2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti
23 Haziran 2020
Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.
Bu yöntem, sadece floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel reaktif oksijen türlerini analiz etmek ve floresan levha okuyucu ile reaktif oksijen türlerinin yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir. DMEM'deki beşinci HCT116 kolorektal kanser hücrelerini 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya iki kez 10 ila 5 kat tohumlayarak başlayın.
Hücreleri bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 100 mikromolar demir sülfat veya 10 mikromolar doksorubisin içeren orta ile kültür ortamı değiştirin ve başka bir 24 saat boyunca plaka kuluçka. 10 milimolar stok çözümü yapmak için bir mililitre DMSO'da 4,85 miligram DCFH-DA eriterek DCFH-DA çözeltisini hazırlayın.
Kuyulara eklemeden hemen önce, 10 mikromolar çalışma çözeltisi yapmak için önceden ısıtılmış DMEM ile stok seyreltin ve 10 saniye girdap. Hücreleri lekelemek için, ilaç içeren ortamı çıkarın ve dmem ile bir kez yıkayın. Her kuyuya 500 mikrolitre DCFH-DA çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, DCFH-DA'yı kuyulardan çıkarın ve iki kez DMEM ile ve bir kez de PBS ile yıkayın. Daha sonra, her kuyuya 500 mikrolitre PBS ekleyin. Hücrelerin temsili görüntülerini çekmek için floresan mikroskoptaki yeşil floresan protein kanalını kullanın.
Sonra PBS çıkarın ve her kuyuya radyoimmünopremit analiz tampon200 mikrolitre ekleyin. Plakayı beş dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın ve hücre lisatlarını 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri 21, 130 kez G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Sonra 100 mikrolitre süpernatantı siyah 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. Her kuyudaki floresansı ölçmek için 485 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda ve 530 nanometre lik bir emisyon dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitre protein istiyatçözeltisi çözeltisi ile süpernatantın bir mikrolitresini 96 kuyulu bir plakaya aktararak Bradford tsay ile protein konsantrasyonu ölçün.
Floresan yoğunlukları normalleştirmek için protein konsantrasyonları kullanın. HCT116 kolorektal kanser hücreleri oksidatif strese neden olmak için 100 mikromolar demir sülfat veya 10 mikromolar doksorubisin ile tedavi edildi. Beklendiği gibi, yeşil floresan önemli ölçüde her iki tedavi ile artmıştır.
Göreceli yoğunluk değişimlerini ölçmek için hücreler protein konsantrasyonları ile normalleştirildi. Göreceli floresan yoğunluğu demir sülfat veya doksorubisin ile önemli ölçüde artmıştır. Bu yordamı gerçekleştirirken, DCFH-DA çözümünü taze yapmak ve ışığa maruz kalmaktan kaçınmak, hücre durumu bozukluğunü en aza indirmek ve görüntü almadan hemen önce kapsamlı PBS yıkama yapmak önemlidir.
Bu protokol ile toplam ROS tespitine ek olarak, özellikle peroksit gibi ROS yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, DCFH-DA kullanarak toplam hücresel reaktif oksijen türlerinin (ROS) saptanması için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, adherent hücrelerde ROS lokalizasyonunun görselleştirilmesine ve ROS yoğunluğunun kantifikasyonuna olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Reaktif Oksijen Türleri Analizi
- Floresan Mikroskopi
Arka Plan
- Reaktif oksijen türleri, hücresel sinyal iletiminde kritik bir rol oynar.
- ROS lokalizasyonunun anlaşılması, hücresel süreçlere dair içgörüler sağlayabilir.
- ROS tespiti için yaygın olarak floresan teknikleri kullanılır.
- Bu protokol, kullanım kolaylığı ve maliyet etkinliği için tasarlanmıştır.
Çalışmanın Amacı
- Adherent hücrelerde ROS tespiti için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Floresan mikroskobu kullanarak ROS'un görselleştirilmesini ve miktarının belirlenmesini sağlamak.
- Alandaki araştırmacılar için süreci basitleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- HCT116 kolorektal kanser hücrelerinin 24 kuyucuklu plakaya ekilmesi.
