Name: İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Öğrenin, insan dışı primat pankreatik adacıklarında oksijen tüketimini ölçerek mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmeyi. Bu yöntem, diyabet ve adacık transplantasyonu araştırmalarında sağlıklı sonuçlar elde etmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar kendi tesislerinin kullanımı için Vanderbilt Yüksek Throughput Tarama Çekirdek kabul etmek istiyorum, Agilent Biyoteknolojiler, Dr Paul Kievit (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi) insan olmayan primat adacık izolasyonları için, ve Eric Donahue (Vanderbilt Üniversitesi) Şekil 1 ile yardım için. J.M.E. T32GM007347 ödül numarası ile Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS tarafından desteklendi. M.G. NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ve Gazi İşleri Dairesi (BX003744) tarafından desteklenmiştir.

1. Tsanın Çalıştırılan Gün Mikroplaka ve Sensör Kartuşunun Hazırlanması
Adacıklar daha önce13açıklandığı gibi üç yaşındaki Japon makak izole edildi. Bu yöntem kadavra donörlerden insan adacıkları izole etmek için kullanılan çok benzer, ancak fareler farklıdır, hangi pankreata genellikle hayvan sedasyon altında ve organ kaldırma önce kollajenaz çözeltisi ile şişirilir. Adacık alımı Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapılmıştır ve ONPRC IACUC tarafından onaylanmıştır. ONPRC, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından yürürlüğe konan Hayvan Refahı Yasası ve Yönetmelikleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası'na uyar.
<ol><li>Spheroid Mikroplaka Hazırlanması<ol>
<li>0,1 M sodyum bikarbonat çözeltisinin 3 mL'sini hazırlayın. Filtre çözeltisterilize. Biz 0.45 μm filtre(Malzeme Tablosu)kullandı.</li>
		<li>Hücre kültüründe, 200 μL hücre ve doku yapıştırıcısını(Malzeme Tablosu)0,1 M sodyum bikarbonat 2,8 mL'ye ekleyin. Daha sonra, 96-iyi spheroid mikroplaka(Malzeme Tablosu)her kuyunun altına bu çözeltinin 20 μL ekleyin. Hava kabarcıklarının pipet ucundan çıkarıldığından ve plakanın sadece alt kısmı nın kapalı olduğundan emin olun. Mikroplakanın kapasması, ilaç eklendiğinde ve tgörünüşe göre kuyuya karıştığında adacıkların kuyunun kenarlarına doğru hareket etmesini önler. NOT: Sadece, tazyik çalıştırıldığında adacıklar için kullanılacak kadar kuyu kaplamak gerekir. Yalnızca birkaç kuyu kullanılacaksa, hücre yapışkan çözeltisi uygun şekilde küçültülebilir. Elekta kullanılan hücre yapıştırıcısı deniz midyesinden elde edilen formüle edilmiş bir protein çözeltisitir. Alternatif olarak, mikroplaka kuyuları 20 μL 100 μg/mL poli-D-lizin ile kaplanabilir.</li>
		<li>Plakayı 37 °C'de, CO2 olmayan bir kuluçka makinesinde bir saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Steril bir ortamda, plakadan aspir hücre yapıştırıcı çözeltisi. Çok kanallı bir boru kullanarak her kuyuyu 400 μL 37 °C steril su ile iki kez yıkayın. Kuru hava izin verin.</li>
		<li>30-40 dakika sonra tabağı kapatın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sensör Kartuşunun Hidrasyonu<ol>
<li>Steril bir ortamda, sensör kartuş paketini(Malzeme Tablosu)açın ve içeriğini çıkarın. Sensör kartuşu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin.</li>
		<li>Yardımcı plakanın her kuyusunu 200 μL steril suyla doldurun ve sensör kartuşunu yardımcı plakaya geri indirin. Monte edilmiş sensör kartuşu ve yardımcı plakayı bir gecede 37 °C'lik, CO2 kuluçka makinesi olmayan bir yere yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibran hazırlanması<ol>
<li>Aliquot 25 mL kalibran(Malzeme Tablosu)50 mL konik tüp içine. Tüpü bir gecede 37 °C'lik, CO2 kuluçka makinesi olmayan bir yere yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Basım, Adacıkların Yüklenmesi ve Sensör Kartuşunun Tofaş Günü Nezaman Yüklenmesi Protokolü
<ol><li>Medyanın hazırlanması<ol>
<li>48,5 mL baz ortama (minimal DMEM, bkz. Malzeme Tablosu),her biri 1 mM sodyum pirüuvat ve 2 mM glutamin olmak üzere 500 μL ekleyin. Ayrıca, 200 mg/ml glukozun 496 μL'sini ekleyin (ortamdaki son glikoz konsantrasyonu 5,5 mM'dir). NOT: Bu deneylerde temel glikoz konsantrasyonu sabit tutulmuştur. Ancak, glikoz da darbe açıklanan farmakolojik manipülasyonlar ek olarak solunum uyarmak için kullanılabilir10.</li>
		<li>PH'ın 7,4 +/- 0,1 olduğunu ve gerekirse ayarladığını doğrulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sensör kartuşunun hazırlanması<ol>
<li>Sensör kartuşu kuvözden çıkarın, sensör kartuş kapağını çıkarın ve kuyulardan su boşaltın. Her kuyuya 200 mL önceden ısıtılmış kalibrant yerleştirin ve sensör kartuş kapağını değiştirin.</li>
		<li>Sensör kartuşunu yaklaşık 1 saat (gerekli olana kadar) kuvöze geri yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Mitokondriyal stres tayı için ilaç hazırlanması<ol>
<li>Stres test kitini(Malzeme Tablosu)açın ve içeriğini çıkarın. Oligomisin, Carbonyl siyanür-4-(trifluoromethoxy)fenilhidrat (FCCP) ve Rotenone/Antimycin A (AA) için stok ve çalışma çözümleri yapın.<ol>
