Name: OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin, tek moleküllü kuvvet spektroskopisi için OaAEP1 enzimiyle polimerize protein sentezi ve immobilizasyonu yöntemini. Fonksiyonel kalıntıları koruyarak protein temelli malzeme inşasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 21771103, 21977047), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No) tarafından desteklenmiştir. BK20160639) ve Jiangsu Eyaleti Shuangchuang Programı.

1. Protein üretimi
<ol><li>
Gen klonu
	<ol>
<li>Satın alma genleri ilgi protein için kodlama (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, selüloz bağlayıcı modül (CBM), dockerin-X etki alanı (XDoc) ve Ruminococcus flavefaciencegelen uyum , tütün etch virüs (TEV) protease, elastin-likepeptids (ELP).</li>
		<li>Polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin ve farklı protein parçalarından geni yeniden birleştirmek için üç restriksiyonsindirim enzim sistemi BamHI-BglII-KpnI kullanın.</li>
		<li>Tüm genleri doğrudan DNA dizilimi ile doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteinlerin ekspresyonu ve üretimi
	<ol>
<li>E. coli BL21(DE3) pQE80L-POI veya pET28a-POI plazmid ile ifade için dönüştürün.</li>
		<li>15 mL LB orta sına tek bir koloni seçin ve ilgili antibiyotikler (örn. 100 μg/mL ampisilin sodyum tuzu veya 50 g/mL, kanamisin). 16-20 saat için 37 °C'de 200 rpm kültürleri sallayarak tutun.</li>
		<li>Bir gecede kültürleri 800 mL LB orta (1:50 seyreltme) içine seyreltin. Rubredoxin için, 1.800 x gkültür santrifüj , sonra M9 orta 15 mL yeniden askıya (0.4% glikoz ile takviye, 0.1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), ve sonra 800 mL M9 orta içine seyreltmek.</li>
		<li>Kültür 0,6 000 nm (OD600)optik yoğunluğa ulaşana kadar, 200 rpm sallayarak 37 °C'de kültür kuluçka. Protein ekspresyonunu test etmek için kültürün 100 μL'lik örneğini indüksiyon öncesi kontrol olarak kaydedin.</li>
		<li>1 mM'lik son konsantrasyona IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu teşvik edin ve 200 rpm'de 4 saat için 37 °C'de kültürü salla. Protein ekspresyonunu test etmek için indüksiyon sonrası kontrol olarak kültürün 100 μL'lik bir örneğini ayırın.</li>
		<li>4 °C'de 25 dakika için 13.000 x g'de kültürü santrifüj edin ve arınmadan önce -80 °C'de saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İlgi proteininin saflaştırılması
	<ol>
<li>25 mL lysis tampon (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 dNase, RNase, PMSF içeren) hücreleri yeniden askıya alın ve 30 dakika buz üzerinde 30 dakika boyunca lyse için bir sonicator (%15 genlik) kullanın.</li>
		<li>4 °C'de 40 dk için 19.000 x g'de hücre lisatını netleştirin.</li>
		<li>Co-NTA veya Ni-NTA yakınlık sütununun 1 mL'sini (yatak hacmi) paketleyin ve kolonu 10 kolon hacmi (CV) ultrasaf su ve ardından 10 CV'lik yıkama tamponu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) yerçekimi akışı ile yıkayın.</li>
		<li>Protein supernatant üç kez yerçekimi akışı ile sütun üzerinden geçirin.</li>
		<li>Kirletici proteinleri uzaklaştırmak için 50 CV ile kolon üzerine yıkama tampon dökün.</li>
		<li>3 CV buz gibi elüsyon tamponu (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4) ile bağlı proteini eute. Rubredoksin proteinleri söz konusu olduğunda, 4 °C'de pH 8.5'te aniyon değişim sütunu kullanılarak daha fazla anion değişimi arınması gereklidir.</li>
