Name: Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Keşfedin hasta kaynaklı ksenogreftlerin 3D hidrojel kültüründe canlılık artırma yöntemlerini. Perfüzyonlu mikroakışkan platform kullanarak yüksek verimli ilaç taraması ve tümör mikroçevresi araştırmaları yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü SBIR Faz I (HHSN26120700015C) ve P01CA098912 tarafından desteklenmiştir.

Tümör dokusu hasta onayı ile ve onaylı Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) protokolüne göre elde edildi. Ksenogreftler kabul edilen Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolüne göre implante edildi, büyüdü ve hasat edildi.
NOT: Tüm çalışmalar steriliteyi korumak için steril bir biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
1. PDX işleme için malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Otoklav forceps ve neşter sapı veya jilet.</li>
	<li>Doku dissosiyasyonu ile aynı gün 4 °C'de veya oda sıcaklığında çözülme enzim çözeltisi. NOT: 37 °C'de erime tavsiye edilmez, çünkü bu bazı dissosiasyon enzimlerini inaktive edebilir.</li>
	<li>En az 100 mL PDX kültür ortamı (Dulbecco'nun modifiye Kartal orta besin karışımı F-12 [DMEM-F12] ile 100 U/mL penisilin ve streptomisin hazırlayın ve % 30 fetal sığır serumu [FBS]) ve en az 25 mL PDX işleme ortamı (DMEM-F12 ile 100 U/mL penisilin ve streptomisin ve FBS yok). Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. STROMAL KOMPONENTIN PDX ayrışması ve ilk saflaştırılması
<ol><li>Otoklavlı gereçler, 70 μm hücreli süzgeçler (2−3), 60 mm yuvarlak doku kültürü tabakları (2), 6 kuyulu doku kültür tabakları, steril 50 mL konik santrifüj tüpler ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) toplayın. 37 °C'ye kadar sıcak kültür orta ve dissosilasyon enzim çözeltisi oda sıcaklığına gelmesine izin verir.</li>
	<li>PDX dokusu bir fare konakçısında 1,0−1,5 cm çapa ulaştığında, tümörü standart yollarla (örn. kabul edilmiş anestezi altında) cerrahi olarak fareden çıkarın ve PDX kültür ortamına sahip 50 mL'lik bir tüpte buz üzerinde saklayın(Şekil 2A). Dokuhemen, aşağıdaki adımlar aracılığıyla, hücre canlılığını maksimize etmek için, tercihen içinde 1−2 saat hasat tan sonra.</li>
	<li>Tümör dokusunu önceden tartılmış steril 50 mL konik tüpe aktarın. Kan ve kirleticimaddeleri çıkarmak için 30 mL steril PBS ile 6x durula. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve tümör dokusu tartmak.</li>
	<li>Tümör dokusunu 60 mm'lik yuvarlak doku kültür yemeğine aktarın ve steril bir jilet veya neşter kullanarak ~1 mm3 adet ekibe bölün.</li>
	<li>Tümör bulamacı toplamak ve yeni bir steril 50 mL tüp transfer etmek için PDX işleme ortamı 5 mL ekleyin. Kültür çanamasını 5 mL daha PDX işleme ortamıile durulayın, ardından dissosiyasasyon enzim solüsyonu (10 mL/g tümör, en az 5 mL) ile tüm durulamaları 50 mL tüpe ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 20 dk inkübün. Tüpü kuluçka süresinin yarısına kadar yavaşça döndürün.</li>
	<li>Pipet yukarı ve aşağı yavaşça bir serolojik pipet ile kümeleri kırmak için. Yeni bir steril 50 mL tüp üzerine yerleştirilen 70 μm hücreli süzgeçli filtre hücreleri. NOT: Birden fazla süzgeç gerekebilir.</li>
	<li>Pelet hücrelerine 5 dk için 200 x g santrifüj. PDX kültür ortamının 2−3 mL'inde süpernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Yonga başına istenilen hücre yoğunluğunu elde etmek için gerekli ayrıştırılmış PDX türevi hücrelerin sayısını tahmin etmek için Tablo 1'i kullanın. NOT: Tablo 1'deki değerler bir başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Gerçek değerler doku canlılığına/hücreselliğine ve donma/iyileşmeden kaynaklanan hücre kaybına bağlı olarak değişir. PDX tümörleri belirli bir kanser tipi içinde bile bireylerdir, bu nedenle bu değerler ampirik olarak ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Adım 2.9'da hesaplanan sayının 1−2 x 106 hücresi, PDX kültür ortamının 5 mL'lik 6 kuyulu doku kültür plakası başına. Küme oluşumunu teşvik etmek için 48 saat boyunca (50−55 rpm) inkübat (37 °C, %5 CO2,%95 nem)(Şekil 2B). Küme oluştuktan sonra, santrifüj için bölüm 3'e devam edin.</li>
	<li>Cryopreserve kullanılmayan PDX hücreleri ilk ayrışmadan %50 FBS + %40 DMEM-F12 + %10 dimetil sülfoksit (DMSO) veya ticari olarak mevcut bir birincil hücre dondurma ortamı. NOT: Yapışık fare stromal hücreleri de doku plakası yüzeyinden, istenirse, kültür ortamı ile kısa bir süre durulanarak ve standart yollarla genişletilerek geri kazanılabilir.</li>
