Name: Agrobacterium rhizogenestarafından Kıllı Kökleri Indükleyen -Tartary Karabuğday Aracılı Dönüşüm (Fagopyrum tataricum) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin, Agrobacterium rhizogenes aracılı dönüşümle Fagopyrum tataricum'da kıllı kök indüksiyonu yöntemini. Bu teknik, genomik ve metabolit araştırmaları için ekonomik bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Merkezi kamu refahı araştırma enstitüleri ZXKT17002 için Temel Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan Tüberküloz BT18 olarak adlandırılmıştır, hangi "JinQiao No.2" Shanxi Tarım Bilimleri Akademisi Küçük Çeşitli Tahıl Araştırma Merkezi tarafından yetiştirilen cins kökenli. Bu protokolün birincil adımları Şekil 1'degösterilmiştir.
NOT: Ekstelasyonla ilgili manipülasyonu hızlı bir şekilde çalıştırın ve mümkün olduğunda solma ve kontaminasyonu önlemek için Petri kaplarını kapalı tutun. Aksi belirtilmedikçe, tüm eksplant kuluçkaları 14 saat ışık ve 25 °C'de 10-h karanlık fotoperiod koşuluyla gerçekleştirilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tüm eksplants- veya bakteri ile ilgili operasyonlar bir laminar akış kaputunda aseptik koşullar altında yapıldı. A. rhizogenes ve in vitro bitki kültürleri için tüm ortam malzemeleri Tablo 1'deverilmiştir. pH ayarlandıktan sonra, tüm ortam 120 °C'de 20 dk. Katılaşmış ortam, 25 mL'lik ortamın 9 cm çapındaki petri kabına doldurularak ve katılaşmasına izin vererek otoklavhaline getirilmiş.
DİkKAT: Genetiği değiştirilmiş tüm bakteri ve bitkileri uygun atık kabına yatırın. Tüm tehlikeli kimyasalları bir duman dolabında çalıştırın ve bunları tehlikeli atık kabına yatırın.
1. Tüberküloz eksplantlarının hazırlanması
<ol><li>Tüberküloz tohumlarının hazırlanması<ol>
<li>−20 °C'den daha düşük bir sıcaklıkta 2 yıldan fazla olmayan tombul ve hasarsız TB tohumlarını(Şekil 1A1)seçin.</li>
		<li>Tohumları 28 °C'de yaklaşık 20 dakika suda bekletin, böylece tohum kat kolayca soyulabilir (Şekil 1A2). Gerekirse, soyma kolaylaştırmak için tohumlar üzerinde bir yuva kesmek için makas kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüberküloz tohumlarının sterilizasyonu<ol>
<li>100-200 soyulmuş tohumu 100 mL steril konik şişeye yerleştirin.</li>
		<li>30 s için% 75 etanol kullanarak tohumları dezenfekte.</li>
		<li>% 5 sodyum hipoklorit ve 15 dakika dezenfekte ile etanol değiştirin. NOT: 8 dk için 1 g/L konsantrasyonda cıva biklorür kullanılarak yapılan dezenfeksiyon, yetersiz sterilizasyon durumunda sodyum hipokloritin yerine alternatif sterilizatör olarak kullanılabilir. DİkKAT: Cıva biklorür tehlikelidir ve çevre dostu bir malzeme değildir. Cıva biklorür her durumda kullanılırsa, fuming dolap ta çalıştırın ve tehlikeli atık konteyner içine yatırın.</li>
		<li>Sodyum hipoklorit dökün.</li>
		<li>Tohumları steril deiyonize su kullanarak 5 kez yıkayın.</li>
		<li>Blot tohumları steril bibulous kağıt ile kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüberküloz fidelerinin hazırlanması<ol>
<li>Hazırlamak 50 mL Murashige ve Skoog (MS) bazal orta (1962) 30 g / L sakkaroz ve 7 g / L agar tozu (MSSA) (Tablo 1) ile takviye 300 mL bitki doku kültür şişesi.</li>
		<li>Otomatik otoklavlamadan önce pH'ı 5,8'e ayarlayın.</li>
		<li>MSSA orta şişe başına eşit olarak 10 tohum dağıtın.</li>
		<li>Tohumları 25 °C ± 1 °C'deki bir kültür odasında 7-10 gün boyunca ışık koşulunda çimleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril eksplantların hazırlanması<ol>
<li>2 adet karyola açıldığında, 2 adet karyola açığa çıktığında, Sağlam TB fidelerini(Şekil 1C)seçin.</li>
		<li>Köklerden fideler kesin (Şekil 1C kırmızı çizgi ok başları),orta ile temas kaçınarak.</li>
		<li>Steril petri kabına koyun.</li>
		<li>Hipokotilleri 0,8-1 cm segmentler halinde kesin ve karyolaları yaklaşık 0,5 cm'lik parçalara ayırın.</li>
		<li>Preculture bu explants MSSA ortamda 24 saat hafif koşullar altında.</li>
		<li>100 mL steril konik şişeiçine aktarın, hangi şimdi enfeksiyon için hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dönüşüm için A. rhizogenes hazırlanması
NOT: A. rhizogenes suşu ACCC10060 Tıbbi Bitki Geliştirme Enstitüsü tarafından sağlanmış ve −80 °C'de korunmuştur. A. rhizogenes, bir gösterge geni olarak GFP'ye eşlik eden b4 geni taşıyan bir T-DNA'yı barındıran ikili pK7GWIWG2D (II) ve seçilebilir bir belirteç olarak Kan direnç geni ile dönüştürüldü. B4 geni henüz yayınlanmamış transkripsiyon faktörü bHLH ailesinin bir üyesidir. Tüberküloz kıllı köklerin potansiyelini değerlendirmek için A. rhizogenes MYB116 geni içeren ikili vektör pK7WG2D ile dönüştürülerek gen ekspresyonu düzeyinde flavonoidler gibi sekonder metabolitlerin üretimi üzerindeki etkisini araştırmak ve metabolik analizlerle dönüştürüldü. Aktive A. rhizogenes eksekslerle aynı anda iyi hazırlanmalıdır.
