Name: Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Keşfedin, antikorların tümör ve dokulardaki dağılımını gerçek zamanlı izlemek için hızlı ve uygun maliyetli bir protokol. Bu yöntem, spesifik olmayan doku bağlanması sınırlı terapötik antikorların seçimini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi Çekirdek Görüntüleme Tesisi, Biyomoleküler Analiz Tesisi, Gelişmiş Mikroskopi Tesisi ve Yardım için Core Vivarium Tesisi müteşekkiriz. J. T-S Yumurtalık Kanseri Akademisi (OCA-DoD) erken kariyer araştırmacısı. Bu çalışma NCI/NIH hibe (R01CA233752) j. T-S, ABD DoD Meme Kanseri Araştırma Programı (BCRP) atılım seviye-1 ödülü J. T-S (BC17097) ve U.S. DoD Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) finansman ödülü (OC180412) J. T-S destek

Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından hayvanların işlenmesi ve tümör ksenogreftleri ile ilgili tüm prosedürler gözden geçirilerek onaylanmıştır ve ilgili mevzuat standartlarına uygun
1. Antikorların ekspresyonu ve saflaştırılması
<ol><li>CHO hücrelerinin bakımı<ol>
<li>FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyüyün, 37 °C'de 37 °C'de 130 rpm'de %5 CO2'de cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer şişeleri kullanılarak sallanarak 1x glutamin takviyesi ile desteklenir. NOT: Bu son derece artan ajitasyon için havalandırmalı kapaklı bir şaşkın şişe kullanılması ve titreme durumu sırasında gaz transferini artırmak için tavsiye edilir. Süspansiyon kültürünün sınırlı ajitasyonu nedeniyle düzenli şişelerle (şaşkın olmayan) önemli ölçüde azaltılmış antikor verimi elde edilmiştir.</li>
		<li>Hücre sayısını 1-5 x 106</li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li></li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li><li> </li><li> </li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> </li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li> </li><li></li><li><li></li><li><li> </li><li></li></ol></li><li> <ol><li> </li><li></li><li> </li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muromonab+CD3+%28Orthoclone+OKT3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li>
<li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-siRNA+conjugates%3A+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li>
<li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1(2013).</li>
<li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595(2017).</li>
<li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50(2018).</li>
<li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li>
<li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).</li>
<li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor-alpha+%28FOLR1%29+expression+and+function+in+triple+negative+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209(2015).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody%2C+farletuzumab%2C+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+Therapy%22%5BJournal%5D)">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+%28Kadcyla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li>
<li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li>
<li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer%3A+considerations+for+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li>
<li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li>
<li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology%22%5BJournal%5D)">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).</li>
<li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FSPECT%2FCT+imaging+of+small+animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li>
<li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease%3A+the+SPARC+study%5BTitle%5D)+AND+%22Netherland+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li>
<li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology%3A+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Computer+Aided+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li>
<li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+%28TMDD%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22CPT+Pharmacometrics+and+System+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li>
</ol>

Yazarların rakip finansal çıkarları yoktur.

Anti-kanser terapötik ajan selektif ve tümör dokusu özel teslimat belirli bir hedefli tedavinin etkinliğini ve güvenliğini ölçmek içinanahtardır 13. Burada klinik, farletuzumab ve klinik olmayan BaCa antikorlarının ayrıntılı doku ve tümör dağılımını araştırmak için hızlı ve etkili bir yaklaşım tanımladık. Açıklanan yaklaşım yeni üretilen herhangi bir antikor için geçerlidir ve tümör / organ dağılımı özellikleri için klinik olarak etkili bir antikor (istenilen niteliklere sahip) yanında kullanılabi...