		<li>Örneği SDS-PAGE ile analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kapak ve kantil yüzeyinin işlevselleştirilmesi
<ol><li>
İşlevli kapak yüzey hazırlığı
	<ol>
<li>20 g potasyum kromatı 40 mL ultra saf suda çözün. Yavaşça cam çubuk ile potasyum kromat çözeltisi konsantre sülfürik asit 360 mL ekleyin yavaşça karıştırın ve kromik asit hazırlamak için. DİkKAT: Burada kullanılan kimyasal ve son kromik asit güçlü aşındırıcı ve asidiktir. Uygun koruyucu ekipmanla çalışın. Çözelti konsantre sülfürik asit eklediğinizde ısı bültenleri, hangi soğutma için yavaş ekleme ve uygun duraklama anlamına gelir.</li>
		<li>Kromik asit tedavisi ile 80 °C'de 30 dakika boyunca cam kapaklı bir sıvıyı temizleyin ve çalıştırın. Kapakları %1 (v/v) APTES toluen çözeltisine oda sıcaklığında 1 saat batırırken ışıktan tamamen koruyun.</li>
		<li>Coverslip'i toluen ve mutlak etil alkolle yıkayın ve kapağı bir nitrojen akışı yla kurulayın.</li>
		<li>Coverslip'i 80 °C'de 15 dk kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğutun.</li>
		<li>İki immobilize kapak ve inkübatör arasına dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi içinde 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/mL) ekleyin.</li>
		<li>Artık sulfo-SMCC'yi çıkarmak için önce DMSO ve ardından mutlak etil alkol ile kapak kaymasını yıkayın.</li>
		<li>Bir azot deresi altında kapak kayma kuru.</li>
		<li>Pipet 60 μL 200 μM GL-ELP50nm-C protein çözeltisi üzerine fonksiyonel coverslip ve kuluçka yaklaşık 3 saat.</li>
		<li>Reaksiyona girilmemiş GL-ELP50nm-C'yi çıkarmak için coverslip'i ultra saf suyla yıkayın. NOT: İşlevselleştirilmiş kapaklar 4 °C'de yaklaşık iki hafta boyunca depolanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İşlevselleştirilmiş cantilever yüzey hazırlığı
	<ol>
<li>Konisi kromik asit tedavisi ile 10 dk boyunca 80 °C'de temizleyin.</li>
		<li>% 1 (v/v) APTES toluen çözeltisi ile amino-silanizasyon ile cantilever fonksiyonel ve daha sonra sulfo-SMCC konjugating önce 15 dakika boyunca 80 °C'de kantili pişirin.</li>
		<li>C-ELP50nm-NGL'yi 1,5 saat boyunca sulfo-SMCC'nin maleimid grubu ile yüzeye bağla.</li>
		<li>Reaksiyona yanmamış C-ELP50nm-NGL'yi ultra saf su yla kapak üzerinde yıkayın.</li>
		<li>20-30 dk boyunca 200 nM OaAEP1 içeren 50 μM GL-CBM-XDoc protein çözeltisinin 200 μL'lik işlevselleştirilmiş bir kantilini 25 °C'de batırın. Daha sonra reaksiyona girilmemiş proteini temizlemek için AFM tamponunu (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) kullanın. NOT: Kantinlerin yüzey kimyası ve kapak kayması benzerdir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kontrollü dizili stepwise poliprotein preparatı
<ol><li>OaAEP1 tarafından 30 dakika boyunca kapak yüzeyinde hareketsiz hale getirilen GL-ELP50nm'ye ligasyon ünitesi Coh-tev-L-POI-NGL bağlayın.</li>
	<li>Tepkimeyen proteinleri temizlemek için 15-20 mL AFM tampon (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) kullanın.</li>
	<li>TEV'deki protein ünitesini 25 °C'de 1 saat süreyle ayırmak için 100 μL TEV proteaz (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl %10 [v/v] gliserol, pH 8.0) ekleyin.</li>
	<li>Artık proteinleri temizlemek için 15-20 mL AFM tampon kullanın.</li>
	<li>Ligasyon ünitesi Coh-tev-L-POI-NGL'yi OaAEP1'in GL-Ub-NGL-Glass'ına 30 dakika boyunca bağlayın.</li>