<li>Oligomisin: 100 μM stok yapmak için tüp e monte edilmiş ortam 630 μL ekleyin. Daha sonra, bağlantı noktası konsantrasyonu elde etmek için ortam ile 45 μM seyreltin (enjeksiyondan sonra son kuyu konsantrasyonu 4,5 μM olacaktır)</li>
			<li>FCCP: 100 μM stok yapmak için tüpe 720 μL monte edilmiş ortam ekleyin. Liman konsantrasyonu elde etmek için ortamla 10 μM'ye seyreltin (son kuyu konsantrasyonu 1 μM olacaktır) NOT: BSA ve/veya FBS ortama eklenmemelidir, çünkü bu mitokondriyal uncouplers14'ünetkisini etkileyebilir.</li>
			<li>Rotenone/AA: 50 μM stok yapmak için tüpe 540 μL monte edilmiş ortam ekleyin. Liman konsantrasyonu elde etmek için ortamla 25 μM'ye seyreltin (son kuyu konsantrasyonu 2,5 μM olacaktır) NOT: Yukarıdaki konsantrasyonlar ellerimizde tutarlı sonuçlar vermiştir. Ek FCCP solunum daha fazla artışa yol açtı. Ancak, ilaç konsantrasyonlarının adacık boyutuna ve özellikle farklı türlerden veya adacık olmayan adacıklardan adacıklara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Referans olarak, insan olmayan bir primat adacık ortalama çapı yaklaşık 150 μm15olduğunu.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Küresel plakanın hazırlanması ve adacıkların transferi<ol>
<li>El-pick pankreas adacıkları 60 mm x 15 mm hücre kültürü çanak içine monte medya içeren içine yakın% 100 saflık elde etmek için. NOT: Adacıklar, açıkça tanımlanmış bir çevre ile yuvarlak ve eknotrin doku kirleticiler daha yoğun görünür görünmelidir. Hasarlı veya yıpranmış görünen adacıklardan kaçının. Bu deneyde, adacık boyutu doğrudan ölçülmedi, ancak her kuyu ve numune için yaklaşık eşdeğer büyüklüktea sahip adacıkları seçmeye çalıştık.</li>
		<li>Çok kanallı pipet kullanarak 175 μL monte edilmiş ortamla her bir küresel mikroplaka kuyusu yükleyin.</li>
		<li>15 μL'ye ayarlanmış bir P20 pipetkullanarak hücre kültürü çanaktan 15 adacık aspire edin. Adacıklar pipet ucunda çıplak gözle görülmelidir.</li>
		<li>Adacıkları küresel mikroplakaya aktarmak için, kuyunun dibine daha düşük pipet ucu, zar zor yukarı kaldırın ve çok küçük bir hacimde (~5 μL) yavaşça pipet çıkar. Tüm adacıkların pipet ucunu bıraktığını doğrulayın. Her kuyuya 15 adacık verilmelidir. Ara sıra, adacıkların yanlara yapışmak yerine her kuyunun altında olduğunu doğrulamak için mikroskop altında küresel mikroplakayı kontrol edin. NOT: Köşe kuyularını adacıklarla yüklemekten kaçının. Plastikten oksijen ve pH akışı teşrin sırasında oluşabilir ve bu dört köşe kuyularında şiddetlenir.</li>
		<li>Tüm adacıklar küresel mikroplakaya aktarıldıktan sonra, aşağıdaki adımları tamamlarken mikro plakayı 37 °C'lik, CO2 olmayan bir kuluçka makinesine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sensör kartuşunun yüklenmesi ve titrenin çalıştırılması<ol>
<li>Sensör kartuşu'nu kuvözden çıkarın. Her kuyu için A-C bağlantı noktaları uyuşturucu veya medya ile doldurulmalıdır. Adacıklar ve dört köşe kuyusu içeren kuyular ilaçla doldurulmalıdır. Adacıksız köşe li kuyular ortam la doldurulmalıdır. Port D boş bırakılabilir. 20 μL oligomisin veya ortam içeren A (her sensörün sol üst tesli) bağlantı noktasını yükleyin. 22 μL FCCP veya ortamiçeren B bağlantı noktasını (sağ üstte) yükleyin. 25 μL Rotenone/AA veya ortam içeren C (sol altta) bağlantı noktasını yükleyin.</li>
		<li>Program bir hücre dışı akı analizörü 30 dakikalık temel solunum süresi (3 dakika karışımı 5 döngüleri, 3 dakika ölçmek), 42 dakikalık oligomisin ölçüm dönemi (3 dakika karışımı 7 döngüleri, 3 dakika ölçmek), 30 dakika FCCP (3 dakika karışımı 5 döngüleri, 3 dakika ölçmek) ve 30 dakika Rotenone / AA (3 mix dakika, 3 dakika ölçüm 5 döngüsü).</li>
		<li>Sensörü kalibre etmek ve mikro plakayı takmak için testi çalıştırın ve ekrandaki talimatları izleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
<li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li>
<li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420(1970).</li>
<li>Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li>
<li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139(2019).</li>
<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).</li>
<li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023(2012).</li>
<li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li>
<li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li>
<li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBS%2FBSA+media+concentration+determines+CCCP%27s+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li>
<li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+%28Rhesus%29+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Adacık oksijen tüketimi çalışma daha önce adacıkların küresel şekli, kültür yüzeylerine bağlılık eksikliği ve iyi başına gerekli adacık sayısı tarafından engel olmuştur. Bu protokolde, 96 kuyulu küresel mikroplakanın az sayıda adacık üzerinde adacık oksijen tüketimini ölçmek için etkinliğini vurgulamakta ve teknik olarak uygun ve tutarlı hale gelen adacıkların taşınması ve yüklenmesi için bir teknik göstermekteyiz. Sonuç -ları.
Adacıkların mikroplakanın altına yapışması ve töz boyunca karıştır...

