Name: Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, yüksek titerli enfeksiyöz influenza pseudotyped partiküller üretmek için H5N1 ve H7N9 zarf glikoproteinlerini kullanarak viral bulaşıcılığı değerlendirmeyi. Bu yöntem, BSL-2 ortamında güvenli viroloji araştırmaları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Zhejiang İl Tıp ve Sağlık Bilimleri ve Teknoloji Planı (Hibe Numaraları, 2017KY538), Hangzhou Belediye Tıp ve Sağlık Bilimleri ve Teknoloji Planı (Hibe Numaraları, OO20190070), Hangzhou Tıp Bilimi ve Teknoloji nin anahtarı Projesi (Grant Numbers, 2014Z11) ve Hangzhou belediye nin sosyal gelişim ve bilimsel araştırma özerk uygulama projesi (Hibe Numaraları, 20191203B134).

1. Gün 1: Hücre Kültürü ve Tohumlama
<ol><li>%10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin (DMEM Complete Medium, DCM) 37 °C,%5 karbondioksit (CO2)inkübatörde yaklaşık %80'e kadar uyumludur. NOT: HEK 293T/17 düşük geçiş li hücreler önerilir.</li>
	<li>Hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) 1x ile dikkatlice yıkayın. NOT: HEK 293T/17 hücrelerinin elle kullanımı çok nazik olmalıdır, çünkü kolayca kopabilirler.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve hücreleri 1 mL %0,25 tripsin-etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile ayırın. Hücreleri ayrıştırılmış kadar en fazla 5 dakika için 37 °C,% 5 CO2 kuluçka makinesi çanak yerleştirin.</li>
	<li>5 mL DCM ekleyerek trypsin'i devre dışı bırakın. Hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak tek hücreli süspansiyoniçine dağıtın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlarını önceden ititli 15 mL santrifüj tüpe aktarın. 4 °C'de 5 dk için 250 x g'de santrifüj ile hücreleri toplayın.</li>
	<li>Mümkün olduğunca süpernatant kadar decant. 6 mL DCM orta hücre peletrere resuspend ve hücreleri saymak. Hücreleri DCM orta ile 1 x 106 hücre/mL'ye seyreltin.</li>
	<li>Hücreleri kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu ile 6 kuyu plakasına tohumlayın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sıvazlayın. Plakayı bir gecede (14-16 saat) 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. Gün 2: Lipofection Aracılı Dört plazmid Kotransfeksiyon
<ol><li>Ters ışık mikroskobu altında hücre morfolojisini ve yoğunluğunu kontrol edin. İdeal olarak, hücreler transfeksiyonda yaklaşık %85 oranında konpuz olmalıdır. Orta yı 1 mL serumsuz DMEM ortamı ile değiştirin ve tabağı kuvöze geri koyun. NOT: HEK 293T/17 hücrelerinin elle kullanımı çok nazik olmalıdır, çünkü kolayca kopabilirler.</li>
	<li>Kültürlenmiş hücrelerin her bir kuyusu için transfeksiyon reaktifinin 8 μL'sini Azaltılmış Serum Medium (tüp 1) ile 150 μL'lik bir hacme seyreltin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika (RT, yaklaşık 20 °C) için kuluçka. NOT: Her transfeksiyon numunesi için 1 ve 2 numaralı iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.</li>
	<li>Tüp 2'de, 2,5 μg plazmid DNA'sını 150 μL Azaltılmış Serum Medium'a seyreltin. NOT: Tüp 2'de, Tablo 1'degösterildiği gibi her plazmid DNA'sını seyreltin. Veziküler stomatit virüsü (VSV) G glikoprotein (plazmid pLP-VSVG) pozitif kontrol olarak kullanıldı, çünkü VSV çok çeşitli hücrelere bulaşabiliyor. Influenza zarf glikoproteinlerinden (Δenv pps) yoksun negatif kontrol parçacıkları pcDNA-Gag-Pol ve pcDNA-GFP plazmidleri kullanılarak üretildi.</li>
	<li>5 dk kuluçka sonra, seyreltilmiş DNA seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Hafifçe karıştırın ve RT başka bir 15 dakika kuluçka.</li>
	<li>Hücreleri ve serumiçermeyen ortamı içeren ilgili kuyuya DNA-lipid kompleksini ekleyin. Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın.</li>
	<li>37 °C'de 4-6 saat kuluçkadan sonra % 5 CO2 kuluçka makinesi, ortayı çıkarın ve 2 mL DMEM ile değiştirin. 37 °C,%5 CO2 kuluçka makinesinde 36-48 saat daha kuluçka. NOT: Serumsuz ve antikorsuz DMEM ile değiştirin. Bu protokolde, sekiz pps türü oluşturmak için iki HAs ve iki NAs kullanılabilir (Tablo 1'degösterilmiştir).</li>
</ol>3. Gün 3: Duyarlı Hücreler Tohumlama
<ol><li>Enfektelik tsay için, 96 iyi plaka iyi başına 1 x 104 hücreleri duyarlı hücrelerin her türlü tohum. NOT: Bu makalede enfekte lik tayini gerçekleştirmek için iki tür hedef hücre kullanın: alveolar türetilmiş insan hücre hattı (A549 hücreleri) ve Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri. MDCK hücreleri grip araştırmalarında yaygın olarak kullanılır ve iyi bir kontrol olabilir. Bu adım esnektir. Diğer hedef hücre hatları araştırma gereksinimlerine göre kullanılabilir.</li>
	<li>Plakayı bir gecede (14-16 saat) 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. Gün 4: Pseudotyped Viral Parçacık Toplama, Nicelik ve Enfekte Likitlik Testi
<ol><li>Psödotipli viral parçacık koleksiyonu<ol>
