Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü
21 Şubat 2020
Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.
Bu protokol, GPCR agonistinin bir hücre popülasyonundan tam bir fonksiyonel konsantrasyon yanıt ilişkisinin kaydedilmesini sağlar ve düşük hücre lisayı ları için bile ayrıntılı agonist karakterizasyonu sağlar. Seri dozlamanın en büyük avantajı, tek bir kuyu tam konsantrasyon yanıt analizi için yeterli olduğundan, üretim artışıdır. Bu teknik, kapalı mikroakışkan kaplarda organ-on-chip biçimleri gibi nadir ve karmaşık biyolojik modellerde tek transdüksiyon çalışması için uygundur.
Uygun ekipman mevcut olduğu koşuluyla protokolü gerçekleştirmek zor değildir. Çeşitli GPCR ligand çözeltilerini doğru konsantrasyonda hazırlamak başarının anahtarıdır. Michael Skiba, bir lisans üstü öğrenci, ve Anne Mildner, bir lisans öğrencisi, bizim laboratuvardan prosedürü gösterecektir.
Elektrot dizileri üzerine hücre tohumlama için, her elektrot dizisinin kuyularına uygun hücre konsantrasyonu ekleyin ve hücrelerin oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca kuyu diplerine homojen bir şekilde yerleşmelerine izin verin. Standart hücre kültürü kuvözde en az 36 saat kuvözde 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit ten sonra, her elektrotun hücrelerle tam bir kapsama alanı sağlamak için faz kontrastlı mikroskobu ile hücre katmanlarını inceleyin. Daha sonra her kuyudaki hücre kültür ortamını önceden ısıtılmış, serumsuz ortamın uygun hacmiyle değiştirin.
Empedans kaydı başlatmak için elektrot dizisini empedans analizörün bağlantı dizisi tutucuya yerleştirin ve elektrotlar ile empedans analizörü arasında uygun bir düşük empedans teması doğrulayın. Yazılımın kullanıcı arabirimindeki elektrot türünü ve/veya çok iyi biçimini seçin. Tek ve birden çok frekanslı veri toplama modları varsa ve analiz edilecek kuyu sayısı düşükse veya zaman çözünürlüğü kritik değilse, birden çok frekans kaydı seçin.
Maksimum zaman çözünürlüğü sağlamak için tek bir izleme frekansı seçin. Ardından, zaman ders verilerinin edinimine başlayın ve verileri nerede kaydedebileceğiniziçin veri klasörünü seçin. Empedans okumaları her kuyu için belirtilen sayıda frekansta kaydedilecek Sekiz kuyulu bir dizi için agonist modda seri ekleme protokolünü başlatmak için, hücrelere ilgi agonist en düşük konsantrasyon30 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra agonistin her seri seyreltme eklenene kadar bir sonraki en yüksek konsantrasyonun 30 mikrolitresini eklemeden önce hücrelerin yanıt vermesine ve önceden tanımlanmış bir süre boyunca dengelemelerine izin verin. Verileri çözümlemek için agonist çözümün ilk eklenmesinden önce son veri noktasının empedansını çıkarın ve empedans değerlerini normalleştirmek için ekleme sıfır saatini ayarlayın. Normalleştirilmiş empedans zaman ders arsa ve her ekleme adımından sonra empedans maxima tanımlamak için bireysel zaman kursları arsa.
Bu değerlerle bir veri sayfası oluşturun ve agonist konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak maksimum empedans değişiminin değerlerini çizin. Daha sonra dört parametreli lojistik modeli kullanarak yarı maksimal etkili konsantrasyonları ve maksimum yanıtı belirlemek için veri uydurma yordamı kullanın. Bu temsili deneyde, histamin konsantrasyonlarını artıran 10 çözelti her 15 dakikada bir hücrelere sırayla eklenmiştir ve her zaman empedansdeğişimi ölçüldü.