FDA ilk monoklonal antikor hedefleyen CD3 onayladı (OKT3, Muromonab) içinde 1 ,2. O zamandan beri önümüzdeki yirmi yıl için, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri karşı antikorların ezici başarısı nedeniyle antikor mühendisliği alanında hızlı bir patlama olmuştur3. Bağışıklık sisteminin dolaylı aktivasyonu yanında, antikorlar doğrudan bağışıklık efektörü hücreleri meşgul etmek için kanser hücrelerinin bayrak hedeflenmektedir, ölüm reseptör agonist yoluyla sitotoksisite tetiklemek, blok tümör hücre sağkalım sinyali, obstrüktif anjiyogenez (kan damarlarının büyümesi), kısıtlama bağışıklık kontrol noktası düzenleyicileri, konjuge ajanlar olarak radyoizopes, kemoterapi ilaçları ve siRNA teslim2. Buna ek olarak, hasta türetilmiş T-hücreleri ve NK hücreleri (CAR-T ve CAR-NK) yüzeyinde çeşitli antikorların tek zincir değişken parçaları (scFv) incelenmesi hücre tabanlı tedaviler için klinik araştırmaların hızlı büyüyen bir alandır4.
Tümör hücrelerini ifade eden antijene seçicilik sağlayan antikor bazlı ilaçların aşırı yüksek yakınlığı onu çekici bir ajan haline getirir. Aynı şekilde, terapötik bir antikor hedefli doğum ve tümör tutma (veya kimyasal bir ilaç) toksisite üzerinde etkinliğini dengelemek için anahtardır. Bu nedenle, içeren ancak bispesifik5 ve üç spesifik antikorlar6 ile sınırlı değildir protein mühendisliği tabanlı stratejiler çok sayıda önemli ölçüde intravenöz (IV) enjekte terapötik tümör retansiyonu optimize tümör retansiyonu geliştirmek için yararlanılmaktadır5,7. Burada, potansiyel olarak etkili anti-kanser antikorlarının tümör ve doku dağılımını ele almak için basit bir floresan tabanlı yöntemi tanımlıyoruz.
Hayvan dokuları görünür spektrumda heyecanlandığında otomatik floresana sahip olduğundan, antikorlar başlangıçta kızılötesi boyanın yakınında (örneğin, IRDye 800CW) etiketlenmiştir. Kavram araştırmaları için folat reseptör alfa-1 (FOLR1) farletuzumab denilen antikor ve onun türevi olarak adlandırılan Bispesifik çapa Sitotoksisite aktivatör (BaCa)7 antikor bu co-targets FOLR1 ve ölüm reseptör-5 (DR5)8 bir rekombinant antikor kullandık. FOLR1 yumurtalık ve TNBC kanser hücrelerinde, tümör ksenogreftlerinde ve hasta tümörlerinde iyi tanımlanmış aşırı ekspres hedef reseptördür9. Özellikle, klinik yumurtalık ve meme kanserleri için bağışıklık efektörü hücreleri ve antikor ilaç konjugeler (ADC) meşgul antikor tabanlı yaklaşımlar kullanarak FOLR1 yararlanmak için birden fazla çaba vardır10,11.
Bu yöntem de, biz klonlanmış, ifade ve klinik anti-FOLR1 (farletuzumab) cho ifade sistemi kullanarak diğer kontrol antikorları ile birlikte saflaştırılmış. IgG1 isotipi ve abagovomab12 adı verilen klinik anti-idiyotip-16 antikor negatif kontrol olarak kullanıldı. Protein-A arınmasını takiben, endike antikorlar IRDye 800CW ile etiketlendi ve yumurtalık tümörü ksenogreftleri taşıyan veya stably transfected insan FOLR1 gösteren çıplak farelerin kuyruk damarına uygulandı. Antikor lokalizasyonu canlı görüntüleme ile birden fazla farklı zaman noktalarında in vivo görüntüleme spektrumu kullanılarak izlendi7. Bu yöntem ışık emisyonsağlamak için herhangi bir genetik modifikasyon veya substrat enjeksiyon gerektirmez ve önemli ölçüde daha hızlı, maliyet etkin ve verimlidir. Aşağıda açıklanan genel klonlama, ifade, saflaştırma ve etiketleme protokolü, ağır ve hafif zincir dizileri mevcutsa herhangi bir klinik ve klinik olmayan antikora uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO ortamı</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedi # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedi # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Topaklanma Önleyici Ajan</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedi # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD İnsülin Şırıngası</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat # 329420</td><td></td></tr><tr><td>Kaliper IVIS Spektrumu</td><td>PerkinElmer</td><td>Kedi #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedisi #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)</td><td>Corning</td><td>Kedi # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning Kedi</td><td># 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 konjuge Anti-İnsan IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedi # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HiPure Plazmid Maxiprep kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Sütunu</td><td>GE Sağlık Kedisi</td><td># 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>İnfüzyon</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Kedi # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran, USP</td><td>Covetrus</td><td>Kedi # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Kayganlaştırıcı Göz Merhem</td><td>Yenileme Lacri-Lube</td><td>Cat # 4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI transfeksiyon reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Diyaliz Kasetleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vakum Filtreler</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedi # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Deneysel Modeller: Hücre hatları< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İnsan: OVCAR-3</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>İnsan: CHO-K hücreleri</td><td>Kararlı Laboratuvarımızda dönüştürülen</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Fare: 4T1</td><td>Dr. Chip Landen, UVA'dan</td><td></td><td></td>nazik hediye</tr><tr><td>Fare: MC38</td><td>Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC'den nazik hediye</td><td>STR profil oluşturma</td><td></td>ile doğrulandı</tr><tr><td>Fare: MC38 hFOLR1</td><td>Laboratuvarımızda üretilmiştir (Bu makale)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Deneysel Modeller: Hayvan</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fareler: atimik Çıplak Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Çoklu Siparişler</td><td></td></tr><tr><td>Fareler: NOD.Cg Prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Çoklu Siparişler</td><td></td></tr></tbody></table>

