ve saflaştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem manipülasyon için daha kolaydır ve uygun maliyetlidir.

<table><tbody><tr><td>6 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9,5 cm2 (yaklaşık)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Biyolojik Endüstriler (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRFortessa</td></tr><tr><td>Akış sitometresi yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva</td></tr><tr><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimide H 33342 trihidroklorür</td></tr><tr><td>Polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td>12 x 75 mm, 5 mL</td></tr><tr><td>Propidium iyodür (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>3,8-Diamino-5 - [3- (dietilmetilamonyo) propil] -6-fenilfenantridinyum diiyodür</td></tr><tr><td>Reserpin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td> <td>(3 & beta; , 16 & beta;, 17 & alfa; , 18 & beta;, 20 & alfa;)-11,17-Dimetoksi-18-[(3,4,5-trimetoksibenzoil)oksi]yohimban-16-karboksilik asit metil ester</td></tr><tr><td>SKLB816</td><td>Dr. Shengyong Yang, Sichuan Üniversitesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Dimetoksifeniletil)metilamino]
-2-(3,4-dimetoksifenil)-2-izopropilvaleronitril hidroklorür</td></tr></tbody></table>

solid tümör hücre hatlarında yan popülasyon analizi

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Kanser kök hücreleri (KSS) tümör büyümesi, metastaz ve nüksün önemli bir nedenidir. CSC'lerin izolasyonu ve tanımlanması tümör araştırmaları için büyük önem taşımaktadır. Günümüzde CSC'lerin tümör dokularından ve tümör hücre hatlarından tanımlanması ve saflaştırılması için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Yan popülasyon (SP) hücrelerinin ayrılması ve analizi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir. Yöntemler, CSC'lerin Hoechst 33342 gibi floresan boyaları hızla dışarı atma yeteneğine dayanır. Boyanın efflux'u ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ile ilişkilidir ve ABC taşıyıcı inhibitörleri tarafından engellenebilir. Hoechst 33342 ile kültürlü tümör hücrelerini boyama ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile oranını analiz etme yöntemleri açıklanmıştır. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu testte oluşturulan veriler, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Bu yönteme göre dört deneysel SP analizi yapıldı. İlkinde üç negatif insan meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231'deki SP hücrelerinin oranını normal şartlarda tespit ettik. Hücre sayımından sonra Hoechst 33342, 1 x 10 6 hücre içeren bir tüpe3 μg/mL'lik son konsantrasyona eklendi. Reserpine ve Hoechst 33342, sırasıyla 40 μM ve 3 μg/mL'lik son konsantrasyonlara başka bir tüpe eklendi. Pi her iki tüpe de eklendi. FSC-A'nın (X ekseni) PI-A'ya (Y ekseni) karşı noktasal grafiği üç popülasyon gösterdi: 1) ölü hücr...