<li>Ortamın rengini kontrol edin. İdeal olarak, açık pembe veya biraz turuncu olmalıdır. Hücreleri 440-460 nm altında ters floresan biyolojik mikroskopla inceleyin.</li>
		<li>36-48 h posttransfection anda, hücre enkaz ortadan kaldırmak için 0,45 μm polivinilidene florür (PVDF) membran filtresi ile passaging tarafından pps hasat.</li>
		<li>Pps'yi küçük hacimli aliquots'a bölün.</li>
		<li>Pps'yi -80 °C'de saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ancak, pps enfekteliği donma ve çözülme sonra keskin bir düşüş olacaktır, çünkü bu teşvik edilmez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Psödotipli viral parçacık nicelleştirme<ol>
<li>20 μL saflaştırılmış pps'yi 1,5 mL ribonükleaz (RNase)-free microcentrifuge tüpüne aktarın.</li>
		<li>0,24 U/mL benzonaz nükleaz 1 μL ekleyin. Herhangi bir DNA ve RNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Hedef RNA, yaygın olarak aşağı regüle sitomegalovirüs (CMV)-GFP RNA, pps paketlenmiş ve benzonaz nükleaz tarafından bozulmuş önlemek olabilir.</li>
		<li>Benzonaz nükleazını inaktive etmek için örneği -70 °C'de dondurun.</li>
		<li>Zarf proteinlerini sindirmek ve CMV-GFP RNA'yı serbest bırakmak için 50 °C'de 30 dakika boyunca 2 μL proteinaz K. Kuluçka Makinesi ekleyin. 3 dakika boyunca 100 °C'de K proteinini inaktive edin.</li>
		<li>Bir Evrensel Sonda Tek AdımRT-qPCR Kiti ile gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon (qRT)-PCR ile pps ölçün, ileri astar 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', ters astar 5'-GGGTCTCTTCAGAGTGATTGACTAC-3', ve prob kullanarak 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3', Bir Gerçek Zamanlı PCR termocycler üzerinde. Enfekte olmadan önce RNA kopya numarası için pps normalleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfektelik tsası<ol>
<li>Her pps türünü qRT-PCR verileri açısından 4 x 105 kopya/mL (pp normalleştirme) seyreltin.</li>
		<li>Tosil-Fenilalanin Kloromilen-Keton (TPCK)-tripsin'i H7N9 HA'yı barındıran pps'lere 40 g/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. 37 °C'de 1 saat boyunca inkübasyon ile fonksiyonel alt birimleri HA1 ve HA2'yi oluşturur. NOT: HA1-HA2 dekolte sit alanında birden fazla arginin ve lizin kalıntısı olduğundan, H5'i TPCK-tripsin ile barındıran pps'lerin tedavisine gerek yoktur. Bu çok temel dekolte sitesi her yerde hücresel proteazlar tarafından yarık olabilir.</li>
		<li>Normalleştirilmiş pps'yi DMEM ortamı (serumsuz) ile 1:1 oranında (hacim/hacim) karıştırın.</li>
		<li>Hassas hücreleri içeren plakayı biyogüvenlik kabinesine getirin.</li>
		<li>Supernatant aspire ve önceden ısıtılmış PBS 0.1 mL ile bir kez hücreleri yıkayın.</li>
		<li>0,1 mL pps-DMEM karışımını bir kuyuya ekleyin. Her pps türünün enfektelik testlerini duyarlı bir hücre hattına üç eve ayırın (Şekil 2'degenel olarak).</li>
		<li>96 kuyu plakasını 37 °C,%5 CO2 kuluçka makinesinde 4-6 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Supernatant aspire ve DCM 0.1 mL ile değiştirin.</li>
		<li>96 kuyu plakasını 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde 24-36 h daha kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gün 5 veya 6: Enfekte Algılama
<ol><li>96 kuyu plakasını biyogüvenlik kabinesine getirin.</li>
	<li>Supernatant aspirate ve önceden ısınmış PBS 0.2 mL ile hücreleri 1x yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve 0,1 mL 0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile hücreleri ayırın.</li>
	<li>Hücreler ayrışına kadar 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin. NOT: 5 dakikadan fazla kuluçkaya yatmalısınız, çünkü bu hücre kümelemeye yol açacaktır.</li>
	<li>0,4 mL DCM ekleyerek trypsin'i devre dışı bırakın.</li>
	<li>Hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak tek hücreli süspansiyon içine dağıtın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlarını soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.</li>
	<li>Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ile GFP muhabiri pozitif hücreleri belirleyin. NOT: GFP muhabiri pozitif hedef hücrelerin oranını belirlemek için, kontrol örneklerini (pps-işlenmemiş A549 hücreleri veya MDCK hücreleri) kullanarak akış sitometre kapılarını ayarlayın ve ardından örnek başına 10.000 hücreden oluşan GFP muhabiri pozitif hücrelerini sayın.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, bir BSL-2 ayarında influenza virüs psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için bir yöntem açıklar. Muhabir plazmid pcDNA-GFP pps dahil ve bir enfektelik testi FACS tarafından pps ölçmek için kullanılabilir. Grip araştırmalarında yaygın olarak kullanıldığı için iki tür duyarlı hücre hattı seçtik. MDCK hücreleri bu çalışmalarda kullanılan değişken ölümsüzleştirilmiş insan hücrelerine iyi bir kontrol sağlayacaktır.
Bu protokol retrovirüs MLV dayanmaktadır, hangi bir GFP muhabiri dahil...