<ol><li>A. rhizogenes aktivasyonu
	<ol>
<li>Buz üzerinde çözülme A. rhizogenes</li>
		<li>Bakterileri batırın ve 15 g/L agar tozu, 50 mg/L rifampisin ve 50 mg/L spektinomisin (YEBARS, pH 7.0) ile takviye edilmiş maya mannitol ortamına (YEB) eşit olarak yerleştirin.</li>
		<li>Bakterileri 28 °C'de 12-16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bir monoklonal koloni seçin ve aynı yukarıda açıklanan şekilde başka bir Petri çanak kültür.</li>
		<li>20 mg/L rifampisin ve 50 mg/L spectinomycin (YEBRS, pH 7.0) ile takviye edilmiş 20 mL'lik steril konik şişede monoklonal kolonileri seçin ve 16-18 saat od600 değeri 2.0'a ulaşana kadar 200 rpm'de seçin.</li>
		<li>OD600 değeri yaklaşık 0.5'e ulaşana kadar 28 °C'de 20 mL YEBRS orta ve 4-5 saat için 200 rpm içeren başka bir 100 mL konik şişede yukarıda bahsedilen kültürün %2-4'ünü kuluçkaya yatırın(Şekil 1D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tüberküloz eksektirlerinin enfeksiyonu ve taranması
NOT: Bu protokolün amacı genetik olarak dönüştürülmüş kıllı kökler elde etmektir. Yabani tip kökler transgenik ifadeyi değerlendirmek için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde A. rhizogenes ftmyb116 genini taşıyan pK7WG2D veya önceden b4 genini taşıyan pK7GWIWG2D (II) ikili vektörü ile dönüştürüldü.
<ol><li>A. rhizogenes resuspension
	<ol>
<li>Adım 2.1.6'da elde edilen kültürü 50 mL steril santrifüj tüpe aktarın.</li>
		<li>20 °C'de 10 dakika boyunca 4.000 x g'de spin.</li>
		<li>Supernatant çıkarın ve MS orta 30 g / L sakaroz ve 300 μM asetoziringon (AS) (MSSAS, pH 5.8) ile OD600 ile takviye ile bakteriyel pelet resuspend .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksbitki enfeksiyonu<ol>
<li>Adım 3.1.3'te elde edilen bakteriyel süspansiyonu, 10 dakika boyunca 1.4.6'da hazırlanan eksplanda hazırlanan eksplorları içeren konik bir şişeye aşılayın(Şekil 1E).</li>
		<li>Ekstesyonları alın ve steril bibulous kağıt kullanarak kuru lekeler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. A. rhizogenes ile eksedek yetiştiriciliği
<ol><li>30 g/L sakaroz ve 100 μM AS (MSSAAS orta, pH 5.2) ile takviye edilmiş 7 g/L agar tozu kullanılarak katılaştırılan MS ortamına 9 cm çapında steril bir filtre kağıdı yerleştirin.</li>
	<li>25 °C'de filtre kağıdına eksmeciyi karanlıkta 3 gün boyunca(Şekil 1F)yerle bir edin.</li>
</ol>5. İndüksiyon ve seçici kültür
<ol><li>MSSA ortamına 500 mg/L sefotaksim ve 50 mg/L kanamisin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) ile takviye edilmiş yaklaşık 20 enfekte eksbitki yerleştirin(Şekil 1G).</li>
	<li>25 °C ± 1 °C'de ışık koşulunda dikey olarak kuluçkaya yatırın. Tüylü kökler kuluçkadan yaklaşık 1 hafta sonra ortaya çıkar (Şekil 1H siyah çizgi ok uçları tüylü köklerin oluşumunu gösterir). NOT: Gerekirse her 15 günde bir MSSACK ortamını değiştirin.</li>
</ol>6. TB kıllı kökleri alt küle
NOT: Bu işlem güçlü kıllı kökleri hasat etmeyi amaçlamaktadır. Düzenli olarak yayılma sırasında kıllı köklerin büyümesini gözlemleyin ve kirlenmiş ve inaktive olanları zamanında çıkarın. Gerekirse, daha kıllı kökleri yaymak için aşağıdaki adımları tekrarlayın. Bu hasat için subculturing yaklaşık 10-14 gün sürer.