Normal kan şekeri düzeylerini korumak için, pankreas β hücre glikoz yükseklikleri algılamak ve buna göre insülin salgılar. İnsülin salgısının glikoz düzeyleri ile birleå mesi, glukoz metabolizmasÄ± ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP Ã1/4retimi ile doÄ rudan baÄ lantÄ±lÄ± dÃ1/4Å Ã1/4rÃ1/4lÃ1/4yor. Böylece, mitokondri uyarıcı-salgı kaplin kritik bir rol oynamaktadır1. Β-hücre mitokondriyal fonksiyonunun değerlendirilmesi, insülin salgısının bozulmasına yol açan kusurları ortaya çıkarabilir. Pankreas α hücreleri tarafından glukagon salgıları da yakından mitokondriyal fonksiyon2bağlıdır . Ölümsüzleştirilmiş adacık hücre hatları tahliller bazı türleri için yararlı kanıtlanmış olmasına rağmen, Bu hücrelerin fizyolojisi doğru tüm adacık fonksiyonu özetlemek değil, glukagon tarafından insülin salgılanması potentiation gösterildiği gibi3,4 ve insülin tarafından glukagon salgılanması inhibisyonu5,6 bozulmamış adacıklar. Bu, bütün, bozulmamış adacıklar kullanılarak oksijen tüketimini ölçme ihtiyacını göstermektedir.
Adacık hücre respirometrisinin ölçümü teknikleri zamanla, oksijene duyarlı floresan boyaların kullanımındanoksijen tüketimini doğrudan ölçen katı hal sensörlerine kadar gelişmiştir8. Başlangıçta monolayer için tasarlanmış, yapışık hücreler, yaygın olarak kullanılan hücre kültürü plaka sistemleri pankreas adacıkları için etkisiz olduğu kanıtlanmıştır. Adacıklar doğal olarak kuyulara yapışmadığı için, kültürün çevresine itilmeye yatkındırlar ve bu da oksijen tüketiminin yanlış ölçülmesi ile sonuçlanır9. Bu sorunla mücadele etmek için, adacıklar içerebilir merkezi bir depresyon ile özel 24-iyi plakalar geliştirilmiştir9. Ancak, 24-iyi plaka sistemi gerekli adacıkların çok sayıda (kuyu başına 50-80) ve aynı anda10test edilebilir koşulların sayısı ile sınırlıydı. Küresel lerde ekstrasellüler akı analizi için özel olarak tasarlanmış 96-iyi mikroplakalar son gelişme iyi10başına 20 veya daha az adacık ile adacık respirometri ölçümü sağlayan, bu engelleri aşmıştır.
Burada, japon makak(Macaca fuscata),insanlara benzer adacık biyolojisi ile bir hayvan modeli11,12adacıklarda oksijen tüketimini ölçmek için bu sistemin kullanımını göstermek . Bu protokolde, her biri 15 makak adacık analiz edilir. Elimizde, 15 adacık lar iyi az adacıklar daha yüksek bazal oksijen tüketimi üretilen, sağlam aktivasyon ve farmakolojik manipülasyon yanıt olarak solunum baskı ile. Her kuyunun merkezinde adacıkların tutarlı bir şekilde yüklenmesi için etkili bir yöntem olan ve bu titreyi gerçekleştirirken karşılaşılan genel zorluklara hazırlanmak için gereken adımları vurguluyoruz.