Viral bir parçacığın görevi, genomunu enfekte olmuş bir konak hücreden enfekte olmayan bir konak hücreye taşımak ve onu bir çoğaltma-yetkin form1'desitoplazmaya veya çekirdeğe ulaştırmaktır. Bu süreç başlangıçta konak hücre reseptörlerine bağlanması ile tetiklenir, virion ve hücre zarlarının füzyon u izledi. Grip virüsleri gibi zarflı virüsler için, başak glikoproteinler reseptör bağlama ve füzyonsorumludur 1,2. Viral zarf glikoproteinler (örneğin, pirojenler, antijenler), virüs yaşam döngüsü başlatma (bağlama ve füzyon), viral patogenez, immünojenite, konak hücre apoptozisi ve hücresel tropizm, hücresel endositik yol, yanı sıra interspecies iletim ve reassortment1,3,4,5,6,7gibi birçok önemli özellikleri ve olayları, yer almaktadır. Viral zarf glikoproteinler üzerinde araştırma bize viral enfeksiyon sürecinin birçok yönünü anlamamıza yardımcı olacaktır. Pseudotyped viral parçacıklar (pp), ayrıca pseudovirions veya psödo partikülleri olarak adlandırılan, bir psödotiplemetekniği8,9,10ile oluşturulabilir. Bu teknoloji hepatit C11,12,hepatit B13, vesiküler stomatit virüsü (VSV)14,15, ve grip virüsü16,17,18,19dahil olmak üzere birçok virüs, psödotipli parçacıklar geliştirmek için kullanılmıştır. Bu teknoloji lentiviruses veya diğer retrovirüslerin Gag-Pol protein dayanmaktadır.
Psödotipli viral parçacıklar, viral zarf glikoprotein ekspresyonu plazmidi, zarf env geni eksik retroviral ambalaj plazmidi ve pp üretici hücrelerine ayrı bir muhabir plazmid kotransfecting tarafından üç plazmid sistemi kullanılarak elde edilebilir. Retrovirüs gag proteini tarafından monte edilir ve virüs zarfprotein1ifade enfekte bir hücre zarından tomurcukları . Bu nedenle, influenza HA ve NA ifade eden bir hücresel membran üzerinde tomurcukları üretmek için retrovirus Gag proteinkullanarak yüksek titer influenza pps elde etmek mümkündür. Önceki çalışmalarımızda, tüm kombinasyonlarda HAs / NAs fonksiyonel ve viral yaşam döngüsü16,17,18,20,21karşılık gelen işlevlerini gerçekleştirmek mümkün idi. Bu pps grip biyolojik özelliklerini araştırmak için kullanılır, hemagglutination dahil, neuraminidaz aktivitesi, HA-reseptör bağlama tropizm, ve enfektivite. HA ve NA viral yaşam döngüsünde hem önemli yüzey fonksiyonel proteinler olduğundan, uyumsuz HAs ve NA'lar influenza farklı suşları türetilen kısmen aralarında reassortment gösterebilir. Burada, üç plazmid psödotipleme sistemi kullanarak, iki HAs ve iki NA 'yi (HPAI H5N1 suş ve H7N9 lekesinden türetilmiş) birleştirerek sekiz tür influenza pps üretiyoruz. Bu sekiz pps türü iki yerli pps içerir, H5N1pp, H7N9pp; iki eşleşmemiş pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; ve sadece tek bir glikoprotein (HA veya NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Grip virüsü üzerine yapılan çalışmalar, H5N1 ve H7N9 gibi biyogüvenlik gereksinimleri ile sınırlıdır. Yaban influenza virüs suşları ile ilgili tüm çalışmalar biyogüvenlik düzeyi 3 (BSL-3) laboratuarında yapılmalıdır. Psödotipli viral parçacık teknolojisi, yapay virion'u biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) ayarında paketlemek için kullanılabilir. Bu nedenle pps, iki büyük glikoproteinine bağlı olarak grip virüsü süreçlerini incelemek için daha güvenli ve yararlı bir araçtır: hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA).
Bu protokol, bu pps'lerin üretimini üç plazmid li kotransfeksiyon stratejisi (Şekil 1'degenel olarak), pps'nin nasıl ölçülecek ve enfektelik tespiti ile açıklar. PP üretimi üç çeşit plazmid içerir (Şekil 1). Retrovirüs Gag-Pol proteinini kodlayan gag-pol geni retrovirüs ambalaj kitinden klonlandı ve pcDNA 3.1 plazmidine yerleştirildi ve pcDNA-Gag-Pol olarak adlandırıldı. Yeşil Floresan Proteini kodlayan geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) geni pTRE-EGFP vektöründen klonlandı, pcDNA 3.1 plazmidine yerleştirildi ve pcDNA-GFP olarak adlandırıldı. Klonlama sırasında bir astar ile bir ambalaj sinyali () dizisi eklendi. HA ve NA genleri sırasıyla pVRC-HA ve pVRC-NA adı verilen bir pVRC plazmidine klonlandı. Son plazmid füzyon proteinini kodlar ve ilgi çekici başka bir füzyon proteini ile değiştirilebilir. Psödotipleme platformumuz iki glikoprotein ekspresyonu içerir: pVRC-HA ve pVRC-NA. Bu bir BSL-2 ayarında farklı virüs suşları arasında reassortment araştırma basitleştirebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Benzonaz