<ol><li>Beyaz görünüm ve hızlı büyüme gösteren tüylü kökleri seçin.</li>
	<li>2-3 cm parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Açıkça temiz bir bankta numaralandırmak.</li>
	<li>30 g/L sakaroz ve 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) ile takviye edilmiş 5 mL MS orta içeren 100 mL steril konik şişede alt kültür, karanlıkta 25 °C'de 80 rpm'lik bir döner hızda şişenin dibine kadar geniş bir alana yayılana kadar(Şekil 1I).</li>
</ol>7. Dönüştürülmüş kıllı köklerin belirlenmesi ve korunması
NOT: Dönüştürülmüş kıllı kökler morfoloji ve gen düzeyi ne göre tanımlanabilir. Tanımlama, bu protokolde yer almayan kıllı kök genomu ve direncine göre de yapılabilir. Bu prosedür öncelikle muhabir gen ve hedef gen tanımlama üzerinde duruluyor.
<ol><li>Tawny ve kontamine kıllı kökleri çıkarın ve beyaz görünüme sahip olanları seçin.</li>
	<li>Mavi/ışık çift ultraviyole transilluminator altında yeşil floresan olup olmadığını değerlendirin.</li>
	<li>Numaralı tüplerde güçlü bir floresan sinyali sergileyen veya emici bir kağıtla kuruttuktan sonra işaretli bir folyo kullanılarak sarılmış tüylü kökleri seçin.</li>
	<li>Lyophilize sıvı azot, daha fazla araştırma için −80 °C tüm hasat depolama takip.</li>
	<li>Gen tanımlama<ol>
<li>Tüylü köklerin 0,1 g'ını sıvı nitrojende ince toz haline getirin.</li>
		<li>Bitki genomik DNA kiti üreticisinin talimatına göre modifiye cetyltrimethylammonium bromür (CTAB) yöntemi25 kullanarak TB bağımsız transgenik hatlarıgenomik DNA hazırlayın.</li>
		<li>Tablo 2'delistelenen 100 ng genomik DNA şablonu ve astar kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.</li>
		<li>Amplifikasyon döngüsünü aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 94 °C'de 5 dk için predenatürasyon, 30 s için 94 °C'de denatürasyon, 30 s için 55 °C'de astar lama ve 30 s için 72 °C'de astar uzatma. 36 döngü ve 10 dakika için 72 °C'de son uzatma adımından sonra amplifikasyon ürünlerini %1 agarose jelüzerinde analiz edin.</li>
		<li>Jelleri nükleik asit le bezle boyandın ve UV ışığı altında görselleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fabjan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartary+Buckwheat+%28+Fagopyrum+tataricum+Gaertn+.%29+as+a+Source+of+Dietary+Rutin+and+Quercitrin%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin.</a> Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Phenolic+Compounds+in+Hairy+Root+Culture+of+Tartary+Buckwheat+%28Fagopyrum+tataricum+Gaertn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crop+Science+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn).</a> Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-chiro-inositol-enriched+tartary+buckwheat+bran+extract+lowers+the+blood+glucose+level+in+KK-Ay+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).</li>
<li>Giri, A., Narasu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Transgenic hairy roots.</a> Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-induced+transcription+factor+FtMYB116+promotes+accumulation+of+rutin+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum.</a> Plant, Cell & Environment. 42, (2018).</li>
<li>Chilton, M. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+thizogenes+inserts+T-DNA+into+the+genomes+of+the+host+plant+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells.</a> Nature. 295 (4), 129(1982).</li>
<li>Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+Roots%3A+a+Powerful+Tool+for+Plant+Biotechnological+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Molecules+and+Medicinal+Plants%22%5BJournal%5D)">Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances.</a> Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).</li>
<li>Srivastava, S., Srivastava, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+for+mass-production+of+high-value+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Veena, V., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes%3A+Recent+developments+and+promising+applications%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).</li>
<li>Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+cultures%3A+Chemical+factories+of+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites.</a> Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).</li>
<li>Palazón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Ginsenoside+Production+in+Hairy+Root+Cultures+of+Panax+ginseng+using+a+Novel+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor.</a> Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).</li>
<li>Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elicitation+of+secondary+metabolites+in+in+vitro+cultures+of+Ammi+majus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L.</a> Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).</li>
<li>Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicidal+activity+of+phenolic+compounds+from+hairy+root+cultures+of+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum.</a> Weed Research. 52, 25-33 (2011).</li>
<li>Christey, M. C., Braun, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hairy+root+cultures+and+transgenic+plants+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).</li>
<li>Olhoft, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+method+of+soybean+%5BGlycine+max+%28L.%29+Merrill%5D+using+primary-node+explants+from+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), (2007).</li>
<li>Pistelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPistelli%2C+L+%22Bio-Farms+for+Nutraceuticals%3A+Functional+Food+and+Safety+Control+by+Biosensors%22">Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors</a>. , Chapter 13 (2010).</li>
<li>Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+of+Plumbago+indica+as+a+potential+source+for+plumbagin%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin.</a> Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+Hairy+Root+Transformation+in+lotus+Japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus.</a> Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).</li>
<li>Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+in+Cichorium+intybus+L.+via+removing+macronutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Crops+and+Products%22%5BJournal%5D)">High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients.</a> Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).</li>