Empedans değişiklikleri daha sonra histamin konsantrasyonunun bir fonksiyonu ve yedi kuyudan deneysel veri noktalarına takılan dört parametrelik bir lojistik modelin aktarım fonksiyonu olarak çizilebilir. Olası histamin reseptör downregülasyonu, hücre duyarsızlaştırma, ya da aşırı stimülasyon için hesap, analiz için veri aralığı azaltılabilir, Bu tek seri dosing deney için gösterildiği gibi. Üç parametre optimizasyonu daha sonra verilere uygulanabilir ve bu analiz için 0,75 artı veya eksi 0,12 mikromolar yarım maksimal etkin konsantrasyon sağlanabilir.
Histamin reseptör antagonisti difenhidramin in eklenmesi 20 dakika önce ilk histamin seri dozlama düzeni içinde empedans gecikmeli bir artış ile sonuçlanır, bir hücre yanıtı ortaya çıkarmak için daha yüksek bir agonist için ihtiyaç karşılık. Doz yanıt ilişkisinde, antagonistin etkisi eğrilerin sağa kayması olarak ifade edilir, yarı maksimal etkin konsantrasyonda bir artışa karşılık gelen, antagonisti agonist göre rekabetçi bir ligand olması koşuluyla. Seri dosing şemasının başarılı bir şekilde uygulanması teknik olarak kolaydır, ancak doğru zamanlama ile tüm adımları gerçekleştirmek zor olduğu için düşünceli planlama gerektirir.
Seri dosing paralel olarak izlenen numune sayısı ile sınırlı diğer okuma sistemleri ile konsantrasyon yanıt çalışmaları gerçekleştirmek için yol açmıştır. Seri dosing belirli avantajları sitomekanik gibi diğer henotik değişikliklere duyarlı tamamen yeni okumalar ile reseptör aracılı sinyal transdüksiyon çalışma sağlar. Lütfen reseptör agonisinin stok çözümlerini hazırlarken eldiven ve gözlük takın, çünkü solunduğunda veya yutulduğunda tehlikeli olabilirler.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanarak tek bir hücre popülasyonundan GPCR agonistinin eksiksiz bir fonksiyonel konsantrasyon yanıt ilişkisinin kaydedilmesini sağlar. Seri dozlamanın temel avantajı, tam bir konsantrasyon yanıt analizi için tek bir kuyucuğun yeterli olması nedeniyle verimliliğin artmasıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Farmakoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- GPCR'ler hücresel sinyalizasyonda kritik bir rol oynar.
- Agonistle tetiklenen aktivasyonun anlaşılması, ilaç geliştirme için esastır.
- Geleneksel yöntemler daha büyük hücre örnekleri gerektirebilir.
- Bu protokol, nadir ve karmaşık biyolojik modeller için uygundur.
Çalışmanın Amacı
- GPCR aktivasyonunun gerçek zamanlı kaydını göstermek.
- Detaylı agonist karakterizasyonu sağlamak.
- Konsantrasyon yanıt analizinde işlem hacmini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Etiketsiz empedans ölçümleri.
- GPCR ligandlarının seri dozlaması.
- Tekli mikroelektrot kurulumu.
- Uygun konsantrasyonlarda ligand çözeltilerinin hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Tam doz-yanıt ilişkilerinin başarılı şekilde kaydedilmesi.
- Zaman çözünürlüğünde kayıp olmaksızın artırılmış işlem kapasitesi.
- Düşük hücre örnek sayılarıyla kanıtlanmış uygulanabilirlik.
- Mikroakışkan kaplardaki organ-on-chip formatlarına uygulanabilirlik.
Sonuçlar
- Bu protokol, karmaşık modellerde GPCR'lerin incelenmesini geliştirmektedir.
- Agonist karakterizasyonu için güvenilir bir yöntem sunar.