hedef antijen spesifik terapötik antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoklonal antikorlar kanser hücrelerini ortadan kaldırmak için değişken bağımsız mekanizmalar tarafından çalışan yüksek afiniteli çok fonksiyonlu ilaçlardır. Son birkaç on yıl içinde, antikor-ilaç konjugeler alanı, bispesifik antikorlar, şimerik antijen reseptörleri (CAR) ve kanser immünoterapi temel ve terapötik araştırmaların en umut verici alan olarak ortaya çıkmıştır. Bir atılım hızında lösemi ve melanom bağışıklık kontrol noktası reseptörleri ve CAR-T hücreleri hedefleyen çok sayıda başarılı insan çalışmaları ile, antikor mühendisliği varyasyonları türetilen onkolojik terapötikler için son derece heyecan verici bir kez. Ne yazık ki, antikor ve CAR bazlı terapötik önemli ölçüde çok sayıda da tümör yatağında bağışıklık efektörü hücrelerin sınırlı durumu nedeniyle katı kanserlerin insan çalışmalarda hayal kırıklığı kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, tümörler dışındaki dokularda terapötik antikorların nonspesifik dağılımı da klinik etkinlik eksikliğine katkıda, ilişkili toksisite ve klinik yetmezlik. Preklinik çalışmaların insan klinik izlerine sadık çevirisi farelertümörü ksenogreft etkinliği ve güvenlik çalışmalarına dayandığı için, burada tümörün ve terapötik antikorların genel doku dağılımının test edilmesi için bir yöntem vurgulanmaktadır. Bu protein-A saflaştırılmış antikor yakın Kızılötesi floresan boya ile etiketlenmesi ile elde edilir tümör taşıyan farelerin canlı görüntüleme takip.

Açıklanan metodolojide, ilk olarak folat reseptöralfası alfa-1 'i (FOLR1) hedefleyen antikorları ve farletuzumab ve lexatumumab'dan oluşan BaCa adı verilen bispesifik bir antikor ile abagovomab gibi kontrol antikorları (Ek Dosya 1'deverilen diziler) klonladık. DNA klonları (pVH, pVL) temsili değişken ağır (VH) ve değişken ışık (VL) etki alanlarının ayrıntıları Şekil 1A'dagösterilmiştir. Pozitif klonları doğrulamak için, sinyal peptid ileri (SP For) ve CK Rev/CH3 Rev astarlar...