Nükleaz</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>Etkili viskozite azaltma ve protein çözeltilerinden nükleik asitlerin uzaklaştırılması</td></tr><tr><td>Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren TC ile tedavi edilmiş Mikroplakalar (96 oyuklu)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Optimal hücre bağlantısı için tedavi edilmiştir Gama radyasyonu ile sterilize edilmiştir ve sertifikalı nonpirojenik Kuyu tanımlama</td></tr> <tr><td>için bireysel alfanümerik kodlarŞeffaf TC ile muamele edilmiş Çoklu Kuyu Plakaları (6 kuyucuklu)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Kuyu tanımlaması için bireysel alfanümerik kodlar Optimal hücre bağlanması için tedavi edilmiştir Gama ışınlaması ile sterilize edilmiştir</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş esansiyel ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Birçok farklı memeli hücresinin büyümesini desteklemek için yaygın olarak kullanılan bir bazal ortam</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Excell</td><td>FND500</td><td>Temel hücre kültürü, özel araştırmalar ve spesifik tahliller için mükemmel değer sunabilen fetal sığır serumları</td></tr><tr><td>Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS)</td><td>Beckman coulter</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>İnsan alveolar adenokarsinomu A549 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>İnsan embriyonik böbrek (HEK) HEK-293T/17 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Çok çeşitli yapışık ve süspansiyon hücre hatlarını etkili bir şekilde transfekte ettiği gösterilen çok yönlü bir transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Ters floresan biyolojik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>Ters ışık mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Hedef RNA hedeflerinin hızlı, hassas ve hassas prob tabanlı qPCR tespiti ve kantitasyonu.</td></tr><tr><td>Luna Üniversal Prob Tek Adımlı RT-qPCR Kiti</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>14.000 RCF 'ye kadar dayanacak RNase-/DNaz içermeyen Pirojenik Olmayan</td></tr><tr><td>Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Mikrosantrifüj Tüpü (1,5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, gama ile sterilize</td></tr><tr><td>edilmiş Millex-HV Şırınga Filtre Ünitesi, 0,45 & mikro; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>hücre büyüme hızında veya morfolojisinde herhangi bir değişiklik olmaksızın Fetal Sığır Serumu takviyesinin en az% 50 oranında azaltılmasına izin veren geliştirilmiş bir Minimal Esansiyel Ortamdır (MEM). Opti-MEM I ortamının ayrıca Lipofektamin reaktifi gibi katyonik lipid transfeksiyon reaktifleri ile kullanılması önerilir.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Besiyeri</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>Antibiyotikler penisilin ve streptomisin, gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı etkili kombine etkileri nedeniyle hücre kültürlerinin bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Maksimum RCF 12.500 xg Sıcaklık aralığı -80 &°C; C ila 120 & derece; C RNase-/DNase içermeyen Steril</td></tr><tr><td>PP Santrifüj Tüpleri (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>stabil ve oldukça reaktif bir serin proteazdır</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>Optimal hücre bağlanması için işlenmiştir Gama radyasyonu ile sterilize edilmiştir ve sertifikalı pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>TC ile muamele edilmiş Kültür Kabı (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Sığır pankreasından tripsin TPCK ile işlenmiş, esasen tuzsuz, liyofilize toz, & ge; 10.000 BAEE birimi/mg protein</td></tr><tr><td>TPCK-tripsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Tripsinin bu sıvı formülasyonu EDTA ve fenol kırmızısı içerir. Gibco Tripsin-EDTA, domuz pankreasından türetilen ışınlanmış bir proteaz karışımı olan tripsin tozundan yapılır. Sindirim gücü nedeniyle tripsin, hücre ayrışması, rutin hücre kültürü geçişi ve birincil doku ayrışması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrışma için gerekli olan tripsin konsantrasyonu, hücre tipine ve deneysel gereksinimlere göre değişir.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek patojenik h5n1 ve kuş h7n9 virüslerinden zarf glikoproteinleri ile yüksek titer enfeksiyöz İnfluenza pseudotyped partiküllerin Üretimi