	<li>Cam yüzeyinde GL-(Ub) n-NGL protein ibaratınıoluşturmak için 3,3 ila 3,5 N-1 kez adımları tekrarlayın. Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass olarak protein-polimer üzerinde rezerv kohesin için son TEV dekolte reaksiyonu atlayın.</li>
</ol>4. AFM Deney ölçümü ve veri analizi
<ol><li>
AFM ölçümleri
	<ol>
<li>10 mM CaCl2 ve 5 mM Askorbik Asit ile hazneye 1 mL AFM tampon ekleyin.</li>
		<li>Deneme için işlevselleştirilmiş AFM sondasının D ucunu seçin. Her denemeden önce afm arabelleğindeki kantili(k)değeriyle kalibre etmek için eşitlik teoremini kullanın.</li>
		<li>Cohesin/Dockerin çiftini oluşturmak için kantilever ucunu numune yüzeyine takın.</li>
		<li>Kantili yüzeyden sabit bir hızda 400 nm·s−1'den geri çekin. Bu arada, kuvvet uzatma eğrisini 4000 Hz'lik bir örneklem hızında kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Veri analizi
	<ol>
<li>JPK veri işleme seçme kuvvet uzantısı izlemelerini kullanın.</li>
		<li>İzleri analiz etmek için yazılımı kullanın. Polimer elastikiyetinin solucan benzeri zincir (WLC) modeliyle eğrileri sığdırın ve bireysel protein iniştirme zirvesi için açılma kuvveti ve kontur uzunluğu artışını elde edin.</li>
		<li>Açılma kuvvetinin (<Fu>) ve kontur uzunluğu artışını (<ΔLc>) en olası değerleri elde etmek için Gaussian modeliile açılma kuvvetlerinin histogramlarını sığdırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Enzimatik biyosentez ve poliproteinimmobilizasyonu için bir protokol tanımladık ve afm tabanlı SMFS tarafından poliprotein tasarımını doğruladık. Bu metodoloji, poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon4,6,52, 53,54,55,56,57,58,<sup c...

Sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında, doğal çok etki alanı proteinleri iyi kontrollü bir sayı ve subdomains1türü ile tek düze bir yapıya sahip. Bu özellik genellikle gelişmiş biyolojik fonksiyon ve kararlılık yol açar2,3. Sistein bazlı disülfür bağı bağlantısı ve rekombinantDNA teknolojisi gibi birçok yaklaşım, birden fazla etki alanı4,5,6,7ile böyle bir polimerize protein oluşturmak için geliştirilmiştir. Ancak, eski yöntem her zaman rasgele ve kontrolsüz bir dizi sonuçlanır, ve ikincisi toksik ve büyük boyutlu proteinlerin aşırı ekspresyonu ve kofaktör ve diğer hassas enzimler ile karmaşık protein saflaştırılması için zorluk da dahil olmak üzere diğer sorunlara yol açar.
Bu zorluğu aşmak için, protein monomerini polimer/poliprotein için adım adım bir şekilde bir protein ligaz OaAEP1 ile proteaz TEV8,9ile birleştiren enzimatik bir yöntem geliştiriyoruz. OaAEP1 sıkı ve etkili bir endopeptidazdır. N-terminus Gly-Leu kalıntısı (GL) ise iki protein Kovalent Olarak Asn-Gly-Leu dizisi (NGL) OaAEP1 tarafından iki termini ile 30 dakikadan daha az ve c-terminus NGL kalıntıları10ise bağlanabilir. Ancak, OaAEP1'in sadece protein monomerini bağlamak için kullanılması, sistein bazlı kaplin yöntemi gibi kontrolsüz bir diziye sahip bir protein polimerine yol açar. Bu nedenle, protein ünitesinin N-terminus'unu çıkarılabilir bir TEV proteaz alanı ve enlyfq/G-L-POI olarak bir lösin kalıntısı ile tasarlıyoruz. TEV bölünmesinden önce, N-terminali OaAEP1 ligasyonuna katılmaz. Ve daha sonra N-terminus gl artıkları, hangi daha fazla OaAEP1 ligasyon ile uyumludur, TEV bölünme sonra maruz kalır. Böylece, nispeten iyi kontrol edilen bir dizi ile poliproteinin sıralı enzimatik biyosentez yöntemini elde ettik.