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Bu protokol antikorların ekspresyonu ve saflaştırılmasını ve tümör ve dokuda antikor dağılımının gerçek zamanlı olarak izlenmesini göstermektedir. Açıklanan protokol ile tarama antikorları sınırlı spesifik olmayan doku dağılımına sahip antikorların seçilmesine yardımcı olacak ve tümör lokalizasyonlarını zenginleştirecektir. Açıklanan teknik hızlı ve uygun maliyetlidir.Tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi ve pozitron emisyon tomografisi gibi diğer teknikler çok pahalıdır ve radyoaktif ve diğer gelişmiş izleyiciler gerektirir. Bu teknik sadece kanserin antikorları hedeflemesi ile sınırlı değildir. Vücuttaki antikor dağılımının analizi için akciğer veya kalp hastalıkları gibi başka bir hastalığa uygulanabilir.Prosedürü gösteren, Jeremy Gatesman, benim üniversiteden bir veteriner teknisyeni olacak. Medya 200 mililitre Ham CHO hücreleri, Delong, Erlenmeyer şişeleri şaşırttı. 50 mikrogram değişken ağır klon DNA ile CHO serbest ortam beş mililitre birleştirin ve 75 mikrogram 15 mililitrelik bir tüp değişken ışık klon DNA.Sonra, tüpü girdap. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika bekletin. DNA çözeltisine mililitre polietilenm insifa başına 750 mikrolitre mikrolitre ekleyin ve agresif bir şekilde 30 saniye boyunca girdap.Karışımı oda sıcaklığında beş dakika daha bekletin. Şişeyi elle sallarken tüm karışımı CHO hücrelerine ekleyin. 130 RPM'de sallayarak hücreleri hemen 37 derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, hücrelere 100 X anti-kümelenme ajanı iki mililitre ve 100 X antibakteriyel antimikotik çözelti iki mililitre ekleyin. Şişeleri 32 ila 34 santigrat derecede, 130 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 10 ila 11 gün boyunca hücreleri kültüre devam, Tryptone N1 yem 10 mililitre ekleyerek, ve her beşinci günde 100 X glutamin takviyesi iki mililitre.Hücre canlılığının 10 veya 11 gün içinde %80'in üzerinde kalmasını sağlamak için hücreleri her üç günde bir sayın, kültürü 3000 kat G'de santrifüj ederek antikor arınması için ortayı hasat edin ve 40-60 dakika 40 ila 60 dakika dört santigrat derece. Ardından, temiz ortamı 0,22 mikrometrelik şişe filtresiyle filtreleyin. Antikorları arındırmak için, protein A sütununa iki sütun luk bağlama tamponu ile dengeleyin.Filtrelenmiş ortamı dakikada bir mililitre akış hızında sütundan geçirin. Ardından sütunu iki sütun ciltli arabellekle yıkayın. 500 mikrolitre fraksiyonları içine antikor uzaklaştırmak için elüsyon tampon beş mililitre kullanın.Ve fraksiyon için nötralizasyon tampon 10 mikrolitre ekleyerek ima antikor pH nötralize. IgG için varsayılan protokolü kullanarak saflaştırılmış antikor konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Bir litre çekim tamponunda diyaliz kaseti kullanarak 0,5 mililitre antikor diyalize alın.Dört saat sonra, taze tampon için diyaliz kaseti aktarın ve bir gecede diyaliz. Bir konjugasyon reaksiyonu ayarlamak için, 500 mikrolitre toplam hacmi antikor bir miligram başına IRR boya 800 CWU 0.03 mikrogram ekleyin. Karışımı 20 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın, ardından PBS'ye karşı geniş diyaliz ile etiketli konjugatları arındırın.Boya 780 nanometre emiciliği ölçerek etiketleme derecesini tahmin edin ve proteinin 280 nanometrede emilmesi. Fare ksenini geliştirmek için, hayvanın derisini hafifçe kaldırın ve altta yatan kas tabakasından ayırın. 26 gauge iğne ile deri altına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.Bodrum matris orta enjeksiyon sitesinden çıkan karışımı önleyecektir deri altında hücreleri ile birlikte yarı katı jel benzeri yapısı bilgilendirmek böylece iğne çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin. Vivo görüntüleme gerçekleştirmek için, kuyruk damarı üzerinden boya etiketli antikor enjekte. Fareyi anestezi ettikten sonra pedal reflekslerine yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin ve ılık su uygulayarak damarı genişleyin.100 mikrolitrelik bir hacimde etiketli antikor 25 mikrogram enjekte etmek için 26 gauge iğne ile 1cc insülin şırınga kullanın. Negatif kontrol olarak, etiket ve kanser hücrelerini hedef almaz non-spesifik IgG inotip antikor enjekte. Antikor enjeksiyonlarından sekiz, 24 ve 48 saat sonra invivo görüntüleme gerçekleştirin.Görüntüleme yazılımında, başlatmayı tıklatın. Sahne sıcaklığının 37 santigrat derece olduğunu doğrulayın. Kontrol panelinde, görüntüleme sihirbazı aracılığıyla floresan görüntüleme ayarlayın ve uyarma ayarlayın 773 nanometre, emisyon 792 nanometers.Anestezili fareyi görüntüleme odasına aktarın. Burun konisi kullanarak görüntüleme alanına yerleştirin. Hazır olduğunuzda, görüntü edinimi için denetim paneline edin'i tıklatın ve otomatik pozlama'yı tıklatın.Oluşturulan görüntü, sayar veya foton birimlerinde görüntülenen optik floresan ve yoğunlukile fotoğrafik görüntü deki floresan bindirmedir. Değişken ağır ve değişken ışık etki alanları ile pozitif cDNA klonları koloni PCR ile doğrulandı. SDS sayfasını azaltmayan ve azaltarak çalışan saflaştırılmış farletuzumab'ın temsili sonuçları burada gösterilmiştir.Ağır ve hafif zincirler 50 ve 25 kilodalton bantlar üretildikten sonra üretti. Antikorların hücre yüzeyindeki yerli proteinlere bağlanması da doğrulandı. Floresan etiketli antikorlar, tam R1 ile aşılanmış farelere enjekte edilen kuyruk damarıydı.Hayvanlar IVIS kullanılarak birden fazla zaman noktasında görüntü olarak yaşanmış. tümörleriçine tam R1 ve BaCa antikorlarının veri confirs selektif zenginleştirme. Bu protokolü denerken, CHO hücrelerinin bakımının antikor verimi için kritik öneme sahip olduğunu unutmayın.Ve rekabetçi tümör lokalizasyonu için floresan boya konjugasyonu benzer derecede olması önemlidir. Bu işlemden sonra canlı fare görüntüleme verilerini desteklemek için doku immünohistokimyası ve doku veya tümöre özgü ELISA gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.