- Hücrelerin ferrous sülfat veya doksorubisin ile inkübe edilmesi.
- ROS tespiti için DCFH-DA solüsyonunun hazırlanması.
- Analiz için floresan mikroskobu ve plaka okuyucu kullanılması.
Temel Sonuçlar
- Hücrelerdeki ROS lokalizasyonunun başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- ROS yoğunluğunun kantifikasyonu, yöntemin etkinliğini kanıtlamıştır.
- Protokolün araştırmacılar için basit ve verimli olduğu ortaya çıkmıştır.
- Hücresel çalışmalarda ROS analizi için maliyet etkin bir yaklaşım.
Sonuçlar
- Protokol, ROS tespiti için basit bir yöntem sunmaktadır.
- Çeşitli adherent hücre tiplerine uygulanabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, hücresel mekanizmalar hakkında daha derin bilgiler edinmek için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Yapışkan hücrelerde DCFH-DA boyaması kullanılarak toplam reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif tespiti, hastalık modelleme ve ilaç yanıt çalışmalarında temel bir faktör olan oksidatif stres için standartlaştırılmış bir okuma sağlar. Bu yöntem, kimyasal veya genetik pertürbasyonlar sonrası hücresel redoks durumunun sağlam bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak, erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma ve hedef doğrulama süreçlerini destekler. Maliyet etkinliği ve ölçeklenebilirliği, bu yöntemi yüksek kapasiteli tarama ve translasyonel iş akışlarına entegrasyon için uygun hale getirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalıkla ilişkili hücre modellerinde oksidatif stres yolaklarının kantitatif sorgulanmasına olanak tanır.
- Hücresel redoks dengesini modüle eden hedeflerin fonksiyonel doğrulamasını destekler.
- Bileşik veya genetik müdahaleleri ROS çıktısına bağlayarak mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Adheran hücrelerde ROS kantifikasyonu için tekrarlanabilir, floresan tabanlı bir analiz yöntemi sağlar.
- Protein konsantrasyonu ölçümleri kullanılarak analiz standardizasyonu ve normalizasyonunu destekler.
- Tarama çalışmaları için bileşik kaynaklı oksidatif stresin güvenilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel biyobelirteç geliştirme için oksidatif stres çıktılarını hastalık modelleriyle uyumlu hale getirir.
- Redoks modüle eden ajanların in vitro keşfinden preklinik validasyonuna kadar olan sürekliliği destekler.
- Oksidatif mekanizmalarla ilişkili bileşik güvenliği ve etkinliği için öngörücü değer sunar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu DCFH-DA tabanlı ROS tespit protokolü, hücresel sistemlerdeki oksidatif stres modülasyonu için kantitatif bir okuma sağlayarak, erken keşiften öncü bileşik belirleme sürecine kadar olan aşamalara uygunluk gösterir.
- Keşif Biyolojisi: Redoks ile ilişkili hedeflerin ve yolakların hipotez testlerini mümkün kılar.
- Tarama: Bileşik seçimi için standardize edilmiş, kantitatif ROS ölçümleri sağlar.
- Analitik: Güçlü veri karşılaştırması için floresan yoğunluğu normalizasyonunu entegre eder.
- Translasyonel Araştırma: In vitro oksidatif stres bulgularını preklinik model doğrulamasına bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hücre tipleri ve müdahaleler için geniş kapsamlı uygulanabilir, maliyet etkin bir assay sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Redoks biyolojisi ve hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir iş akışlarıyla ROS miktar tayinini optimize eder.
- Stratejik Değer: Müdahaleleri oksidatif stres sonuçlarıyla ilişkilendirerek karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Redoks modüle eden varlıkların riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Floresan mikroskopi ve plaka okuyucu kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Standart hücre kültürü ve protein miktar belirleme altyapısına erişim gereklidir.
- Işık kaynaklı bozulmayı önlemek için DCFH-DA reaktifinin dikkatli bir şekilde uygulanması gerekir.
- Yıkama ve normalizasyon adımlarının standartlaştırılması, tekrarlanabilirlik açısından kritiktir.
- Protokol çeşitli adherent hücre hatlarına uyarlanabilir ancak spesifik modeller için optimizasyon gerektirebilir.