<li>Fernández-piñán, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Potato+and+the+Promoter+Activity+of+a+Suberin+Gene+by+GUS+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining.</a> Journal Of Visualized Experiments. , e1(2019).</li>
<li>Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transgenic+hairy+root+system+in+jute+%28Corchorus+capsularis+L.%29+with+gusA+reporter+gene+through+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+co-transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation.</a> Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).</li>
<li>Sirikantaramas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+controlling+marijuana+psychoactivity.+Molecular+cloning+and+heterologous+expression+of+%CE%941-tetrahydrocannabinolic+acid+synthase+from+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).</li>
<li>Zhou, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Functional+Genes+in+Buckwheat%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding+and+Nutritional+Aspects+of+Buckwheat%22%5BJournal%5D)">Characterization of Functional Genes in Buckwheat.</a> Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+the+Chloroplast+Genomes+of+Four+Salvia+Medicinal+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants.</a> Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).</li>
<li>Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+the+PaAP1+gene+from+sweet+cherry+%28Prunus+avium+L.%29+causes+early+flowering+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Flavonoid+Metabolites+in+Buckwheat+Leaves+Using+UPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. , (2019).</li>
<li>Zhu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+and+health+effects+of+Tartary+buckwheat%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat.</a> Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).</li>
<li>Kaur, B., Malik, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+culture+-a+unique+source+for+metabolites+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Hairy root culture -a unique source for metabolites production.</a> Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).</li>
<li>Thwe, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+Analysis+and+Phenylpropanoid+Biosynthesis+in+Hairy+Root+Culture+of+Tartary+Buckwheat+Cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars.</a> Plos One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Thwe, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Phenylpropanoids+and+Correlated+Gene+Expression+in+Hairy+Roots+of+Tartary+Buckwheat+under+Light+and+Dark+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonate-responsive+MYB+factors+spatially+repress+rutin+biosynthesis+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtSAD2+and+FtJAZ1+regulate+activity+of+the+FtMYB11+transcription+repressor+of+the+phenylpropanoid+pathway+in+Fagopyrum+tataricum%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum.</a> New Phytologist. 216, (2017).</li>
<li>Giri, A., Narasu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+hairy+roots%3A+Recent+trends+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Transgenic hairy roots: Recent trends and applications.</a> Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).</li>
<li>Thwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+Agrobacterium+rhizogenes+strains+on+hairy+root+induction+and+phenylpropanoid+biosynthesis+in+tartary+buckwheat+%28Fagopyrum+tataricum+Gaertn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn).</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+repression+of+SmCPS+%28copalyldiphosphate+synthase%29+expression+in+hairy+roots+of+Salvia+miltiorrhiza+causes+a+decrease+of+tanshinones+and+sheds+light+on+the+functional+role+of+SmCPS%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS.</a> Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Rutin+and+Quercetin+Biosynthesis+through+Flavonoids-Related+Gene+Expression+in+Fagopyrum+tataricum+Gaertn+.+Hairy+Root+Cultures+with+UV-B+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).</li>
<li>Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+acetosyringone+and+pH+on+Agrobacterium-mediated+transformation+vary+according+to+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species.</a> Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).</li>
<li>Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+signal+molecules+produced+by+wounded+plant+cells+that+activate+T-DNA+transfer+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens.</a> Nature. 318 (19), (1985).</li>
<li>Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Phenolic+Compounds+Induce+Expression+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+loci+needed+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence.</a> Science. 232 (10), 983-985 (1986).</li>
<li>Ferri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+treatment+induces+changes+of+protein+expression+profile+and+stilbene+distribution+in+Vitis+vinifera+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions.</a> Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).</li>
<li>Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plant+secondary+metabolites%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Production of plant secondary metabolites: a historical perspective.</a> Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+hepatitis+B+surface+antigen+in+potato+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots.</a> Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Tüberküloz genetik ve metabolik düzeylerde sekonder metabolitleri ile ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır1,2,5,27,,28. Kıllı kök kültürü, metabolit üretimi için benzersiz bir kaynak olarak, metabolik mühendislik önemli bir rol oynar29 ve ilgili genler ekleyerek metabolik yolları değiştirmek için kullanılabilir. Kim ve ark.<sup cl...

Tartary karabuğday (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) Fagopyrum ve familya polygonaceae1familyasına ait bir dicotyledon türüdür. Çin tıbbı homolog gıda bir tür olarak, Tüberküloz kendine özgü kimyasal bileşimi ve hastalıklara karşı çeşitli biyofaaliyetleri nedeniyle önemli ilgi almaktadır. Tüberküloz öncelikle karbonhidratlar, proteinler, vitaminler ve karotenoidler yanı sıra fenolik asitler ve flavonoidler 11gibi polifenoller açısından zengindir. Antioksidatif, antihipertansif2ve anti-inflamatuar yanı sıra antikanser ve antidiyabetik özellikleri de dahil olmak üzere flavonoidlerin çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetleri,gösterilmiştir 3.