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Son derece patojen kuş gribi A virüsü H5N1 (HPAI H5N1) ve H7N9 insanlar ve bunların öldürücü ara sıra doğrudan iletim ciddi halk sağlığı sorunları ve bir salgın olasılığını düşündürmektedir. Ancak, virüsün moleküler anlayışı ilkeldir ve zarf proteinlerinin biyolojik özelliklerini tedavi edici hedefler olarak incelemek ve enfeksiyonu kontrol etmek için stratejiler geliştirmek gereklidir. Kuş gribi virüsünü incelemek için katı bir viral psödotipli parçacık (pp) platformu geliştirdik, hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinlerin fonksiyonel analizi, HAs ve NA'ların reassortment özellikleri, reseptörler, tropizmler, nötralize antikorlar, tanı, enfektivite, ilaç geliştirme ve aşı tasarımı amacıyla. Burada, iki influenza A türünden (HAPI H5N1 ve 2013 kuş H7N9) zarf glikoproteinleri (HA, NA) ile pps oluşturmak için deneysel bir prosedür açıklıyoruz. Onların nesil murine lösemi virüsü (MLV) gibi bazı virüslerin kapasitesine dayanmaktadır, bir pp içine zarf glikoproteinler dahil etmek. Buna ek olarak, bu pps RT-qPCR ile nasıl ölçülür ve yerli ve uyumsuz virüs pps enfekte algılama HAs ve NA'ların kökenine bağlı olarak ayrıntılı. Bu sistem son derece esnek ve uyarlanabilir ve zarflı virüs başka bir tür dahil edilebilir zarf glikoproteinler ile viral pps kurmak için kullanılabilir. Böylece, bu viral parçacık platformu birçok araştırma araştırmalarında vahşi virüsleri incelemek için kullanılabilir.

