Antisense Oligonükleotidlerin Klinik Çalışmalarında DMD Hasta Örneklerinde Exon Atlama Etkinliğinin Karakterize Edilmesi
7 Mayıs 2020
Burada klinik çalışmada Sanger sıralama, RT-PCR ve batı lekeleme kullanarak distrofin 38 ekspresyonunun moleküler karakterizasyonunu satMaktadır.
Bu protokol, DMD alanında güvenilir sonuçlar elde etmek için önemli olan klinik öncesi ortamlarda ve klinik çalışmalarda kas dokusunun hazırlanması ve işlenmesi için standart laştırılmış bir metodoloji sunmaktadır. Teknikler DMD için ekson atlama denemeleri için ilgilidir. Ve ana avantajı, onlar iyi kurulmuş ve topluca yürütülür eğer tekrarlanabilir olmasıdır.
Bu teknikler esas olarak DMD ekson atlama üzerinde duruldu, ancak astar değişikliği ile, aynı teknikler splicing tedavileri ile tedavi diğer hastalıklariçin uygulanabilir. Bu yöntemler hem rna hem de protein atlama verimliliğini sağlamak için kullanılabilir. Analiz için bir örnek hazırlamak için, ilk sakız yumuşak ve yapışkan hale gelene kadar tragacanth sakız ve su eşit hacimlerde karıştırın.
Bu karışımı 25 mililitrelik şırıngalara yükleyin ve 0,5 ila bir santimetre lik sakızı tek tek mantar disklerine dağıtın. Diskleri karşı tarafa etiketleyin ve sıvının bir kısmı donana kadar sıvı nitrojene bir kap isopentane yerleştirin. Mantara dik her kasın uzunlamasına ekseni ile diskler üzerinde tragacanth sakız içine her örnek yerleştirin.
Yerde kas tutmaya yardımcı olmak için her kas ın altına sakız yerleştirin ve soğuk isopentane örnekleri dondurmak için cımbız kullanın. Numuneleri geçici olarak kuru buza yerleştirmeden önce bir dakika veya tamamen donana kadar sürekli olarak hareket ettirin. Daha sonra, 80 santigrat depolama için cam şişeler içinde örnekleri yerleştirin.
Analiz için dondurulmuş kas dokusu bölüm için, 25 santigrat derece bir çalışma sıcaklığına bir kriyostat ayarlayın, ve tutucu üzerine kas bloğu monte etmek. Düz bölümler elde edilene kadar doku bloğunu kırpın. Ters transkripsiyon PCR ve Batı leke analizi için 10 mikrometre kalınlığında dilimler elde edin.
İmmünohistokimyasal analiz için, altı ila sekiz mikrometre kalınlığında dilimler elde etmek ve hematoksilin ve eozin boyama için, 10 ila 12 mikrometre kalınlığında dilimler elde. Onların edinimi sonra, iki mililitre tüpler dilimlenmiş bölümleri yerleştirin. PCR ve batı lekeleme için örnekleri 80 santigrat derecede saklayın.
Burada mikroçip elektroforez sistemi, ters transkriptaz PCR reaksiyonlarının jel görüntüleri ve bir doz yükseltme fazı bir çalışmada antisense oligonükleotid ile tedavi öncesi ve sonrası iki hastadan atlanan bandın sekanssonuçları gösterilmiştir. Her iki hastada da silme ler var. Beklendiği gibi, tedaviden önce, her iki hastada da atlama yoktu ve sadece atlanamayan bir bant görüntülenemedi.
Tedavinin 12 hafta sonra, net bir atlanan alt bant ikinci hasta için görselleştirilmiş, ancak, hala ilk hasta için herhangi bir atlanan ürün tespit etmek zordu. Sıralama sonuçları ikinci hasta için 47 ve 54 ekstremite, ilk hasta için ise 44 ve 54 ekstremite ler gösterdi. Atlanan yüzdeyi hesaplamak için, atlanan bandın molar konsantrasyonu atlanan ve atlanmamış bantlara bölündü.
Beklendiği gibi, tedavi öncesi Western blot tarafından distrofin bandı saptanmadı. Tedaviden sonra, sağlıklı kontrolde gözlenene göre daha düşük molekül ağırlığına sahip ikinci hastadan bir bant saptandı. Ancak ilk hastada tedavi den sonra tespit edilebilir distrofin düzeyleri saptanmadı.
Bu doğru kas dokusu işlemek için önemlidir, ve tutarlı bir şekilde tragacanth sakız üzerinde her örnek yerleştirmek için. Doku bölümleri pcr yapay, dijital PCR, Batı leke, immünohistokimya ve omik farklı türleri de dahil olmak üzere farklı şekillerde bir dizi analiz edilebilir. Bu teknikler, farklı eksyonları hedefleyen ilaçların geliştirilmesi, geliştirilmesi, ek ekson atlama ve viral tabanlı ve dmd için düzenleme tekrar geliştirilmesi için uygulanabilir hızlandırılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, Duchenne Musküler Distrofisi (DMD) ile ilgili klinik araştırmalarda kas dokusunun hazırlanması ve işlenmesi için standardize edilmiş bir metodoloji sunmaktadır. Odak noktası, etkili tedaviler geliştirmek için kritik öneme sahip olan ekson atlama teknikleridir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Klinik Çalışmalar
Arka Plan
- Duchenne Musküler Distrofisi (DMD), şiddetli bir kas yıkımı hastalığıdır.