Burada, adım adım enzimatik sentez yöntemimiz, sekans kontrollü ve kontrolsüz dahil olmak üzere poliprotein numune hazırlamada ve özellikle karmaşık sistem için tek moleküllü çalışmalar için protein immobilizasyonunda kullanılabilir. metalloprotein.
Ayrıca, AFM tabanlı SMFS deneyleri bize tek molekül düzeyinde protein polimer inşaat ve istikrar onaylamak için izin verir. AFM, optik cıvık ve manyetik cıvık da dahil olmak üzere tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, biyomolekülü mekanik olarak manipüle etmek ve stabilitelerini ölçmek için nanoteknolojide genel bir araçtır11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Tek moleküllü AFM yaygın protein çalışmasında kullanılmıştır (un)katlama21,22,23,24,25, reseptör-ligandetkileşimininmukavemet ölçümü 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, inorganik kimyasal bağ20,36,37,38,39,40,41,42,43 ve metal-ligand bond metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Burada, tek moleküllü AFM, sentezlenen poliprotein dizisini ilgili protein açılma sinyaline göre doğrulamak için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>demir (III) klorür hekzahidrat</td><td>Enerji kimyasalı</td><td></td><td>%99</td></tr> <tr><td>Çinko klorür</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>%100,00</td></tr> <tr><td>kalsiyum klorür hidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>%99,9965 kristal agrega</td></tr><tr><td>L-Askorbik Asit</td><td>Sigma Life Science</td><td></td><td>Bio Xtra, &ge; % 99.0, kristalli</td></tr> <tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>& ge; % 99</td></tr> <tr><td>sülfosüksinimidil 4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>% 90</td></tr> <tr><td>Gliserol</td><td>Macklin</td><td></td><td>% 99</td></tr><tr><td>% 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoik asit)</td> <td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genleri Genscript</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanowizard 4 AFM</td><td>JPK Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLCT konsol</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mono Q 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>Yelken Marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel Görüntü Sistemi</td><td>Tanon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oaaep1-tek moleküllü kuvvet spektroskopisi İçin polimerize proteinin aracılı enzimatik sentezi ve immobilizasyonu

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Kimyasal ve biyo-konjugasyon teknikleri son yıllarda hızla geliştirilmiş ve protein polimerlerinin oluşturulmasına olanak sağlar. Ancak, kontrollü bir protein polimerizasyon süreci her zaman bir meydan okumadır. Burada, polimerize proteini adım adım rasyonel olarak kontrol edilen bir dizide oluşturmak için enzimatik bir metodoloji geliştirdik. Bu yöntemde, bir protein monomer C-terminus OaAEP1 kullanarak protein çekimi için NGL(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) N-terminus bir dekolte TEV iken (tütün etch virüs) dekolte sitesi artı bir L (ENLYFQ / GL) geçici N-terminal koruma için. Sonuç olarak, OaAEP1 bir seferde sadece bir protein monomer eklemek başardı, ve sonra TEV proteaz NH2-Gly-Leu ortaya çıkarmak için Q ve G arasındaki N-terminus cleaved. Sonra birim sonraki OaAEP1 ligasyon için hazırdır. Tasarlanmış poliprotein atomik kuvvet mikroskobu tabanlı tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (AFM-SMFS) kullanılarak bireysel protein etki alanı açılarak incelenir. Bu nedenle, bu çalışma poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon için yararlı bir strateji sağlar.

OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilemez, zira açılma kuvveti (<f>u&gt;) ve kontur uzunluğu artış (&lt;ΔLc&gt;) önceki çalışmayla karşılaştırılabilir(Şekil 1). Rubredoksin proteininin arınma sonucu Şekil 2'degösterilmiştir. TEV dekoltesi sonrası proteini kanıtlamak için aşağıdaki OaAEP1 ligasyonu ile uyumlu durarak protein polimerini kontrol sırası ile oluşturmak ve yapı...