Yukarıda açıklanan genel prosedüre bağlı olarak, iki grup HAs/NA'yı veya VSV-G glikoproteinini veya zarfsız glikoproteini birleştiren 10 tip pps ürettik (Tablo 1'degösterilmiştir). Yedisi bulaşıcı. Hiçbir zarf glikoprotein veya sadece liman NA barındıran pps burada herhangi bir enfektelik göstermedi. Grip pp üretim prosedürü Şekil 1'degenel olarak vebaktır. Pps iletim elektron mikrografları (örneğin, H5N1pp) Şekil 3'tegösterilmiştir. Bu pps'leri...

Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Grip viral PP üreten ve enfekte olduğunu belirleyen bu teknik bir BSL-2 şehirde grip virüsü araştırma basitleştirmek olabilir. PpS'nin qRT-PCR verilerine dayalı enfeksiyonlar için PPS'yi normalleştirdik. İki glikoprotein ekspresyonu plazmid kodlanır, bu da virüs reassortment araştırmabasitleştirebilirsiniz.Hücre tohumlamadan bir gün sonra, ters ışık mikroskobu altında hücre morfolojisini ve yoğunluğunu kontrol edin. İdeal olarak hücre transfeksiyonda yaklaşık %85 konfeksiyon olmalıdır. Orta yı her kuyuda bir mililitre serumsuz DMEM ile değiştirin ve tabağı kuvöze geri koyun.Hücrelerin her bir kuyunun transfeksiyon alabilen her bir kuyusu için, transfeksiyon reaktifinin sekiz mikrolitresini azaltılmış serum ortamına sahip 150 mikrolitrelik bir hacme seyreltin. Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Bu arada, azaltılmış serum orta 158 mikrolitre içine plazmid DNA 2.5 mikrogram seyreltin.Beş dakika kuluçka sonra, seyreltilmiş DNA seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirmek, yavaşça çözeltikarıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında bırakın. Serumiçermeyen ortamdaki hücrelerle ilgili kuyulara DNA lipid kompleksini ekleyin. Sonra yavaşça ileri geri sallayarak plaka karıştırın.Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle 4-6 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra ortayı çıkarın ve her kuyuda iki mililitre DMEM ile değiştirin. Sonra 36-48 saat daha kuluçkaya yat.Her bir duyarlı hücre türünü kuyu başına 10, 000 hücre ve 96 kuyu plakası ile tohumlayın. Sonra tabağı bir gecede 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit kuvözde bırakın. Transfeksiyondan sonraki üçüncü gün, pembe veya hafif turuncu renkte olması gereken ortamın rengini kontrol edin ve 440 ila 460 nanometre dalga boyu altında ters floresan biyolojik mikroskopla hücreleri inceleyin.Transfeksiyon sonrası 38 ila 48 saat sonra, hücre enkazını ortadan kaldırmak için 0,45 mikrometrelik poliviniliden florür membran filtresinden geçirerek pseuotyped partikülleri veya PPS'yi hasat edin, sonra bunları küçük hacimli aliquotlara bölün ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. PPS'yi ölçmek için saflaştırılmış viral parçacıkların 30 mikrolitresini 1,5 mikrolitrelik bir RNase içermeyen tüpe aktarın ve bir mikrolitre Benzonaz Çekirdeği ekleyin. Herhangi bir DNA ve RNA kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için tüpü 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, çekirdeği aktif leştirmek için numuneyi eksi 70 dereceye kadar dondurun ve karışımı iki mikrolitre Proteinaz K.Incubate ekleyip zarf proteinlerini sindirmek ve CMV-GFP RNA'yı serbest bırakmak