Deneysel Evrim Yaklaşımında Plazmid Aracılı Antibiyotik Direncinin Ölçülmesi

Plazmidler, çoğu bakteri türü nde ve habitatlarda, hücreler arasında ve popülasyonlar arasında göç edebildikleri için lateral gen transferinin çok önemli ajanları olan ekstrakromozomal elementlerdir. Bu transferin en çarpıcı ve belirgin örneklerinden biri plazmidler üzerinde kodlanmış antibiyotik direnci genlerinin yayılmasıdır. Bir antibiyotik direnç geni kodlayan bir model plazmid oluşturmak için, bir plazmid omurga seçin ve PCR plazmid şablonu üzerinde bağlamak yüksek sadakat polimeraz ve astar kullanarak omurga yükseltmek. Bizim durumumuzda bir pBBR1 plazmid omurga kullanılır. Daha sonra, yüksek sadakat polimeraz kullanarak yerli Tn5 organizatörü de dahil olmak üzere direnç gen nptII yükseltmek. Plazmid omurgasına yaklaşık 20 baz dizi tamamlayıcılığı ile direnç geni için astartasarın. PcR'lerden sonra, saflaştırılmış direnç geni PCR ürününün homoloji bölgesini, 50 derecede isothermal montaj kullanarak saflaştırılmış plazmid omurgasına 60 dakika kaynatın. Elektroporasyon kullanarak erimiş ürünü E.Coli DH5-Alpha'ya dönüştürün. Plaka 100 mikrolitre karışımı seçici medya ve yaklaşık 24 saat boyunca 37 derece kuluçka. Plazmid daha sonra ayıklanabilir, doğrulanabilir ve E.coli yabani türü suş MG1655 dönüştürülebilir. Bu verimleri mg1655 pCON.Antibiyotik maruz kalma sırasında, bakteri hayatta kalmak için plazmid gerekir. Böylece, plazmid olumlu seçim altındadır. Non-selektif koşullar altında, bu yüzden antibiyotik olmadan, plazmid hücreye tek kullanımlık. Çalışmamızın amacı, plazmidleri zaman içinde bu tür seçici olmayan koşullar altında takip etmektir. Bu amaçla küçük plazmidleri antibiyotik direnci geni ile donattık ve Escherichia coli ile tanıştırdık. Evrimsel bir deney yaptık ve plazmidlerin frekansını çoğaltma kaplaması ile izledik. Plazmid taşıyan suş mg1655 pCON şimdi bir evrim deneyi tanıtıldı. İlk olarak, plaka mg1655 LB agar plakaları üzerinde pCON antibiyotik ve kuluçka gecede 37 derece ile takviye. Bu plaka rastgele 8 ata kolonileri seçin ve sürekli sallayarak 37 derece gecede kuluçka. Ertesi gün, popülasyonlar 96 derin kuyu plakası üzerinde yapılan deneye aktarılır. Kopyaları plaka boyunca rasgele dağıtmak son derece önemlidir. Örneğin, bir dama tahtası yaklaşımında. Bizim deneyde kültürler seyreltilir ve farklı seyreltme oranları ve iki sıcaklıkta aktarılır. Her aktarım olayı sırasında seyreltme tedavisi uygulanır ve seri transfer toplam 98 transfer üzerinden tekrarlanır. Evrim deneyi boyunca popülasyondaki plazmidlerin sıklığı plazmid taşıyan hücrelerin oranından tahmin edilmektedir. Replica kaplama Esther ve Joshua Lederberg tarafından 1950'lerde bakterilerdeki ilaç direncini incelemek için kullanıldı. Bu yöntem, fenotipleri taramalarını yükseltmelerini sağlayacak ve çalışmanın sonunda genomdaki spontan mutasyonlara bağlı olarak bakterilerde penisilin direncinin ortaya çıkabileceğini ortaya koymuştur. Deney sırasında popülasyondaki plazmid sıklığını belirlemek için, sabit kültürler seri olarak seyreltilir ve seçici olmayan LB agar plakaları üzerine kaplanır. Plaka başına 250 ila 500 koloninin verime göre seyreltme ayarlayın. Kaplama lı popülasyonlar 24 saatten daha kısa bir süre için 37 derecede bir gecede büyüme için kuluçkaya yatırılır. Koloniler en iyi şekilde küçükken kopyalanırlar. Bir gecede büyüme den sonra okuyucunun seçtiği otomatik koloni sayacı nı kullanarak tüm kolonileri sayın. Bu kültürlerde toplam bakteri popülasyon büyüklüğü verimleri. Plakanın kenarındaki kolonilerin dışarıda bırakılması gerektiğini unutmayın. Plakaları çoğaltmak için, antibiyotikler ile desteklenen seçici agar plakaları gerekir, yuvarlak bir blok, blok uygun bir metal halka, ve steril kadife bez. Bu otoklavasyon ile sterilize edilebilir gibi bez% 100 pamuk olması gerekir. Bezin üzerine yerleştirin ve metal halka ile düzeltin.Plakayı, sabit kadife bez yüzeyine sayılmış kolonilerle dikkatlice yerleştirin. Tüm plaka yüzeyinin bere değmesi için plakaya daire hareketleriyle dokunun. Tüm kolonilerin kadifeye dokunması çok önemlidir. LB plakasını çıkarın ve seçici plakayı kadifenin üzerine yerleştirin. Dikkatli dokunarak tekrarlayın. Plakanın kadifeye tamamen dokunurolması yine önemlidir. Daha sonra seçici plakayı çıkarın. Tabaklar bir gecede oda sıcaklığında kuluçkaya yatırılır. Ertesi gün, hem LB ve antibiyotik plaka değerlendirme için gereklidir. Plakaları birbirinin üzerine yerleştirin ve büyümeyi karşılaştırın. Kolonisiz alanları kolayca görebilirsiniz. Bunlar antibiyotiklere dirençli olmayan kolonilerdir. Böylece, bu koloniler plazmid kaybetti. Sonunda, antibiyotik plakasında kaç koloninin eksik olduğunu işaretleyin. Bu sayı size plazmid kaybı verir. Haftalık evrim deneyi sırasında tüm popülasyonların kopya kaplamasını tekrarlayın. Plazmid kaybı plazmid multi malformasyonundan kaynaklanabilir. Bir plazmid yapı üzerinde çalışırken tercih edilen konak zorlanma belirli bir genin ifade için bir devlet alabilir onay açısından bir plazmid in vivo yerli davranışı genellikle göz ardı edilen bir şeydir söylüyorlar. Ama evrimsel bir bağlamda değişikliklerin böyle bir onay çok büyük önem taşımaktadır. Plazmid onaylarının analizi çok zor bir çaba olabilir. Özellikle plazmid multimerleri analiz etmek zordur çünkü PCR ile veya sıralama ile doğru şekilde tanımlanamamaktadır. Diğer tarafta, plazmid multimerleri potansiyel olarak büyük boyutları ve yavaş elektroforetik hareketlilik nedeniyle jel elektroforez ile analiz etmek zordur. Protokolümüz plazmid multimerlerinin taranması ve tanımlanması için basit ve basit bir yöntem sunmaktadır. Görsel plazmid molekülleri alkali lisis kullanarak 5 mL sabit hücre kültüründen plazmid ayıklamak için. Düşük kopya plazmidlerin plazmid ekstraksiyonu genellikle görselleştirme den önce sindirilmesi gereken konak kromozomal DNA ile kontaminasyona yol açar. Kromozom altonunu ortadan kaldırmak için çıkarılan plazmid DNA'sını Plazmid-Safe ile tedavi edin