İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Bu protokol, araştırmacılara preklinik fizyolojik ilaç testleri için donör insan kalbini kullanma becerileri sağladığı için önemlidir. Bu doku, insan doku dilimlerinde kardiyak etki potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı karakterizasyonu için hem voltaj hem de kalsiyum boyaları kullanır. Optik haritalama sistemi kurmak için, bir perfüzyon sistemine bir alt polidimetilsiloksane jel tabakası ile bir doku banyosu eklemek ve 37 santigrat derece de kurtarma çözeltisi bir litre sirkülasyon santigrat sıcaklığı korumak ve banyo perfusat birikmesini önlemek için yeterince hızlı bir akış hızında perfüzyon sistemi ile% 100 oksijen ile oksijenli.

Ardından, iki CMOS kameranın odak ve hizalanmasını ayarlamak için bir hedef kullanın ve voltaj duyarlı ve kalsiyum gösterge boyalarını aynı anda heyecanlandırmak için 520 artı veya eksi beş nanometre dalga boyuna sahip yeşil bir LED ışık kaynağı kullanın. Doku bölümleri elde etmeden önce, dondurulmuş ve sıvı kardiyopleji çözeltisi karıştırın ve buz soğuk kardiyopleji banyo içine kalp dokusu yerleştirin ve sol ventrikül serbest duvar tanımlamak. Vibratom metal doku tutucuları arkasına önceden yapılmış agarose jel tutkal.

Soğuk kardiyoplejik çözelti doku bir santimetre küp blokları kesin ve hızlı bir şekilde endokardiyal yüzeyler yukarı bakan metal doku tutucuları üzerine doku blokları monte etmek için topikal deri yapıştırıcı kullanın. Metal tutucuları buz gibi oksijenli dilimleme çözeltisinin vibratom banyosuna aktarın, böylece dokular tamamen batırılır ve bıçağı dokunun ön kenarına taşıyın. Önceden ayarlanmış parametrelerle dilimleme başlamak için vibratome açın, bıçak pürüzsüz endokardiyal doku içine trabeculae ötesine ulaşana kadar ilk birkaç dilim atarak.

Deneysel dokuya ulaşıldığında, her dilimi oda sıcaklığında tyrode'un iyileşme solüsyonu içeren bir kültür kabında 100 mikrometrelik naylon kafes hücre süzgecine dikkatlice aktarın ve doku dilimlerinin kıvrılmasını engellemek için dilimleri örgü yıkayıcılarla kapatın. Tüm dilimler toplandığında, her dilimi her kuyuda üç mililitre PBS içeren altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına dikkatlice aktarın. Dilimi nazik bir şekilde sallayarak durulayın ve numuneleri kuyu başına 37 derece santigrat kültür ortamına ait üç mililitre içeren altı kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına aktarmadan önce bu işlemi taze steril PBS ile üç kez tekrarlayın.

Sonra 37 derece, % 30 oksijen ve% 5 karbondioksit bir nemlendirilmiş kuluçka dakikada 20 devrimleri bir yörünge shaker üzerine plaka yerleştirin. Taze kesilmiş dilimler için geri kazanım çözümünde 20 dakika sonra veya hemen ardından, dikkatle perfüzyon sistemi doku banyosu ilgi dilimi transfer ve dokuya minimal streç uygularken jel tabakasına dört köşe aşağı pin. Geri kazanım çözeltisinin rezervuarına 0,3 ila 0,5 mikrolitre stok Blebbistatin eklemeden önce yaklaşık 10 dakika boyunca sirkülasyon çözeltisi ile dilimlerin bu banyoda dinlenmesine izin verin.

Dilim Blebbistatin'de kuluçkaya yatarken, 37 derecede bir mililitre geri kazanım çözeltisinde stok gerilimine duyarlı boyanın 30 mikrolitresini yeniden oluşturur. Blebbistatin tedavisi 10 dakika sonra, pompaları kapatın ve yavaş yavaş 30 saniye lik bir süre içinde dilimin yüzeyine çalışan boya çözeltisi 0,2 ila 0,3 mililitre yükleyin. 90 saniye sonra, herhangi bir fazla boya yıkayın için pompaları açın.