için 30 dakika boyunca ekleyin. Sonra Proteinaz K'yi 100 derecede üç dakika boyunca etkisiz k. Metin el yazmasında belirtilen astar ve problarda Evrensel Sonda Tek AdımLı RT-qPCR Kiti'ni kullanarak PPS'yi nicel ters transkripsiyon RTPCR ile ölçün.PPS'yi mililitre başına dört kez 10 ila beşinci RNA kopyalarına normalleştirin. Daha sonra TPCK-trypsin'i mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyona h7N9 hemagglutinin barındıran PPS'ye ekleyin. PPS'yi 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın ve fonksiyonel ALT Birimler HA1 ve HA2'yi oluşturun.Normalleştirilmiş PPS'yi DMEM ortamı ile bire bir oranında karıştırın ve duyarlı hücreleri içeren plakayı biyogüvenlik kabinesine getirin. Supernatant aspire ve önceden ısıtılmış PBS 100 mikrolitre ile hücreleri bir kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre PPS-DMEM karışımı ekleyerek, her bir PPS tipinin enfekte liktestlerini hassas bir hücre hattına dönüştürün.Plakayı 4-6 saat 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Daha sonra süpernatant aspire ve 100 mikrolitre DCM inkübasyon plaka ile değiştirin başka bir 24-36 saat enfekte algılama önce. Sonuçlarımız PPS artık insanlar için bulaşıcı olarak kabul edilir.Bu nedenle, bir maske takmak ve biyogüvenlik kabininde enfekte liktaht denemeleri yapmak gibi gerekli koruma prosedürlerinin alınması önerilir. Bu protokol, iki gruplu hemaglutinin ve nöraminidaz vesiküler stomatit virüsü G glikoprotein veya zarf glikoproteinleri olmayan 10 tip psödotipli partikül veya PPS üretmek için üretilmiştir. PPS iletim elektron mikroskobu ile görüntülendi ve bunların enfekteliği A549 ve MDCK olmak üzere iki hücre hattında değerlendirildi.H5 barındıran PPS grubunda H5N1, H5 plus N9 ve H5'in enfekte liği sırasıyla %90%18 ve A549 hücre hattı için %10, MDCK için %40%5 ve %5 idi. H7 barındıran PPS grubunda H7N9, H7 plus N1 ve H7'nin enfekte liği sırasıyla %10 7 ve A549 hücre hattı için %1, MDCK için %8 4 ve %1 idi. Veziküler stomatit virüsü G glikoprotein PP'nin enfektivitesi A549 için %21, MDCK hücreleri için %16 idi.Delta zarf glikoproteinler pp ise hiçbir enfektelik gösterdi. PP üreticisi HEK-293T/17 hücrelerinin bu prosedürün temelini oluşturduğunu hatırlamak önemlidir. Yani optimal büyüme bize HEK-293T/17 hücrelerinin en önemli olduğunu öğretir.Bu yordamı veya L2 gibi başka bir testten sonra sınırlama testi yapılabilir. Bu test neredeyse reseptör tercihinin biyolojik özellikleri kurtulmak verebilir ve desen PPS tropism ortaya çıkaracaktır. Onlar influenza virüsü glikoproteinler aldı beri iki artı max klonlanır.HA ve NA proteinleri ayrı ayrı incelenebilir, bu yüzden aralarında yeniden çeşitlendirilebilir. Mutantlar ve olgun etkileri keşfedilebilir.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir memeli sisteminde grip virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) oluşumunu göstermektedir. Uygun memeli konakçı hücrelerinde farklı viral yapısal proteinleri kodlayan üç ökaryotik ekspresyon vektörünün eksprese edilmesinin ardından, eksprese edilen viral proteinler, konakçı plazma zarı üzerinde VLP'lere kendi kendine birleşir ve hücre yüzeyinden tomurcuklanma yoluyla salınır.