Katı tümör hücre hatlarındaki yan popülasyon hücrelerinin oranını ölçmek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunulmuştur.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Yan popülasyon hücrelerinin analizi, kanser kök hücrelerini tümör dokularından ve tümör hücre çizgilerinden izole etmek ve tanımlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu yöntem, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.Birçok faktör bu analizde SP hücrelerinin yüzdesini etkileyebilir, bu nedenle resmi deneyden önce uygun koşulları araştırmak önemlidir. Tümör hücrelerini altı kuyulu bir tabakta tohumlayın ve %5 karbondioksitle birlikte verilen 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kuluçkaya yatır. Hücre yoğunluğu yaklaşık% 90'a ulaştığında kültür ortamını aspire edin ve hücreleri üç mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, her kuyuya% 0.25 tripsin-EDTA'nın 500 mikrolitresini ekleyin ve plakayı bir ila üç dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun, her kuyuya%2 FBS ile desteklenmiş üç mililitre PBS ekleyin ve hücre kümelerini dağıtmak için hücreleri üç ila beş kez yukarı ve aşağı borulayın. Hücre süspansiyonu mikroskop altında incele.Hücre kümeleri varsa, süspansiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin. Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 200 kez g'da santrifüjleyin. Üstnatantı çıkarın ve hücreleri %2 FBS ile desteklenmiş üç mililitre PBS'de yeniden biriktirin ve hücreleri karıştırmak için üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleme.Hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri sayın ve mililitre başına altı hücreye bir kez 10 kez nihai konsantrasyona% 2 FPS ile desteklenmiş PBS'de seyreltin. İki adet beş mililitre, polistiren, yuvarlak tabanlı test tüpleri hazırlayın ve her tüpe bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Bir tüpü test tüpü, diğerini engelleyici kontrol tüpü olarak etiketle.Uygun konsantrasyona seyrelterek bir bloker çözeltisi hazırlayın. Bloker kontrol tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Tüpü her 10 dakikada bir sallayın.Uygun konsantrasyona seyrelterek Hoechst 33342 çözeltisi hazırlayın. Test tüpüne ve bloker kontrol tüpüne ayrı ayrı ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpleri 37 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya bırakın. Tüpleri her 10 dakikada bir sallayın.Kuluçkadan sonra, hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantı dikkatlice epire edin. Her tüpteki hücreleri%2 FBS ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi PBS ile yeniden depolayın, ardından karıştırmak için hücreleri yukarı ve aşağı borulayın. Her tüpe mililitre başına bir miligram propidium iyot veya PI mikrolitre ekleyin ve karıştırın.Akış sitometresi yazılımında Parametreler sekmesini tıklatın. İlk olarak, sırasıyla FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ve PI parametrelerini seçin. İkinci olarak, PI parametresi için logaritmik ölçeği seçin.Son olarak, sırasıyla FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ve PI parametreleri için alan ve genişlik ölçeklerini seçin. Hücreleri önce test tüpünden çalıştırın, sonra aynı voltajları ve kapıları kullanarak bloker kontrol tüpünden hücreleri çalıştırın. SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20 ila 100.000 olay toplayın.Bu yöntem MDA-MB-231 insan meme kanseri hücre hattındaki SP hücrelerinin oranını tespit etmek için kullanılmıştır. FSC-A ile PI-A arasındaki nokta grafiği, daha fazla analize tabi tutulan ölü hücre, hücre enkazı ve PI negatif hücrelerinin ana popülasyonu popülasyonu gösterdi. Tedavi edilmeyen hücrelerde yaklaşık %0,9 ve reserpine ile tedavi edilen hücrelerde yaklaşık %0,09 olan SP hücrelerinin oranını analiz etmek için FSC-A ile FSC-W ve SSC-A'nın noktasal grafiğinden kapılı tek bir hücre popülasyonu kullanıldı.Hoechst 33342'nin farklı boyama konsantrasyonları MDA-MB-435 hücreleri üzerinde test edildi ve mililitre başına iki mikrogramın SP analizi için en uygun olduğu belirlendi. Düşük konsantrasyonlar SP hücrelerini diğer popülasyonlardan ayırt etmeyi zorlaştırırken, yüksek konsantrasyonlar SP hücrelerinin kaybolmasına neden oldu. MDA-MB-435 hücreleri için uygun engelleyiciyi belirlemek için verapamil ve reserpine test edildi.Hücrelerin yaklaşık% 0.4'ü verapamil tedavisinden sonra boyayı dışarı attı, ancak reserpine tedavisinden sonra oran yaklaşık% 0.1'e düştü ve reserpinin bu hücre hattı için daha uygun bir engelleyici olduğunu gösterdi. Bu protokol ayrıca STAT3 aktivatör kolivelin ile tedavi edilen A549 insan akciğer adenokarsinom hücrelerinde ve FRA1 inhibitörü SKLB816 ile tedavi edilen T47D insan meme kanseri hücrelerinde SP hücrelerinin oranını belirlemek için kullanılmıştır. Bu test, sinyal yollarının kanser kök hücrelerinin özellikleri üzerindeki düzenleyici etkisine dair ipuçları sağlar ve sonuçta tümörlerin hedeflenen tedavisine rehberlik edebilecek yeni mekanizmaların keşfini kolaylaştırır.

analysis-of-side-population-in-solid-tumor-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Aşağıdaki protokol, kök hücrelerden oluşan T hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi (T-ALL) tümör hücrelerinin yan popülasyonunu yetişkin bir Zebra balığından izole etmek için bir yöntemi açıklar. Yan popülasyonda belirgin hücre belirteçleri yoktur ve bu nedenle onları izole etmek için Hoechst 33342 boya akış testi kullanıyoruz.

Yan Popülasyon Testi: Tümör Hücrelerinin Yan Popülasyonunu Zebra Balığından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı veya FACS kullanarak baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından kanser kök benzeri hücrelerin bir alt popülasyonunun izolasyonunu açıklıyoruz. İzole edilmiş yan hücre popülasyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Kanser Tarafı Popülasyon Ayrımcılığı Deneyi: Hoechst Boya Akıntı Testi Kullanılarak Kanser Kök Benzeri Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Kanser hücresi proteomlarının derinlemesine analizleri, yeni ilaç hedeflerinin ve tanısal biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Sıvı ve katı tümörlerden türetilen kanser hücresi alt popülasyonlarındaki (fosfo-) proteomların kantitatif analizi için deneysel bir iş akışı açıklıyoruz. Bu, hücresel zenginleştirme stratejilerinin kantitatif Super-SILAC tabanlı kütle spektrometresi ile birleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Kanser kök benzeri hücrelerin tümör nüksü ve tedavilere dirençteki rolünü anlamak son on yılda büyük ilgi gören bir konu haline gelmiştir. Bu makale, baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından (HNSCC) kanser kök benzeri hücrelerin alt popülasyonunun izolasyonunu ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Burada, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyarabileceğini ve yan popülasyon (SP) hücre tespiti için 355 nm lazere uygun bir alternatif olarak hizmet edebileceğini ve böylece akış sitometrisi uygulamalarında mevcut lazer yelpazesini genişletebileceğini gösteriyoruz.

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Öğrenin, katı tümör hücre hatlarında yan popülasyon analizi yaparak kanser kök hücrelerini izole etme ve tanımlama yöntemini. Bu hızlı ve uygun maliyetli teknik, tümör hücrelerinin köklülük özelliklerini anlamaya yardımcı olur.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Daha fazla video keşfet