Stok kalsiyum göstergesi ile dilim öldükten sonra, dilim üzerine kameralar odaklanmak ve önceden belirlenmiş pacing eşik genlik 1,5 kat iki milisaniye darbe genişliği süresi ile bir hertz de dilim hızı. Doku diliminin üzerine bir kapak kaydırın ve LED uyarma ışık kaynağı ile dilimi aydınlatın. Daha sonra yayılan voltaj ve kalsiyum sinyallerini kameralarla saniyede 1.000 kare olarak kaydedin.

Gerilim ve kalsiyum optik haritalama verilerini koşullandırmak için, uygun analiz yazılımında, koşul parametrelerini tıklatın ve arka planı kaldırın. Daha sonra optimum etki potansiyeli ve kalsiyum geçici izleri elde etmek için sinyal klima parametrelerini ayarlayın. İletim hızını hesaplamak için etkinleştirme haritasını seçin ve izlemede tek bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde bir başlangıç ve bitiş saati girin.

Ardından bölgesel haritayı tıklatın ve seçilen bölgenin etkinleştirme haritasını görüntülemek için ilgi çekici bölgeyi seçin. Ardından, iletim hızı haritasını seçin ve başlangıç ve bitiş saatlerini seçin. Gerektiğinde kuruluma göre pikseller arası çözünürlük değerlerini ayarlayın.

İlgi çekici bir bölge seçmek ve o bölgedeki iletim hızı vektörlerini görüntülemek için vektör haritasını oluştur'u tıklatın. Analizde yer alan ortalama, ortanca, standart sapma ve vektör sayısı ile seçilen bölgedeki iletim hızı vektörlerinin ortalama yayılma açısı görüntülenir. Eylem potansiyelini hesaplamak için, eylem potansiyeli süresini, kalsiyum geçici süre haritasını seçin ve tam bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde başlangıç ve bitiş saatlerini seçin.

Ardından, ilgi alanı seçmek ve eylem potansiyeli süresi eşlemi oluşturmak için bölgesel eylem potansiyel süresi hesaplamasını tıklatın. Yükselme süresini belirlemek için, yükseliş süresini seçin ve tek bir eylem potansiyelinin veya kalsiyum geçicisinin yukarı vuruşunu seçmek için başlangıç ve bitiş saatlerini seçin. Başlangıç ve bitiş yüzdesi değerlerini girin ve ilgi bölgesini seçmek ve artış zamanının analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için hesapla'yı tıklatın.

Kalsiyum bozunmasını belirlemek için kalsiyum bozunumu seçin ve tek bir kalsiyum geçici sinyalin tüm çürüme kısmını kapsayacak şekilde başlangıç ve bitiş saatlerini girin. Daha sonra ilgi bölgesini seçmek ve kalsiyum bozunma süresi sabitinin analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için tau'yu hesapla'yı tıklatın. Bu temsili deneyde, eylem potansiyeli ve kalsiyum geçici izleri sinyal şartlı edildi.

Aktivasyon süreleri her piksel için belirlendi ve aktivasyon sürelerinin isokronal haritaları koşullu voltaj ve kalsiyum izlerinden çizildi. İletim hızı vektörleri aktivasyon süreleri ve bilinen pikseller arası çözünürlük kullanılarak hesaplanmıştır. Kalsiyum geçici bozunma sabiti, kalsiyum izlerinin çürüyen kısmına bir polinom takılarak ölçüldü.

Etki potansiyel süresi ve kalsiyum geçici süresi aktivasyon süresi ile sitoplazmadan yeniden polarizasyon veya kalsiyum uzaklaştırılmasının belirli bir yüzdesi arasındaki süre olarak ölçüldü. Voltaj ve kalsiyum izlerinin yükselme süreleri de ölçüldü ve haritalandı. Bu temsili analizde, doksorubisin kardiyak iletim üzerindeki etkisi enine iletim hızının azalması ile sonuçlanmıştır.

Dilimleme işlemi sırasında dokuya verilen zararı en aza indirmek ve uygun dilimler elde etmek için dilimlerin tam kardiyoplejik arrest içinde olduğundan emin olmak önemlidir. Protokolün sonunda, dilimler dondurulabilir veya moleküler değerlendirme için sabitlenebilir. İlgi elektrofizyolojik fenomeninde yer alan mekanistik yollar daha sonra belirlenebilir.

Bu insan kardiyak dilim modelinin geliştirilmesi hayvan ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu köprü insan kalp dokusunda tedavi ve hastalığa yanıtların çalışma izin verdi. Bu tekniği yaparken insan dokuları ile çalışırken, uygun PPE giymek ve diğer gerekli güvenlik önlemleri almak için emin olun.