<table><tbody><tr><td>Hücre kültürü kabı, 60 mm X 15 mm stil</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Hücre ve Doku Yapıştırıcısı</td><td>Corning</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüp, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td>Glikoz çözeltisi için, 200 mg / ml, steril dosyalanmış</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık rezervuarlar (steril), 25 ML</td><td>Vistalab</td><td>3054-1033</td><td>çok kanallı pipet</td></tr><tr><td>EZFlow Steril 0.45 &mu yüklemek için; m PES Şırınga Filtresi, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet uçları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet, 15-1250 & mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672100BT</td><td>Önerilen</td></tr><tr><td>P20, P200 ve P1000 pipetleri</td><td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>pH Probu</td><td>Hanna Aletleri</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları, 20 & mu; L, 200 &mu; L, 1000 &mu; L</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF Temel Medya</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF Hücre Mito Stres Test Kiti</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Oligomisin, FCCP ve Rotenon / Antimisin İçerir Denizatı</td></tr><tr><td>XFe96 Analiz Cihazı</td><td>Agilent</td><td>S7800B</td><td>37 & derece hazırlık istasyonu dahil; C CO2 olmayan inkübatör</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Küresel Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>Sensör kartuşu, küresel mikroplaka ve kalibrant içerir</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (steril), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>Steril filtrasyon için</td></tr><tr><td>Su (steril)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan dışı primat pankreatik adacık oksijen tüketiminin analizi

