Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Bu protokol, GPCR agonistinin bir hücre popülasyonundan tam bir fonksiyonel konsantrasyon yanıt ilişkisinin kaydedilmesini sağlar ve düşük hücre lisayı ları için bile ayrıntılı agonist karakterizasyonu sağlar. Seri dozlamanın en büyük avantajı, tek bir kuyu tam konsantrasyon yanıt analizi için yeterli olduğundan, üretim artışıdır. Bu teknik, kapalı mikroakışkan kaplarda organ-on-chip biçimleri gibi nadir ve karmaşık biyolojik modellerde tek transdüksiyon çalışması için uygundur.

Uygun ekipman mevcut olduğu koşuluyla protokolü gerçekleştirmek zor değildir. Çeşitli GPCR ligand çözeltilerini doğru konsantrasyonda hazırlamak başarının anahtarıdır. Michael Skiba, bir lisans üstü öğrenci, ve Anne Mildner, bir lisans öğrencisi, bizim laboratuvardan prosedürü gösterecektir.

Elektrot dizileri üzerine hücre tohumlama için, her elektrot dizisinin kuyularına uygun hücre konsantrasyonu ekleyin ve hücrelerin oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca kuyu diplerine homojen bir şekilde yerleşmelerine izin verin. Standart hücre kültürü kuvözde en az 36 saat kuvözde 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit ten sonra, her elektrotun hücrelerle tam bir kapsama alanı sağlamak için faz kontrastlı mikroskobu ile hücre katmanlarını inceleyin. Daha sonra her kuyudaki hücre kültür ortamını önceden ısıtılmış, serumsuz ortamın uygun hacmiyle değiştirin.

Empedans kaydı başlatmak için elektrot dizisini empedans analizörün bağlantı dizisi tutucuya yerleştirin ve elektrotlar ile empedans analizörü arasında uygun bir düşük empedans teması doğrulayın. Yazılımın kullanıcı arabirimindeki elektrot türünü ve/veya çok iyi biçimini seçin. Tek ve birden çok frekanslı veri toplama modları varsa ve analiz edilecek kuyu sayısı düşükse veya zaman çözünürlüğü kritik değilse, birden çok frekans kaydı seçin.

Maksimum zaman çözünürlüğü sağlamak için tek bir izleme frekansı seçin. Ardından, zaman ders verilerinin edinimine başlayın ve verileri nerede kaydedebileceğiniziçin veri klasörünü seçin. Empedans okumaları her kuyu için belirtilen sayıda frekansta kaydedilecek Sekiz kuyulu bir dizi için agonist modda seri ekleme protokolünü başlatmak için, hücrelere ilgi agonist en düşük konsantrasyon30 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra agonistin her seri seyreltme eklenene kadar bir sonraki en yüksek konsantrasyonun 30 mikrolitresini eklemeden önce hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre boyunca dengelemelerine izin verin. Verileri çözümlemek için agonist çözümün ilk eklenmesinden önce son veri noktasının empedansını çıkarın ve empedans değerlerini normalleştirmek için ekleme sıfır saatini ayarlayın. Normalleştirilmiş empedans zaman ders arsa ve her ekleme adımından sonra empedans maxima tanımlamak için bireysel zaman kursları arsa.

Bu değerlerle bir veri sayfası oluşturun ve agonist konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak maksimum empedans değişiminin değerlerini çizin. Daha sonra dört parametreli lojistik modeli kullanarak yarı maksimal etkili konsantrasyonları ve maksimum yanıtı belirlemek için veri uydurma yordamı kullanın. Bu temsili deneyde, histamin konsantrasyonlarını artıran 10 çözelti her 15 dakikada bir hücrelere sırayla eklenmiştir ve her zaman empedansdeğişimi ölçüldü.

Empedans değişiklikleri daha sonra histamin konsantrasyonunun bir fonksiyonu ve yedi kuyudan deneysel veri noktalarına takılan dört parametrelik bir lojistik modelin aktarım fonksiyonu olarak çizilebilir. Olası histamin reseptör downregülasyonu, hücre duyarsızlaştırma, ya da aşırı stimülasyon için hesap, analiz için veri aralığı azaltılabilir, Bu tek seri dosing deney için gösterildiği gibi. Üç parametre optimizasyonu daha sonra verilere uygulanabilir ve bu analiz için 0,75 artı veya eksi 0,12 mikromolar yarım maksimal etkin konsantrasyon sağlanabilir.

Histamin reseptör antagonisti difenhidramin in eklenmesi 20 dakika önce ilk histamin seri dozlama düzeni içinde empedans gecikmeli bir artış ile sonuçlanır, bir hücre yanıtı ortaya çıkarmak için daha yüksek bir agonist için ihtiyaç karşılık. Doz yanıt ilişkisinde, antagonistin etkisi eğrilerin sağa kayması olarak ifade edilir, yarı maksimal etkin konsantrasyonda bir artışa karşılık gelen, antagonisti agonist göre rekabetçi bir ligand olması koşuluyla. Seri dosing şemasının başarılı bir şekilde uygulanması teknik olarak kolaydır, ancak doğru zamanlama ile tüm adımları gerçekleştirmek zor olduğu için düşünceli planlama gerektirir.

Seri dosing paralel olarak izlenen numune sayısı ile sınırlı diğer okuma sistemleri ile konsantrasyon yanıt çalışmaları gerçekleştirmek için yol açmıştır. Seri dosing belirli avantajları sitomekanik gibi diğer henotik değişikliklere duyarlı tamamen yeni okumalar ile reseptör aracılı sinyal transdüksiyon çalışma sağlar. Lütfen reseptör agonisinin stok çözümlerini hazırlarken eldiven ve gözlük takın, çünkü solunduğunda veya yutulduğunda tehlikeli olabilirler.