OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Enzimatik yöntemimiz protein oligomerini kontrollü sayıda polimerizasyon derecesi ile kullanmaktadır. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışması nın yanı sıra protein bazlı malzeme yapımı için mükemmel bir örneklem hazırlığıdır. Yöntemimiz hedef proteine sistein getirmez.

Sistein protein için en önemli fonksiyonel kalıntılardan biri olduğu için polimerize madde proteini veya enzimlerinin oluşturulmasını kolaylaştırır. Prosedürü gösteren ler, yibing Deng ve Shengchao Shi, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri olacaklar. Başlamak için, bir kabın içinde ultrasaf su 40 mililitre potasyum kromat 20 gram eritin.

Yavaş yavaş potasyum dikromat çözeltisi konsantre sülfürik asit 360 mililitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için bir cam çubuk kullanın. Kromik asit bir cam kapak kayma yerleştirin ve 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede bir fırına aktarın. Coverslip'i su yla temizleyin ve ardından mutlak etil alkolü temizleyin ve bir azot akışı ile kapağı kurulayın.

Coverslip'i oda sıcaklığında bir saat boyunca hacim APTES toluen çözeltisi ile %1 hacimde batırın ve ışıktan koruyun. Coverslip'i önce toluen ile yıkayın, sonra mutlak etil alkol le yıkayın ve kapağı bir nitrojen akışı ile kurulayın. Coverslip'i 80 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.

DMSO çözeltisine mililitre Sulfo-SMCC başına 200 mikrolitre lik bir miligram eklemek için bir pipet kullanın. Bir saat sonra, artık Sulfo-SMCC kaldırmak için önce DMSO ve daha sonra mutlak etil alkol ile kapakları yıkayın. Bir azot deresi altında kapak kayma kuru.

Pipet 60 mikrolitre 200 mikromolar GL-ELP-50 cys-protein çözeltisi üzerine fonksiyonel coverslip üzerine ve yaklaşık üç saat boyunca 25 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, reaksiyona girilmemiş GL-ELP-50-cys kaldırmak için ultra saf su ile coverslip yıkayın. İşlevselleştirilmiş kantilever yüzeyini hazırlamak için, önce kantileverleri kromik asitle batırın ve 80 derecede 10 dakika boyunca temizleyin.

Asidi temizlemek için su ve mutlak etil alkol kullanın. Bir saat boyunca plastik bir tüp kapağı amino salinizasyon gerçekleştirmek için hacim APTES toluen çözeltisi ile% 1 hacimli kantilever batırın. Mutlak etil alkol ile cantilever durulayın ve sonra 15 dakika boyunca 80 derece santigrat de kantilever pişirin.

Bir saat boyunca Sulfo-SMCC çözeltisi içinde kantilever batırın ve sonra mutlak etil alkol ile cantilever durulayın. Cys-ELP-50-NGL'yi yüzeye bağlamak için, cys-ELP-50-NGL'deki kantileverleri Sulfo-SMCC'nin maleimid grubuyla 1,5 saat batırın. Daha sonra reaksiyona yanmamış kis-ELP-50-NGL'yi ultra saf su ile kantilever üzerinde yıkayın.

Daha sonra, 200 nanomolar OaAEP1 ile 50 mikromolar GL-CBM-XDockerin protein çözeltisi 200 mikrolitre içeren bir çözelti de işlevsel leştirilmiş bir kantilite batırın ve 20 ila 30 dakika için 25 derece santigrat yerleştirin. Daha sonra tepkiverilmemiş proteini temizlemek için AFM tamponu kullanın. AFM deneyi öncesinde reaksiyona girmemiş artık proteini yıkamak çok önemlidir, çünkü bir kohesin-dockerin çiftleri oluşturacak ve yüzeyde yeni protein almak için kantili blok.

İlgi-NGL'nin ligasyon ünitesi cohesin-T-L-proteinini coverslip yüzeyinde hareketsiz hale getirilen GL-ELP-50'ye bağlamak için, kapak kaymasına 15 mikrolitre OaAEP1 ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tepkimeyen proteinleri temizlemek için 15 ila 20 mililitre AFM tamponu kullanın. TEV tanıma yerindeki protein ünitesini 25 santigrat derecede bir saat süreyle cleave için 100 mikrolitre TEV proteaz ekleyin.

Daha sonra artık proteinleri temizlemek için 15 ila 20 mililitre AFM tampon kullanın. İlgi-NGL'nin ligasyon ünitesi cohesin-T-L-proteinini OaAEP1 ile GL-ubiquitin-NGL camına 30 dakika bağlayın. Cam yüzey üzerine kurulacak GL-ubiquitin-NGL protein yapılacına bağlı olarak, poliprotein hazırlama adımlarını n1 kez tekrarlayın.

Protein polimerinde kohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL cam olarak rezerv kohesin için son TEV bölünme reaksiyonu atlayın. AFM sıvı odasına 10 milimolar kalsiyum klorür ve beş milimolar askorbik asit ile bir mililitre AFM tampon ekleyin. Deneme için işlevselleştirilmiş AFM sondasının D ucunu seçin.

Sondayı AFM arabelleğine batırın. Kantili, yüzeyden saniyede 400 nanometre sabit bir hızda geri çek. Bu arada, kuvvet uzatma eğrisini 4,000 hertz'lik bir örnek lem hızında kaydedin.

Her denemeden önce afm arabelleğindeki kantiliye doğru bir yay sabiti K değeri yle kalibre etmek için eşitlik teoremini kullanın. Kohesin-dockerin çiftini oluşturmak için kohesin ile işlevselleştirilmiş protein birikintisi yüzeyine dockerin ile işlevselleştirilmiş kantilever ucunu takın. Ardından JPK veri işleme yazılımını açın ve karakteristik testere dişi benzeri desen ve yüksek kopma kuvvetiyle kuvvet uzatma eğrisi seçin.

Bu çalışmada, OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları, açılma kuvveti ve kontra uzunluktaartış olarak ifade edilen polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilememiş ve önceki çalışmaile karşılaştırılabilir kalıntılar ortaya konmuştur. Ferrik form rubredoxin saflaştırılması tipik UV-görselleştirilmiş emilim zirveleri sundu 495 nanometre ve 575 nanometre çinko formu vermedi.

OaAEP1 ve saf OaAEP1 ile veya olmadan yarık GL-ubiquitin ve cohesin-TEV-L-ubiquitin ligasyon karışımı da gösterilmiştir. Başarılı peptid eki için aktif Sulfo-SMCC ile yüzeyi işlevselleştirmek çok önemlidir. Burada polimerize protein oluşturmak için yeni bir yöntem sağlar.

Araştırmacıların tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullanarak karmaşık protein sistemini incelemelerini kolaylaştırır. Kromik asit güçlü aşındırıcı ve asidiktir. Hazırlarken ve işlerken dikkatli olun.