- Gelecekteki uygulamalar çeşitli biyolojik araştırma alanlarını kapsayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
İşaretlemesiz empedans tabanlı GPCR analizleri, elektrot dizisi maliyetleri ve ardışık kuyucuk kayıt kısıtlamaları nedeniyle doz-yanıt çalışmalarında verimlilik sınırlamalarıyla karşı karşıyadır. Seri agonist ekleme protokolü, tek bir hücre tabakasından tam konsantrasyon yanıt eğrilerinin elde edilmesini sağlayarak, gerçek zamanlı izlemeyi sürdürürken analiz çıktısını önemli ölçüde artırır. Bu yaklaşım, biyolojik örnek gereksinimlerini azaltarak ve erken keşif iş akışlarında veri verimliliğini artırarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Minimum hücre örnekleri üzerinden tam doz-yanıt karakterizasyonu sağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Çok noktalı analizleri tek kuyucuklu formatlarda birleştirerek reaktif ve elektrot dizisi tüketimini azaltır.
- Öngörü Güveni: Seri agonist eklemeleri yoluyla kantitatif EC50 ve etkinlik ölçümleri sağlayarak öncü bileşik tanımlamasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Agonist ve antagonist mod profilleme için tekrarlanabilir, zamana bağlı empedans okumaları sağlar.
- Operasyonel Değer: Mikrotiter plaka formatlarında seri dilüsyon hazırlama için otomatik sıvı aktarım sistemleriyle uyumludur.
- Deney Standardizasyonu: Ardışık dozlama adımları boyunca tutarlı temel çizgi normalizasyonu ve maksimum değer tespiti sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Sistem: Fizyolojik olarak anlamlı modellerdeki rekombinant ve endojen GPCR ekspresyon seviyeleri için uygulanabilir.
- Translasyonel Biyobelirteç: Empedans değişimlerini reseptör aktivasyon durumlarıyla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Preklinik Model Sürekliliği: Örnek miktarının sınırlı olduğu organ-on-chip ve mikroakışkan sistemlerde tarama hazırlığını kolaylaştırır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Seriyel dozlama yöntemi, özellikle örnek tasarrufunun ve analiz verimliliğinin kritik olduğu durumlarda, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: GPCR aktivasyon kinetiğinin gerçek zamanlı izlenmesi yoluyla yolak aydınlatmasını ve fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Tarama: Daha az kuyucuk tüketimi ile yüksek içerikli agonist profillemeye olanak tanıyarak plaka kullanım verimliliğini artırır.
- Analitik: Doz-yanıt ilişkilerinin dört parametreli lojistik modellemesi için bağımlı değişkenler olarak kantitatif empedans maksimumları sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Düşük hücre sayılı sistemlerden güvenilir agonist potens verileri üreterek preklinik ilerlemeye katkıda bulunur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla GPCR hedefi ve kuplaj tipi genelinde seri ligand eklemi için yeniden kullanılabilir, empedans tabanlı bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tekil popülasyonlardan elde edilen kapsamlı agonist karakterizasyonu yoluyla hedef doğrulama süreçlerindeki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Doz-yanıt eğrisi başına kullanılan tek kullanımlık elektrot dizisi miktarını minimize ederek işlem kapasitesini ve maliyet verimliliğini artırır.
- Stratejik Değer: Sınırlı biyolojik materyal ile hızlı SAR keşfine olanak tanıyarak devam/dur karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Erken aşama tarama kampanyalarında tekrarlanabilir EC50 tayini aracılığıyla riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Çalışma konsantrasyonlarında GPCR ligandlarının hassas seri dilüsyonlarının hazırlanması konusunda uzmanlık gerektirir.
- Empedans analizörünün, tek kuyucuklu zamansal kayıt ve baz çizgisi çıkarma yetenekleriyle uyumlu olmasına bağlıdır.
- Dengeleme ve yanıt stabilitesini sağlamak için agonist eklemeleri arasında standartlaştırılmış zaman aralıkları gereklidir.
- Sıvı bozulmasını veya reseptör aşırı stimülasyonunu önlemek için ekleme hacmi ve frekansının optimizasyonunu içerir.
- Kompetitif bağlanmayı ve doz-yanıt eğrilerindeki sağa kaymayı değerlendirmek için antagonist ön inkübasyon protokollerine ilişkin değerlendirmeleri içerir.