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

Ex vivo pankreas adacıkları gibi küresel hücre kümelerinde oksijen tüketiminin ölçümü tarihsel olarak zor olmuştur. Adacık oksijen tüketiminin ölçülmesini, küresel lerde oksijen tüketiminin ölçülmesi için tasarlanmış 96 kuyuluk bir mikroplaka ile gösteriyoruz. Bu tözde, küresel mikroplakalar bir hücre ve doku yapıştırıcısı ile önceki gün asanın la kaplıdır. Adacık bağlılığını sadece kuyunun dibine yapışmasını teşvik etmek için küçük hacimli yapışkan çözüm kullanıyoruz. Tsuruk gününde, 15 adacık, adacıkların optimum konumlandırılmasını ve oksijen tüketiminin doğru ölçülmesini sağlayan bir teknik kullanılarak doğrudan her kuyunun tabanına yüklenir. Mitokondriyal solunumun çeşitli yönleri, ATP'ye bağımlı solunum, maksimal solunum ve proton sızıntısı gibi insan dışı primat adacıklarında farmakolojik olarak incelenir. Bu yöntem, kuyu başına yalnızca az sayıda adacık kullanarak tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Teorik olarak benzer büyüklükteki kültürlere uygulanabilir.

Adacıkları mikro plakaya yüklemek için Şekil 1A'dagösterildiği gibi 15 adacık 15°L ortama aspire edilmelidir. Adacıklar doğal olarak birkaç saniye içinde pipet ucunun dibine doğru yerleşirler. Daha sonra, pipet ucu kuyunun altına indirilir. Ucu çok hafifçe kaldırılır ve küçük bir hacim (yaklaşık 5 μL) adacıklar ile birlikte dışarı borulu. Bu teknik, adacık ların mikroplaka nın alt kısmında tutarlı bir şekilde yerleştirilmesiile sonuçlanır (<s...

Bu protokol, insan dışı primat pankreas adacıklarında oksijen tüketiminin doğru ve tekrarlanabilir ölçümünü göstermektedir. Adacık yükleme teknikleri ve mikroplaka kaplama kültürlü küresel diğer türde solunum verimli ölçümü için bir çerçeve sağlar.

İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Bu yöntem, insan olmayan primatlar ve insanlar gibi ilgili türlerden gelen az sayıda adacıktan gelen az sayıdaki adacıklardan oksijen tüketiminin ölçülmesine olanak sağlayarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu teknik, az sayıda birincil adacıkla, teknik çoğaltmaların artırılması, birden fazla koşulun test edilmesine olanak tanıyan ve testin katılığını ve tekrarlanabilirliğini geliştirerek gerçekleştirilebilir. Bu teknik, adacık fonksiyonu ve insülin salgısının önemli bir belirleyicisi olan ve genellikle diyabette bozulmuş olan ve başarılı adacık naklinin önemli bir belirleyicisi olan mitokondriyal sağlığı değerlendirir.Adacıkların transferden sonra kuyuların merkezine lokalize olduğundan emin olmak esastır. Aksi takdirde tutarsız oksijen tüketimi ölçümleri ile sonuçlanır. Bu prosedürü gösteren, Valerie Ricciardi, benim laboratuvarımda çalışan bir lisans öğrencisi olacak.Bir gün önce, 0,1 molar sodyum bikarbonat çözeltisi 2.8 mililitre hücre ve doku yapıştırıcı 200 mikrolitre ekleyin ve 96 iyi küresel mikroplaka her kuyunun altına elde edilen çözelti nin 20 mikrolitre ekleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları pipet ucu kaldırılır emin olun. Tüm kuyular yüklendiğinde, plakayı 37 derece lik karbondioksit olmayan bir inkübatöre yerleştirin.Bir saat sonra, steril bir ortamda plaka dan hücre yapışkan çözeltiaspire ve 37 derece santigrat steril su 400 mikrolitre ile her kuyu iki kez yıkayın. Daha sonra kuyuların 4 santigrat derecede geceleme için plakayı kaplamadan önce 30 ila 40 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Sensör kartuşunu nemlendirmek için steril bir ortamda sensör kartuş paketini açın ve içindekileri çıkarın.Sensör kartuşunu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin ve yardımcı plakanın her kuyusunu 200 mikrolitre steril suyla doldurun. Tüm kuyular yüklendiğinde, sensör kartuşu yardımcı plakaya indirin ve monte edilmiş sensör kartuşu ve yardımcı plakayı bir gecede 37 derece santigrat derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin. Tgörünüşe gününde, sensör kartuşu kapağını çıkarın ve suyu servis plakasının kuyularından çıkarın.Her kuyuya 200 mililitre önceden ısıtılmış kalibran ekleyin ve sensör kartuş kapağını değiştirin. Daha sonra sensör kartuşu yla yaklaşık bir saat boyunca kuvöze geri yerleştirin. Adacıkları transfer için hazırlamak için, adacıkları yaklaşık %100 saflıkta biraraya getirilmiş ortam içeren 60 ila 15 milimetrelik hücre kültür yemeğine yerleştirin.Tüm adacıklar toplandığında, hazırlanan küresel mikroplakanın her kuyuyu 175 mikrolitre bir araya getirilmiş ortamla yükleyin ve hücre kültürü çanaktan 15 mikrolitrelik orta 15 adacık aspire etmek için 15 mikrolitreye ayarlanmış bir P20 pipet kullanın. Adacıkları küresel mikroplakaya tohumlamak için pipet ucunu kuyunun dibine indirin, ucu zar zor kaldırın ve yaklaşık beş mikrolitre orta litre orta yığın. Adacıkları kuyulara yüklemek için, adacıkların pipet ucuna yerleşmelerine izin verin ve bunları kuyu merkezinin alt kısmından küçük bir hacimde yavaşça serbest bırakın.Tüm adacıkların pipet ucunu bıraktığını doğrulayın, ara sıra mikroskop altında küresel mikroplakayı kontrol edin ve adacıkların plakanın alt kısmında tohumlu olduğunu ve kuyuların kenarlarına yapışmadığını doğrulayın. Tüm adacıklar transfer edildiğinde, mikroplakayı 37 derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin. Teşp prosedürünü başlatmadan önce, sensör kartuşunun 20 mikrolitresi ile sensör kartuşuna yeni hazırlanmış 45 mikromolar oligomisin, 22 mikrolitre taze hazırlanmış 10 mikromolar FCCP ile Port B'yi ve 25 mikrolitre taze hazırlanmış 25 mikromolar rotenon AA ile Port C'yi yükleyin. Daha sonra, program 30 dakikalık temel solunum dönemi, 42 dakika oligomisin ölçüm dönemi, 30 dakika FCCP dönemi ve 30 dakikalık rotenon AA dönemi için bir ekstrasellüler akı analizörü testi.Daha sonra sensörü kalibre etmek ve mikro plakayı yerleştirmek için ekrandaki talimatları izleyerek testi çalıştırın. Adacık teslimi için, 15 adacık gösterildiği gibi orta 15 mikrolitre aspire edilmelidir. Bu teknik, adacıkların her bir mikroplakanın alt ortasına tutarlı bir şekilde yerleştirilmesine ve doğru oksijen tüketimi ölçümlerinin alınmasına olanak sağlamasına neden olacaktır.Bireysel kuyuların oksijen tüketimini gösteren bu temsili deneyde, kuyular kötü yüklenmiş ve bu da çok düşük bir temel oksijen tüketimi düzeyine ve FCCP'ye yanıt vermeye naz ına neden olarak yüklenmiştir. Bu deneyde, kuyuların çoğu önemli bir temel solunum ve ilaçlara yanıt gösterdi. Ancak, iki kuyu rotenone hiçbir yanıt sergiledi, ilacın düzgün kuyuya serbest olmadığını düşündüren.Bu kuyular daha ileri analizler dışında tutuldu. Burada, kuyuların adacıklarla doğru bir şekilde yüklendiği ve doğru bir şekilde ilaç enjekte edildiği başarılı bir tahkikatsonuçları gözlemlenebilir. Adacıkların izole edildikten veya alındıktan kısa bir süre sonra kullanılmasına izin vermek için, tetkikleri gerçekleştirmeden bir gün önce reaktiflerin ve plakaların hazırlanması faydalıdır.Testin ardından, adacıklar oksijen tüketimi verilerini normalleştirmek veya mitokondriyal DNA içeriğini ölçmek için protein veya DNA çıkarma için geri kazanılabilir. Mitokondriyal fonksiyonu az sayıda birincil primat adacıklarında ölçebilme yeteneği, birden fazla ilaç ve diğer manipülasyonların tek bir biyolojik çoğaltmada test edilmesine olanak sağlar. Birincil primat adacıkları ile çalışan bireyler bu dokular ile doğru ve güvenli kullanım konusunda eğitilmiş olması emin olmalısınız.Özellikle, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve bu örneklerin uygun bertaraf.