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Enzimatik yöntemimiz protein oligomerini kontrollü sayıda polimerizasyon derecesi ile kullanmaktadır. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışması nın yanı sıra protein bazlı malzeme yapımı için mükemmel bir örneklem hazırlığıdır. Yöntemimiz hedef proteine sistein getirmez.Sistein protein için en önemli fonksiyonel kalıntılardan biri olduğu için polimerize madde proteini veya enzimlerinin oluşturulmasını kolaylaştırır. Prosedürü gösteren ler, yibing Deng ve Shengchao Shi, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri olacaklar. Başlamak için, bir kabın içinde ultrasaf su 40 mililitre potasyum kromat 20 gram eritin.Yavaş yavaş potasyum dikromat çözeltisi konsantre sülfürik asit 360 mililitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için bir cam çubuk kullanın. Kromik asit bir cam kapak kayma yerleştirin ve 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede bir fırına aktarın. Coverslip'i su yla temizleyin ve ardından mutlak etil alkolü temizleyin ve bir azot akışı ile kapağı kurulayın.Coverslip'i oda sıcaklığında bir saat boyunca hacim APTES toluen çözeltisi ile %1 hacimde batırın ve ışıktan koruyun. Coverslip'i önce toluen ile yıkayın, sonra mutlak etil alkol le yıkayın ve kapağı bir nitrojen akışı ile kurulayın. Coverslip'i 80 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.DMSO çözeltisine mililitre Sulfo-SMCC başına 200 mikrolitre lik bir miligram eklemek için bir pipet kullanın. Bir saat sonra, artık Sulfo-SMCC kaldırmak için önce DMSO ve daha sonra mutlak etil alkol ile kapakları yıkayın. Bir azot deresi altında kapak kayma kuru.Pipet 60 mikrolitre 200 mikromolar GL-ELP-50 cys-protein çözeltisi üzerine fonksiyonel coverslip üzerine ve yaklaşık üç saat boyunca 25 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, reaksiyona girilmemiş GL-ELP-50-cys kaldırmak için ultra saf su ile coverslip yıkayın. İşlevselleştirilmiş kantilever yüzeyini hazırlamak için, önce kantileverleri kromik asitle batırın ve 80 derecede 10 dakika boyunca temizleyin.Asidi temizlemek için su ve mutlak etil alkol kullanın. Bir saat boyunca plastik bir tüp kapağı amino salinizasyon gerçekleştirmek için hacim APTES toluen çözeltisi ile% 1 hacimli kantilever batırın. Mutlak etil alkol ile cantilever durulayın ve sonra 15 dakika boyunca 80 derece santigrat de kantilever pişirin.Bir saat boyunca Sulfo-SMCC çözeltisi içinde kantilever batırın ve sonra mutlak etil alkol ile cantilever durulayın. Cys-ELP-50-NGL'yi yüzeye bağlamak için, cys-ELP-50-NGL'deki kantileverleri Sulfo-SMCC'nin maleimid grubuyla 1,5 saat batırın. Daha sonra reaksiyona yanmamış kis-ELP-50-NGL'yi ultra saf su ile kantilever üzerinde yıkayın.Daha sonra, 200 nanomolar OaAEP1 ile 50 mikromolar GL-CBM-XDockerin protein çözeltisi 200 mikrolitre içeren bir çözelti de işlevsel leştirilmiş bir kantilite batırın ve 20 ila 30 dakika için 25 derece santigrat yerleştirin. Daha sonra tepkiverilmemiş proteini temizlemek için AFM tamponu kullanın. AFM deneyi öncesinde reaksiyona girmemiş artık proteini yıkamak çok önemlidir, çünkü bir kohesin-dockerin çiftleri oluşturacak ve yüzeyde yeni protein almak için kantili blok.