Agrobacterium rhizogenes yara siteleri 4 enfekte tarafından birkaç yüksek bitkilerde kıllı kök hastalığı gelişimine katkıda bulunan bir toprak bakterisidir, özellikle dicotyledons,.,5 Bu süreç kök indükleyici T-DNA transferi ile başlatılan (Ri) plazmid5,6 ve genellikle entegrasyonu ve Ri plazmid bir eksojen genin ekspresyonu ve tüylü kök fenotip üreten sonraki adımları eşlik eder7. A. rhizogenes-aracılıtransgenik tüylü kökleri, bitki biyoteknolojisi alanında güçlü bir araç olarak, en yaygın olarak istikrarlı ve yüksek verimlilik ve kısa bir süre içinde kolay elde edilmesi nedeniyle kullanılmaktadır. Ayrıca, A. rhizogenes tarafından indüklenen kıllı kökleri verimli bir hormonsuz orta8onların plagiotropic kök gelişimi ve yüksek dallanma büyüme ile ayırt edilir. Yapay tohum üretimi, kök nodül araştırmaları ve mikorbozial mantarlar, nematodlar ve kök patojenleri gibi diğer organizmalarla etkileşimleri inceleyerek7,9. Buna ek olarak, tüylü kök dönüşüm kültürleri yaygın biyokimyasal yollar ve kimyasal sinyalaraştırmak ve ilaç, kozmetik ve gıda katkı maddeleri8,,10olarak kullanılan bitki ikincil metabolitleri üretmek için deneysel bir sistem olarak kullanılmıştır. Indole alkaloidler, aconites, tropane alkaloidler, terpenoidler ve flavonoidler de dahil olmak üzere değerli ikincil metabolitleri, yabani tip tüylü kökleri sentezlenen çok sayıda tür için birkaç on yıl için araştırılmıştır, Panax ginseng ginsensidegibi11, Ammi majuscoumarine12, ve TB fenolik bileşikler2,13.
Tüylü kökler 27 aileden 79 bitki türünde A. rhizogenes kullanılarak üretilmiştir14. Örneğin, A. rhizogenes-aracılı kıllı kök dönüşümü soya fasulyesi bildirilmiştir15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, ve hindiba(Cichorium intybus L.) 20. Tüberküloz kıllı kök dönüşümü de araştırılmıştır2. Birkaç ayrıntılı protokoller A. rhizogenes ya bir ikili vektör taşıyan ya da taşıma aracılık kıllı köklerin gelişimi ile ilgili mevcuttur. Örneğin, Sandra ve ark.21 yabani tip sürgünler sürdürülen transgenik patates kıllı kökleri üreten bir yöntem tanıttı. Tamamen gelişmiş kıllı kökler, gus muhabiri genini taşıyan A. rhizogenes'in enjekte edilmesinden 5-6 hafta sonra patates bitkilerinin kök internodlarına görselleştirilebilir. Başka bir çalışmada da jüt gusA muhabiri gen barındıran A. rhizogenes tarafından indüklenen bir transgenik kıllı kök sistemi bildirilmiştir(Corchorus capsularis L.) 22- Ayrıca, Supaart ve ark.23 elde transgenik tütün tüylü kökleri A. rhizogenes ifade vektörü pBI121 δ1-tetrahidrokanabinolik asit (THCA) synthase gentaşıyan ile dönüştürülmüş thca üretmek için dönüştürülmüştür.
Ancak, özellikle Tüberküloz'da etkili bir kıllı kök dönüşümü nesli için adım adım bir süreç nispeten daha az gösterilmiştir. Bu çalışmada, TB'de kıllı kök genetik dönüşümü oluşturmak için muhabiri gen(GFP), seçici bir belirteç(Kan)ve bir ilgi geni(b4), grubumuzdan tanımlanan ancak temel sarlis-döngü-sarlis(bHLH)ailesinden yayınlanmamış gen) taşıyan A. rhizogenes kullanılarak ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Deney, tohumların aşılanmasından, eksplant hazırlama, enfeksiyon, koculturing, subculturing ve daha sonraki yayılmayı içeren kıllı köklerin oluşumuna kadar 5-6 hafta sürdü. Ayrıca, FtMYB116'nın tüberküloz kökü dönüşümü yoluyla tb ve metabolik düzeyde flavonoidlerin, özellikle rutin olarak, flavonoidlerin birikimini teşvik edip edemeyeceğini belirlemek için myeloblastoz transgene116(FtMYB116)tb transgenesini taşıyan ikili plazmid içeren arhizogenler kullanıldı. FtMYB116, ışık kaynaklı transkripsiyonel bir faktördür, farklı ışık koşullarında rutin sentezini düzenler5. Chalcone synthase(CHS), flavanon-3-hidroksilaz (F3H), flavonoid-3'-hidroksilaz (F3'H), ve flavonol synthase (FLS)24 rutin biyosentezin metabolik yolu ile ilgili anahtar enzimlerdir. Bu nedenle, bu çalışma FtMYB116'nın TB kıllı köklerinde aşırı ekspresyonu ve anahtar enzim genlerinin ekspresyonunu ve quercetin gibi rutin ve diğer flavonoidlerin içeriğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>2 * Taq PCR MasterMix</td><td>Aidlab, Çin</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>Agar tozu</td><td>Solarbio Yaşam Bilimleri, Pekin, Çin</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler 2720 termo döngüleyici</td><td>ThermoFisher Scientific, ABD</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio Yaşam Bilimi, Pekin, Çin</td><td>A8110</td><td>DMSO'da seyreltilmiş, 100 mM</td></tr><tr><td>ikili vektörler</td><td>ThermoFisher Bilimsel (invitrogen), US</td><td>/</td><td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td></tr><tr><td>sefotaksim, sodyum</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Çin</td><td>C8240</td><td>Suda Seyreltilmiş, 200 mg / mL</td></tr><tr><td>CF15RXII yüksek hızlı mikro</td><td>Hitachi, Japonya</td><td>90560201</td><td></td></tr><tr><td>Kullanımlık