analysis-of-non-human-primate-pancreatic-islet-oxygen-consumption

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Bu protokolün amacı, insan dışı primatlarda glisemik kontrolü değerlendirmek ve dismetabolik sağlıklı onların metabolik durumunu değerlendirmek için intravenöz glikoz tolerans testi (IVGTT'ler) gerçekleştirmek için standart bir yöntem sunmaktır.

İntravenöz Glikoz Tolerans Testi ile insan olmayan primatlarda Metabolik Durumu Karakterizasyonu

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Oksijen tüketim hızı (OCR), mitokondriyal fonksiyon için yaygın bir vekildir ve farklı hastalık modellerini incelemek için kullanılabilir. Yetişkin farelerden akut striatal dilimlerdeki OCR'yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdik ve bu da fizyolojik olarak diğer yöntemlerden daha alakalı.

Yetişkin Farelerden Akut Striatal Dilimlerde Oksijen Tüketim Hızının Ölçülmesi

Burada, PINK1B9-null mutant meyve sineklerinde biyoenerjetik analiz etmek için yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolü sunuyoruz. Yöntem, Substrat-Bağlayıcı-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolünü kullanır.

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Bu protokol, aynı numunelerden metabolomik analizler için toplu sitozolik fraksiyonu korurken, tek çekirdekli eşzamanlı RNA dizilimi ve ATAC dizilemede kullanılmak üzere donmuş insan olmayan primat pankreas adacıklarından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etme prosedürlerini açıklar.

Kombine Tek Çekirdekli RNA Dizileme ve ATAC-Dizileme ve Toplu Metabolomikler için Donmuş İnsan Olmayan Primat Fetal Adacıklarının Hazırlanması

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Öğrenin, insan dışı primat pankreatik adacıklarında oksijen tüketimini ölçerek mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmeyi. Bu yöntem, diyabet ve adacık transplantasyonu araştırmalarında sağlıklı sonuçlar elde etmeyi kolaylaştırır.

İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi

Daha fazla video keşfet