analyzing-tumor-tissue-distribution-target-antigen-specific

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, tümörleri tedavi etmek için immünokonjugatların ve ardından radyoligandların uygulandığı önceden hedeflenmiş radyoimmünoterapi veya PRIT tekniğini açıklar. Bu radyoimmünoterapi, sağlıklı dokulara radyasyon dozlarını azaltır ve antikor bazlı vektörlerle uyumlu olmayan çok düşük yarı ömre sahip radyonüklidleri kullanır.

Önceden Hedeflenmiş Radyoimmünoterapi: Terapötik Radyonüklidlerin Tümörlere Hedefe Yönelik Verilmesi İçin Bir Yöntem

Bu video, bir fare tümörü ksenogreft modelinde tümöre özgü antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir tekniği göstermektedir. Tümör oluşumu için kanser hücrelerinin farelere deri altına enjekte edilmesinin ardından, tümöre özgü reseptörlere bağlanan floresan etiketli antikorlar enjekte edilir ve görüntüleme yoluyla antikor lokalizasyonunun in vivo olarak değerlendirilmesini sağlar.

Tümöre Özgü Antikorların İn Vivo Lokalizasyonunu Değerlendirmek İçin Bir Teknik

Biyoortogonal ters elektron talebi Diels-Alder sikloilavesi, kanser için etkili ve modüler önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi oluşturmak için kullanılmıştır. Bu protokolde, bu metodolojinin adımları, kolorektal kanser hedefli antikor huA33 ve 64Cu etiketli bir radyoligand kullanan bir model sistem bağlamında açıklanmaktadır.

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Antikor-conjugates için (ACs) birleştiğinde Viral kaynaklı peptidler, moleküler yükleri artan tümör hücre birikmesi ile teslim etme potansiyeli nedeniyle ivme kazanıyor bir yaklaşım var. Peptid konjügasyon, AC ve hücre içi yük birikimi ve tümör hedefleme değerlendirmek için ortak yöntemleri kullanarak, bu protokolü anahtar ilk geliştirme aşamalarında araştırmacılar yardımcı olur.

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Bu iletişim kuralı, antikanser bir antikor ve antineoplastic ilaçlar içinde Preklinik modelleri arasında synergism Chou ve Talalay birlikte Dizin denklemi kullanarak değerlendirmek açıklar.

Antikanser antikor etkinliğinin Antineoplastic uyuşturucu tarafından kullanılmasının muhtemelen: antikor-uyuşturucu Synergism kombinasyon Dizin denklem kullanılarak tespiti

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Sentez ve karakterizasyonu bir trans- cyclooctene (TCO) bu protokolünü açıklar-modifiye antikor ve 177Lu etiketli tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) için. Buna ek olarak, bu iki yapıları kullanımı vivo içinde biodistribution ve boyuna terapi çalışmaları kolorektal kanser, bir fare modeli için ayrıntıları.

Pretargeted Radioimmunotherapy ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu üzerinde dayalı

In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Keşfedin, antikorların tümör ve dokulardaki dağılımını gerçek zamanlı izlemek için hızlı ve uygun maliyetli bir protokol. Bu yöntem, spesifik olmayan doku bağlanması sınırlı terapötik antikorların seçimini kolaylaştırır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Daha fazla video keşfet