- Ekzon atlama, DMD için gelecek vaat eden bir terapötik yaklaşımdır.
- Doğru deneysel sonuçlar için güvenilir doku işleme işlemleri esastır.
- Standartlaştırılmış yöntemler, araştırmalarda tekrarlanabilirliği artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kas dokusu hazırlama için güvenilir bir protokol oluşturmak.
- DMD için ekzon atlama deneylerini kolaylaştırmak.
- Splicing terapileri ile tedavi edilen diğer hastalıklar için uygulanabilir bir çerçeve sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tragakanç gamı ve izopentan kullanılarak kas dokusunun hazırlanması.
- Analiz için kas örneklerinin dondurulması ve kesitlenmesi.
- Distrofin ekspresyonunun saptanması için ters transkriptaz PCR ve Western blotting.
- Ekzon atlama verimliliğini analiz etmek için dizileme.
Temel Sonuçlar
- Tedavi edilen hastalarda atlanan bantların başarılı şekilde görselleştirilmesi.
- Tedavi sonrası bir hastada distrofin saptanması.
- Hastalar arasında tedaviye verilen yanıtta değişkenlik.
- Doğru sonuçlar için tutarlı doku işlemenin önemi vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Standardize edilmiş yöntemler, DMD tedavilerinin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Ekzon atlama potansiyel göstermektedir ancak daha fazla optimizasyon gerektirmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, daha geniş uygulamalar için bu yöntemler üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, DMD hastası örneklerinde ekson atlama verimliliğini değerlendirmek için standartlaştırılmış bir iş akışı belirleyerek, antisense oligonükleotid geliştirmedeki hedef doğrulamayı doğrudan desteklemektedir. Moleküler restorasyonun kantitatif ölçümüne olanak tanıyarak, viltolarsen gibi 53. ekson atlama tedavileri için mekanistik risk azaltma sağlar. Bu yaklaşım, biyokimyasal okumaları terapötik mekanizmaya bağlayarak, preklinikten kliniğe geçişteki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sindeki Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hasta kaynaklı örneklerde, antisense oligonükleotid aracılı ekzon atlamasının terapötik bir hipotez olarak sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef üzerindeki moleküler aktiviteyi doğrulamak için tekrarlanabilir Sanger dizileme, RT-PCR ve Western blot yöntemleri sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Ekzon atlama verimliliğinde doz-yanıt değerlendirmesi için nicel atlanmış-toplam bant oranları üretir.
- Operasyonel Değer: Preklinik ve klinik örnek setleri genelinde analiz tekrarlanabilirliğini sağlamak için doku hazırlama ve kesit alma protokollerini standartlaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Gerçek hasta kas biyopsilerinde distrofin restorasyonunu karakterize ederek hastalıkla ilgili sistem analizlerini destekler.
- Operasyonel Değer: Model sistemler genelinde tutarlı moleküler okumalar kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
İş Akışı ve Hat Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, fonksiyonel etkinlik testlerinden önce mekanizmanın moleküler düzeyde onaylanmasını sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Hasta örneklerinde hedefle uyumlu ekzon ekleme düzeltmesini doğrulayarak, antisense oligonükleotidler için hipotez doğrulamasını destekler.
- Tarama: Jel görüntüleme ve sekanslama yoluyla kantitatif ekzon atlama yüzdeleri sunarak bileşiklerin karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analizler: Dozlar ve hastalar arası karşılaştırmalı analizler için molar konsantrasyon tabanlı atlanmış bant kantifikasyonu sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Moleküler ekzon atlamasını distrofin protein saptamasıyla ilişkilendirerek, RNA düzeyindeki mekanizma ile protein düzeyindeki sonuç arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla ekzon hedefi ve ekleme tedavileri için uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir doku işleme ve analiz çerçevesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İnsan dokusunda ekzon atlanmasının ve distrofin restorasyonunun doğrudan görselleştirilmesi yoluyla mekanistik risklerin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış tragakant zamkı gömme ve kriyoseksiyon işlemleri, örnek tutarlılığını sağlar ve değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel son noktalar öncesinde hedef etkileşimine dair moleküler kanıtlar sunarak devam/dur kararlarına bilgi sağlar.
- Portföy Etkisi: İlgili hasta genotiplerindeki ekzon atlanma verimliliğine dayanarak antisense oligonükleotidlerin riskle ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- RT-PCR, Western blotting ve Sanger dizileme dahil olmak üzere moleküler biyoloji tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Doku kesimi için kriyostat ekipmanına ve hızlı dondurma için sıvı azot/izopentana bağımlıdır.
- Farklı merkezler veya zaman noktaları arasında örnek bütünlüğünü korumak için standardize edilmiş doku işleme protokollerini gerektirir.
- Ekzon atlama tespitine yönelik primerler tasarlanırken hastaya özgü mutasyonlardaki değişkenlikler dikkate alınmalıdır.
- Dijital PCR veya kapiler elektroforez doğrulaması olmaksızın, jel tabanlı yöntemlerin yarı nicel doğasıyla sınırlıdır.