Petri kabı</td><td>Guanghua tıbbi alet fabrikası, Yangzhou, Çin</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>DYY-6C elektroforez cihazı</td><td>Bjliuyi, Pekin, Çin</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>EASYspin Plus Bitki RNA Kiti</td><td>Aidlab, Çin</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab untra bioscience</td><td>ELGA LabWater, İngiltere</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Epoch Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>biotek, ABD</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>Ağ Geçidi BP / LR reaksiyon enzimi</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), ABD</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr><tr><td>HYG-C çok fonksiyonlu çalkalayıcı</td><td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. Çin</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio Yaşam Bilimleri, Pekin, Çin</td><td>K8020</td><td>Suda Seyreltilmiş, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>MLS-3750 Otoklav sterilizatörü</td><td>Sanyo, Japonya</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MS vitaminli tuzlar</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Çin</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio Life Bilim, Pekin, Çin</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Belirtilmemiş diğer kimyasallar</td><td>Pekin Kimyasal İşler, Çin</td><td></td><td>etanol, cıva biklorür, vb.</td></tr><tr><td>PHS-3C pH metre</td><td>Şangay INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Çin</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>Bitki Genomik DNA Kiti</td><td>TIANGEN BIOTECH (PEKIN) CO., LTD</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>Rifampin</td><td>Solarbio Yaşam Bilimi, Pekin, Çin</td><td>R8010</td><td>DMSO, 50 mg / mL</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Çin</td> içinde seyreltilmiş <td>S8040</td><td>Suda Seyreltilmiş, 100 mg / mL</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Solarbio Life Science, Pekin, Çin</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA İşaretleyici</td><td>TransGen Biotech, Pekin, Çin</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Solarbio Yaşam Bilimi, Pekin, Çin</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman çapı 9 cm Filtre kağıdı</td><td>Hangzhou wohua Filtre Kağıdı Co, Ltd</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>Maya Özü tozu</td><td>Solarbio Yaşam Bilimi, Pekin, Çin</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

agrobacterium rhizogenestarafından kıllı kökleri indükleyen -tartary karabuğday aracılı dönüşüm (fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Tartary karabuğday (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] flavonoidler gibi bol ikincil metabolitleri içerdiğinden çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetlere sahip, özellikle rutin. Agrobacterium rhizogenes yavaş yavaş gen fonksiyonlarını araştırmak ve ikincil metabolitlerin verimini artırmak için tıbbi bitkilerde kıllı kökleri ikna etmek için dünya çapında kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Tüberkülozda A. rhizogenesaracılı kıllı kökler oluşturmak için ayrıntılı bir yöntem tanımlanmıştır. 7-10 günde cotyledons ve hipokotendoner eksen eksektive 1 hafta sonra ortaya çıkan adventif tüylü kökleri indükleyen ikili vektör taşıyan A. rhizogenes ile enfekte edildi. Oluşturulan kıllı kök dönüşümü morfolojisi, direnç seçimi (kanamisin) ve muhabir gen ekspresyonu (yeşil floresan protein) temelinde tanımlanmıştı. Daha sonra, dönüştürülmüş kıllı kökleri gerektiği gibi kendini yayılım edildi. Bu arada, bir myeloblastoz (MYB) transkripsiyon faktörü, FtMYB116, A. rhizogeneskullanarak TB genomuna dönüştürüldü -flavonoidlerin sentezinde FtMYB116 rolünü doğrulamak için aracılı tüylü kökler. Sonuçlar flavonoid ile ilgili genlerin ekspresyonu ve flavonoid bileşiklerin verimi (rutin ve quercetin) önemli ölçüde (p < 0.01) FtMYB116tarafından teşvik olduğunu gösterdi , A. rhizogenes-aracılıtüylü kökleri gen fonksiyonları ve ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için etkili bir alternatif araç olarak kullanılabilir gösteren. Bu çalışmada kıllı kökler üretmek için açıklanan ayrıntılı adım adım protokol, ayarlamadan sonra herhangi bir genetik dönüşüm veya diğer tıbbi bitkiler için kabul edilebilir.

Agrobacterium rhizogenes-aracılı Tüberküloz kıllı kök dönüşümü Bu çalışma, A. rhizogeneskullanarak genetik olarak dönüştürülmüş kıllı kökleri elde etmek için kurulan adım adım protokolü açıklar. Tüberküloz tohumlarının aşılanmasından tespit edilen kıllı köklerin hasadına kadar yaklaşık 5-6 hafta sürdü ve bazı önemli adımlar Şekil 1'de (A-H)gösterilmiştir. Kısaca, steril kabuklu tohumlar daha hızlı steril çimlenme elde etmek için aşılanmı...

