Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi

Yöntemimiz önemli, çünkü ortalama bir biyokimyacının immobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak izole edilen numunelerin geçiş metalleriyle kontamine olup olmadığını hızlı bir şekilde belirlemesine olanak sağlar. Ana avantajı, talın yapılabildiği kolaylıktır. Tahlil enstrümantasyon ve teknikleri en biyokimya laboratuvarları için ortak kullanır ve kolayca ve hızlı bir şekilde uygulanabilir.

Bu makalede nikel-NTA kolon ile izole edilmiş numuneler için bu yöntemi uygularken, yöntem başka bir metal afinite reçinesi ile kullanılabilir. İlk kez kullanıcılar bilinen konsantrasyon bir nikel stok çözümü ile bu yöntemi denemelisiniz. Bu, spektral değişikliklerde gösterilen iş akışı, örnek renkler ve reisinler hakkında onları tanıdık.

Prosedürü gösteren Cole Swain, laboratuvarımdan bir teknisyen. Başlamak için UV-Vis spektrofotometresini açın ve ısıtın. Proteini ölçmek için 280 nanometre optik absorbansiçeren diyot dizisi UV-Vis spektrofotometre kullanılarak teşbilenecek kromatografi fraksiyonlarını belirleyin.

Tris, HEPES, MOPS ve fosfat tamponu gibi PH’si 7 ile 12 arasında olan 10 ila 100 milimolar örnek tampon elde edin. Hazırlanan her mililitre lik stok çözeltisi için 120 miligram HNB reaktifi kullanarak numune arabelleğindeki HNB dağılımının hacim çözeltisi ile %12 ağırlık hazırlayın. Spektrofotometreyi 647 nanometrede veri toplamak için ayarlayın.

Spektrofotometreyi boşaltmak için örnek arabellekle dolu bir kuvars cuvette kullanın. Toplam elekt hacminin mililitrebaşına 50 mikrolitre HNB stoku içeren bir cuvette bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Kontrol oda sıcaklığında en az üç dakika kuluçkaya izin verin.

Kontrol numunesi için emiciliği 647 nanometre de ölçün ve kaydedin. 150 mikrolitre HNB stoğunu, uygun seyreltilmiş protein fraksiyonlarının 2850 mikrolitresi ile numune tamponu ile karıştırarak test numunelerini hazırlayın. Numunenin oda sıcaklığında en az üç dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin.

Ölçülecek her kesir için spektrum kaydını tekrarlayın. Yeterli seyreltme elde edilmesi durumunda 647 nanometredeki spektral bandın tamamı yok edilir. Çok güçlü seyreltme ile olsa da, örnek kontrol ayırt edilemez.

Her numunedeki metal konsantrasyonunun belirlenmesi için, ilk olarak her numune emicisinin HNB kontrolünden 647 nanometrelik farkını bulun. DF’nin titrek fraksiyonu için seyreltme faktörü olduğu formülü kullanarak mikromolardaki metal konsantrasyonu belirleyin, delta A-B-S 647 647 nanometrede emici değişimdir, 3.65 çarpı 10 negatif 2 HNB’nin yok olma katsayısını temsil eder ve ben de cuvette’nin santimetrelik optik yoludur. Bu çalışmada, MSP1E3D1 izolasyonundan nikel iyon için titreşen fraksiyonların temsili spektrumlarında nötr PH’deki serbest HNB spektrumu burada gösterilmiştir.

HNB kontrolüne göre 647 nanometrede bir azalma emdirme gözlenmiştir, bu da bir geçiş metalinin varlığında HNB komplekslerinin oluşumuna karşılık gelmektedir. Bu testin uygulanmasını göstermek için, iki adet etiketli membran iskele proteini, MSP1E3D1, MSP2N2 ve geobacter sülfürden oluşan üç heme, c-tipi sitokrom GSU0105 adlı roman analiz edildi. GSU0105 için her fraksiyonun protein ve nikel iyon içeriği birbirinden önemli ölçüde kaydırılırken, en fazla proteini içeren MSP1E3D1 ve MSP2N2 kesirleri de en yüksek nikel içeriğine sahipti.

Ayrıca, metal içeriğinin harekete geçirilmiş metal afiyetkromatografisi kullanılarak toplanan kesirler arasında eşit olarak dağıtılmayabileceği de gösterilmiştir. Tüm örneklerdeki boşluğu yeterli ve tutarlı bir şekilde karıştırmak ve tüm numunelerde boş için eşit kuluçka sürelerine izin vermek en önemlidir. Metal kontaminasyonunu doğrulamak ve şelatlı veya güçlü bir şekilde bağlanmış protein metal iyonlarını test etmek için atomik absorpsiyon spektrometresi veya ICPMS ile özel ilgi protein fraksiyonları daha fazla analiz edilebilir.

Geçiş metal yıkama algılama yanı sıra, bu teknik proteinlere geçiş metal iyonları bağlayıcı yakınlıkları ölçmek için kullanılabilir. HNB ve numunelerde bulunan herhangi bir nikel sırasıyla göz ve cilt tahriş edicidir. Yöntem sırasında eldiven ve göz koruması içeren standart PPE kullanılmalıdır.