İlgi-NGL'nin ligasyon ünitesi cohesin-T-L-proteinini coverslip yüzeyinde hareketsiz hale getirilen GL-ELP-50'ye bağlamak için, kapak kaymasına 15 mikrolitre OaAEP1 ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tepkimeyen proteinleri temizlemek için 15 ila 20 mililitre AFM tamponu kullanın. TEV tanıma yerindeki protein ünitesini 25 santigrat derecede bir saat süreyle cleave için 100 mikrolitre TEV proteaz ekleyin.Daha sonra artık proteinleri temizlemek için 15 ila 20 mililitre AFM tampon kullanın. İlgi-NGL'nin ligasyon ünitesi cohesin-T-L-proteinini OaAEP1 ile GL-ubiquitin-NGL camına 30 dakika bağlayın. Cam yüzey üzerine kurulacak GL-ubiquitin-NGL protein yapılacına bağlı olarak, poliprotein hazırlama adımlarını n1 kez tekrarlayın.Protein polimerinde kohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL cam olarak rezerv kohesin için son TEV bölünme reaksiyonu atlayın. AFM sıvı odasına 10 milimolar kalsiyum klorür ve beş milimolar askorbik asit ile bir mililitre AFM tampon ekleyin. Deneme için işlevselleştirilmiş AFM sondasının D ucunu seçin.Sondayı AFM arabelleğine batırın. Kantili, yüzeyden saniyede 400 nanometre sabit bir hızda geri çek. Bu arada, kuvvet uzatma eğrisini 4,000 hertz'lik bir örnek lem hızında kaydedin.Her denemeden önce afm arabelleğindeki kantiliye doğru bir yay sabiti K değeri yle kalibre etmek için eşitlik teoremini kullanın. Kohesin-dockerin çiftini oluşturmak için kohesin ile işlevselleştirilmiş protein birikintisi yüzeyine dockerin ile işlevselleştirilmiş kantilever ucunu takın. Ardından JPK veri işleme yazılımını açın ve karakteristik testere dişi benzeri desen ve yüksek kopma kuvvetiyle kuvvet uzatma eğrisi seçin.Bu çalışmada, OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları, açılma kuvveti ve kontra uzunluktaartış olarak ifade edilen polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilememiş ve önceki çalışmaile karşılaştırılabilir kalıntılar ortaya konmuştur. Ferrik form rubredoxin saflaştırılması tipik UV-görselleştirilmiş emilim zirveleri sundu 495 nanometre ve 575 nanometre çinko formu vermedi.OaAEP1 ve saf OaAEP1 ile veya olmadan yarık GL-ubiquitin ve cohesin-TEV-L-ubiquitin ligasyon karışımı da gösterilmiştir. Başarılı peptid eki için aktif Sulfo-SMCC ile yüzeyi işlevselleştirmek çok önemlidir. Burada polimerize protein oluşturmak için yeni bir yöntem sağlar.Araştırmacıların tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullanarak karmaşık protein sistemini incelemelerini kolaylaştırır. Kromik asit güçlü aşındırıcı ve asidiktir. Hazırlarken ve işlerken dikkatli olun.

oaaep1-mediated-enzymatic-synthesis-immobilization-polymerized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Elektronik dilin (eT) inşası için, algılama malzemelerinin tasarımını ve üretimini büyük ölçüde basitleştiren ve eT'nin sıvıdaki numuneler için sürekli evrim profilleri ve manzaraları oluşturmasına izin veren yeni bir yaklaşım tanımlanmıştır. Elde edilen eT, ayrımcılık gibi yaygın protein analizi için etkilidir.

Protein Analiz Sürekli Tanıma Desenler oluşturma Elektronik Dil

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Burada, L-dihydroxyphenylalanine uzarlar basit başlangıç malzemelerden genetik birleşme ve protein konjugasyon için uygulama için bir iletişim kuralı mevcut.

Genetik birleşmesiyle uzarlar L-dihydroxyphenylalanine (basıncın) ve uygulama için Protein konjugasyon

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Öğrenin, tek moleküllü kuvvet spektroskopisi için OaAEP1 enzimiyle polimerize protein sentezi ve immobilizasyonu yöntemini. Fonksiyonel kalıntıları koruyarak protein temelli malzeme inşasına olanak tanır.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Daha fazla video keşfet