Biz Agrobacterium rhizogenestarafından kıllı kökleri indükleyen bir yöntem tarif -Tartary karabuğday aracılı dönüşüm (Fagopyrum tataricum). Bu gen fonksiyonları ve Tartary karabuğday ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için kullanılabilir, herhangi bir genetik dönüşüm için kabul edilebilir, ya da iyileştirme den sonra diğer tıbbi bitkiler için kullanılır.

Agrobacterium rhizogenestarafından Kıllı Kökleri Indükleyen -Tartary Karabuğday Aracılı Dönüşüm (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Bu protokolü kullanarak, ilk kez tartary karabuğday kıllı kökleri indüklenmesi için adım adım süreci gösterecektir. Bu teknik, tartary karabuğday ve diğer bitkiler için genomik ve mikrobiyomik başlangıç için kolay ve ucuzdur. Bu ayrıntılı yöntem tartary karabuğday için kurulmuş olmasına rağmen, bazı değişiklikler ile diğer dicot bitkilere uygulanabilir.Bu yöntemin gerçekleştirilemi kolay olsa da, birçok ayrıntılı adımı vardır. Görsel gösteri araştırmacılar daha verimli kıllı kök indüksiyon elde etmek için yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren Guangtao Qian, benim laboratuvar bir Master öğrencisi olacaktır.Tombul ve zarar görmemiş tartary karabuğday tohumları seçerek ve yaklaşık 20 dakika boyunca 28 derece santigrat suda tohumları ıslatma başlayın. Tohum kat kolayca kaldırılabilir zaman, 30 saniye boyunca% 75 etanol içeren sterilize 100 mililitre konik şişe içine 100 ila 200 soyulmuş tohum yerleştirin. Sterilizasyon sonunda, %5 sodyum hipoklorit ile etanol değiştirin.15 dakika sonra, sodyum hipoklorit decant ve steril deiyonize su ile tohumları yıkayın beş kez. Sonra steril bibulous kağıt bir parça ile kuru tohumları leke. Tartary karabuğday fideleri elde etmek için, MSSA orta 50 mililitre içeren bireysel 300 mililitre bitki doku kültür şişeleri şişe başına 10 tohum ekleyin.Sonra, 25, artı veya eksi 1, ışık koşullarında santigrat derece bir kültür odasında tohumları çimlendirmek. 7 ila 10 gün sonra, iki parça açılmakta olan cotyledons ile sağlam fideler seçin ve köklerden fideler kesti. Bir steril petri kabına fide yerleştirin ve 0,8 ila 1 santimetre segmentlere hipokotil kesti.Yaklaşık 0,5 santimetre adet içine cotyledons Sheer ve ön kültür 24 saat boyunca ışık koşullarında ortaya çıkan eksplants. Ertesi gün, bir sterilize 100 mililitre konik şişe içine explants aktarın. A.rhizogenes'i aktive etmek için, bakterileri 28 santigrat derecede 12 ila 16 saatlik bir kuluçka için antibiyotiklerle YEB katı ortamına eşit olarak kaplamadan önce buz üzerindeki kültürü eritin.Ertesi sabah, yeni bir petri kabında kültür için monoklonal bir koloni seçin. Başka bir 12-16 saat kuluçka sonra, 28 derece santigrat antibiyotik ile 20 mililitre YEB katı orta içeren sterilize 100 mililitre konik şişeler ortaya çıkan monoklonal koloniler aşılamak ve 600 optik yoğunluğu ulaşana kadar 16 ila 18 saat boyunca dakikada 200 devrimler 2.0 ulaşır. Daha sonra bakteri hücresi kültürünün %2-4'ünü, 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0,5'e ulaşana kadar dakikada 28 santigrat derece antibiyotik ve 200 devir de 20 mililitre taze YEB katı orta içeren 100 mililitrelik konik bir şişeye aktarın.Kıllı kök dönüşümünü sağlamak için, A.rhizogenes kültürünü steril 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve bakterileri santrifüj le toplayın. MSSAS ortamındaki peleti yaklaşık 0,2 optik yoğunluğa geri alın ve süspansiyonu eksplin şişesine aşılayın. 10 dakika sonra, şişeden explants çıkarın ve steril bibulous kağıt bir parça ile onları leke.Daha sonra mssaas orta bir çanak üzerine filtre kağıdı steril 9 santimetre çapında bir parça yerleştirin ve karanlıkta 25 santigrat derece üç günlük kuluçka için filtre kağıdı üzerine explants bindirme. Kuluçka sonunda, yaklaşık 20 enfekte eksültörü MSSACK orta ve dikey olarak 25, artı veya eksi 1, santigrat derece ışık koşullarında bitkiler inkübün üzerine aktarın. Kültür 10 ila 14 gün sonra, beyaz bir görünüm ve hızlı büyüme gösteren kıllı kökleri seçin ve iki ila üç santimetre adet kökleri kesti.Temiz bir banktaki kökleri açıkça numaralandırmak. 