Bir memeli sistemi aracılığıyla influenza virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi için bir teknik

Video, soğuğa uyarlanmış rekombinant influenza virüsleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyor. İnsan hücrelerinin çift yönlü plazmitlerle transfekte edilmesini, ardından daha sıcak koşullarda azaltılmış replikasyon ile karakterize edilen aşı üretimine uygun virüsler elde etmek için daha düşük sıcaklıkta inkübasyonun inkübasyonunu içerir.

Aşılar için Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Virüslerinin Üretilmesi

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Biz bir yöntem tarafından grip A virüs viral hemagglutinin hedef insan veya fare monoklonal antikorlar bağlama için gerekli kritik artıkları tanımlamak açıklar. İletişim kuralı diğer virüs yüzey glikoproteinlerin ve onların karşılık gelen nötralize antikorlar için adapte edilebilir.

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Burada, pseudotyped parçacıklar spike protein yüksek patojenik virüs Ortadoğu solunum sendromu ve şiddetli akut solunum Sendromu coronaviruses birleştiren bir BSL-2 ayar oluşturmak için bir protokol mevcut. Pseudotyped bu parçacıklar hedef ana bilgisayar hücreler virüs girdiği miktar izin luciferase muhabir gen içerir.

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

Burada psödovirüs paketlemesi ve antikor nötralize edici aktivitenin ölçümü için bir protokol açıklanmaktadır.

Psödotip H5 Kuş Gribi Virüslerinin Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Yöntemi ile Hazırlanması ve Antikor Nötralize Edici Aktivitesinin Ölçülmesi

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Kuş Gribi Virüsler RNA, korumak, tespit ve sıra için bir yöntem doğrulanmış ve kuşların doğal dışkı örnekleri kullanarak uzatıldı. Bu teknik, bir soğuk zincir ve bulaşıcı virüslerin taşıma sürdürmenin gerekliliğini ortadan kaldırır ve 96-iyi bir yüksek verimli kurulum yapılabilir.

Kuş FTA Kartları İnfluenza Sürveyans: Alan Yöntemleri, Biyogüvenlik ve Ulaşım Sorunları çözüldü

Öğrenin, yüksek titerli enfeksiyöz influenza pseudotyped partiküller üretmek için H5N1 ve H7N9 zarf glikoproteinlerini kullanarak viral bulaşıcılığı değerlendirmeyi. Bu yöntem, BSL-2 ortamında güvenli viroloji araştırmaları sağlar.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi (Video) | JoVE Journal

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

Daha fazla video keşfet