25 santigrat derece ve karanlıkta dakikada 80 devrimler içeren sterilize edilmiş 100 mililitrelik konik şişedeki kök parçalarını, şişenin dibine kadar yayılanıncaya kadar alt kültür. Tüylü kökleri tanımlamak için, herhangi bir tawny ve kontamine tüylü kökleri kaldırmak ve beyaz bir görünüme sahip olanları seçin.Bir muhabir geni kullanılmışsa, mavi veya açık çift ultraviyole transilluminator altında floresan için kökleri kontrol edin ve güçlü bir floresan sinyali sergileyen kıllı kökleri seçin. Sonra emici kağıt ile kökleri kuru ve hemen analiz için işaretli alüminyum folyo sarın. Uzun süreli depolama için, sıvı azot kökleri lyophilize ve araştırma kadar eksi 80 derece santigrat kökleri yerleştirin.Genetik dönüşüm ve kültür den sonra, gösterildiği gibi, tüylü kökleri eksbitki lerinin yara sitelerinde kabarık beyaz bir renk ve plagiotropic bir şekilde sergileyecek ve son derece dallı ve birbirine kenetlenmiş matris oluşturacaktır. Bir muhabir gen mavi veya hafif çift ultraviyole transillumination altında transgenik tüylü köklerin farklılaşmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir, ya da ilgi bir hedef gen belirlenmesi. Burada, tartary karabuğday kıllı köklerin transgenik hatlarında ışık kaynaklı transkripsiyon faktörügöreli ifadesi gösterilmiştir.Özellikle, rutin ve quercetin biyosentezi de indüklenen transkripsiyon faktörü aşırı ekspresyona yanıt olarak metabolik düzeyde teşvik edilmektedir. Ayrıca, her üç transgenik çizgide flavenoid sentez yolu genlerinin göreceli gen ekspresyonu, kontrol grubunda ölçülenlerden oldukça yüksektir ve tartary karabuğday eksperlerinde başarılı bir tüylü kök dönüşümü gösterir. Bu tohum enfeksiyonu, ekseksektif seçimi, ve bakterilerin konsantrasyonu doğrudan tüylü kök indüksiyon başarısını etkiler.Transkripsiyonel regülasyon sekonder metabolitleri incelemek için gen ekspresyonunu, DNA proteinini veya protein reaksiyonlarını veya sekonder metabolitlerin seri üretimini değerlendirebiliriz. Tasarlanmış bakteriler insanlar ve çevresi için tehlikelidir. Bakterileri düzgün bir şekilde ele almaya, çalıştırmaya ve bertaraf etmeye özen gösterin.

inducing-hairy-roots-agrobacterium-rhizogenes-mediated-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Çeşitli çalışma alanlarında model bir tür olarak çok yönlü uygulaması nedeniyle, dar yapraklı muzda (Plantago lanceolata) genetik dönüşüm araç setine ihtiyaç vardır.  Burada, Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyon kullanılarak,% 20'lik bir dönüşüm verimliliğine sahip stabil transgenik çizgilerle sonuçlanan bir protokol sunulmuştur.

Agrobacterium tumefaciens-Dar Yapraklı Muzun Aracılı Genetik Transformasyonu

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Burada, kompozit bitkiler üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği tek adımlı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz.

Agrobacterium rhizogenes Bazlı Tüylü Kök Dönüşümü ile Kompozit Bitkilerin Üretilmesi İçin Verimli ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem

Protokol , Arabidopsis birincil çiçeklenme sapları ve Brassica napus hipokotilleri kullanılarak tüylü kök indüksiyonunu açıklar. Tüylü kökler kültürlenebilir ve transgenik bitkileri yenilemek için eksplant olarak kullanılabilir.

Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Drosophila oogenezi, mitokondriyal proliferasyon ve kalıtım çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor. Bu el yazması, Drosophila yetişkin yumurtalıklarındaki replikasyon yapan mitokondriyal DNA'yı (mtDNA) 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketlemek için kullanılan ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır, bu da daha önce tartışmalı olan mitokondriyal kalıtımla ilişkili mekanizmaların ortaya çıkarılmasını kolaylaştırmaktadır.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Genetik olarak kodlanmış histon miniSOG mavi ışığa bağımlı bir şekilde genom kalıtsal mutasyonlara neden olur. Bu mutajenez yöntemi, hızlı, basit toksik kimyasalların serbest ve ileri genetik tarama ve transgen entegrasyonu için çok uygundur.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Homolog rekombinasyon yoluyla üretilen gen silme mutantları, gen fonksiyonu çalışmaları için altın standarttır. Silme yapılarının hızlı oluşturulması için OSCAR (Agrobacterium-Rekombinasyona hazır plasmidler'in Bir Adımlı Yapısı) yöntemi anlatılmıştır. Agrobacterium aracılı fungal transformasyon izlenir. Son olarak, fungal transformantlarda gen çıkarılmalarının PCR tabanlı onay yöntemi.

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em&gt; Agrobacterium</em&gt; OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Öğrenin, Agrobacterium rhizogenes aracılı dönüşümle Fagopyrum tataricum'da kıllı kök indüksiyonu yöntemini. Bu teknik, genomik ve metabolit araştırmaları için ekonomik bir temel sunar.

Agrobacterium rhizogenestarafından Kıllı Kökleri Indükleyen -Tartary Karabuğday Aracılı Dönüşüm (Fagopyrum tataricum)

Daha fazla video keşfet