	<li>Daha sonra kriyoslü PDX tümör hücrelerinin/fare stromasının kullanımı için, 37 °C'lik su banyosundaki hücreleri 2 dk eritin. Bölüm 3'e geçmeden önce adım 2.10'da açıklandığı gibi 6 kuyulu doku kültürü plakasında kont ve plaka. Kriyopreservation canlılık kayıpları karşılamak için ~% 20 oranında PDX hücrelerinin sayısını artırın.</li>
</ol>3. PDX'ten türetilmiş kümelerin tek hücrelerden yoğunluk gradyan santrifüj esaslı ayrılması
<ol><li>Steril 50 mL konik tüpte 18 mL yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi ile 2 mL steril 10x Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile iyice karıştırarak 20 mL %100 yoğunluk gradyan çözeltisini hazırlayın. Bu %100 çözeltiyi steril 1x HBSS ile seyrelterek ve iyice karıştırarak %20, %30, %40 ve %55 yoğunluk gradyan çözeltilerinin her biri 10 mL yapın. NOT: Bu hacimler, her biri ~15 x 106 hücreyi ayırmak için kullanılabilecek iki adet 15 mL degrade için yeterlidir. ~15 x 106 hücreden daha az ayırıyorsa, ikinci degrade santrifüj için bir denge olarak kullanılmalıdır.</li>
	<li>15 mL konik tüpün altına 3 mL %55 yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Tüpü bir açıda tutarak, %55'lik katmanın üzerine %40 yoğunluk gradyan çözeltisinin 3 mL'sini çok hafifçe katlayarak, katmanların karışmasını önlemek için sıvıyı tüpün açılı tarafına yavaşça dağıtın. %30 yoğunluk gradyan çözeltisi ile tekrarlayın.</li>
	<li>5 mL serolojik pipet ile PDX rotasyon kültürlerinin süpernatantını toplayın, plaka yüzeyini hafifçe durulayın. Pelet hücrelerine 2 dk için 200 x g santrifüj.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve hücreleri ayırmak için gerekli degrade sayısına göre% 20 yoğunluk gradyan çözeltisi 3 mL hücre pelet resuspend. %20 yoğunluk gradyan çözeltisini hücrelerle birlikte degrade(ler) üstüne dikkatlice katlayın. Hücreler için sadece bir degrade tüp kullanıyorsanız, denge gradyan tüp hücre içermeyen 20% yoğunluk gradyan çözeltisi ile üst.</li>
	<li>4 °C, 2.000 x gve 0 fren 30 dakika için bir salıncak kova rotor santrifüj tüpler ve santrifüj kapağı.</li>
	<li>Santrifüjden sonra kesirler görünür olacaktır (Şekil 2C). 2−3 mL kesirleri taze 15 mL tüpler halinde toplayın. Her fraksiyona 3−4 hacim steril 1x HBSS ekleyin ve iyice karıştırmak için ters çevirin.</li>
	<li>Pelet hücrelerine 3 dk için 1.000 x g santrifüj. Supernatant'ı çıkarın ve pdx işleme ortamının 1−2 mL'inde hücre peletini yeniden askıya alın. NOT: Uygulanabilir PDX hücre kümeleri genellikle test edilen çoğu PDX için %20−40 yoğunluk gradyan çözüm arabiriminde biriken tek ölü/ölmekte olan hücrelerle %40−55 yoğunluk gradyan çözüm arabiriminde(Şekil 2D)bulunur.</li>
	<li>Kümelenmiş hücre süspansiyonundaki hücre sayısını değerlendirmek için eşit hacimli dissosiasyon enzim çözeltisi ile yeniden dissosilasyon için küçük, temsili bir aliquot (50−100 μL) çıkarın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı olan hücreleri sayın.</li>
</ol>4. Hidrojel hazırlama ve mikroakışkan plaka tohumu
<ol><li>HA hidrojel çözeltilerini (tiyol-modifiye HA, HA-SH; tiol-reaktif polietilen glikol diakrülat, PEGDA) üreticinin talimatlarına göre yeniden oluştur.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak, kültür nemini ve optimum görüntüleme koşullarını korumak için 2 şeritli mikroakışkan plakanın gözlem penceresi sütunlarında (sütun 3, 7, 11, 15, 19, 23) tüm kuyulara 50°L HBSS ekleyin.</li>
	<li>50 μL hidrojel için gerekli olan bölüm 3'teki hücre süspansiyonunun hacmini istenilen hücre yoğunluğunda (yani 5.000 hücre/μL) hesaplayın. Bir mikroakışkan plaka tohumlama için, hesaplanan hacmi 4 steril 1,5 mL santrifüj tüpün her birine yerleştirin. NOT: HA hidrojellerin jelleşme için sabit bir zamanı vardır. Erken jelleşme oluşursa dağıtımda kullanıcı verimliliği için jel çözeltisi aliquots hacmini ayarlayın.</li>
	<li>KULLANMADAN hemen önce 1 N NaOH ile HA-SH çözeltisinin pH'ını 8.0'a ayarlayın. 40 μL'lik HA-SH'yi 10 μL PEGDA ile karıştırarak ve zaman içinde jelasyonu izleyerek bir test jelasyonu gerçekleştirin. Jelasyon genellikle PEGDA crosslinker ile HA-SH karıştırıldıktan sonra 5−8 dakika başlar.</li>
	<li>Pelet hücrelerine 2 dk (200 x g, oda sıcaklığı) için santrifüj hücre süspansiyon aliquots. Ha-SH'nin uygun hacmindeki süpernatant ve resuspend hücreleri dikkatlice çıkarın. NOT: Son hidrojel 4:1 HA-SH:PEGDA çözeltisi (hacim olarak) olduğundan, hücreler 40 μL HA-SH'de 50 μL son hacim için yeniden askıya alınmalıdır.</li>
	<li>HA'daki bir hücreye 10 μL PEGDA ekleyin. İyice karıştırın ve mikroakışkan plaka tohumlama dan önce 1−3 dakika bekleyin (adım 4.4 jelleşme süresine bağlı olarak). NOT: Tohumlamadan önce başlamanın jelleşme reaksiyonuna izin vermek hücre yerleşmesini en aza indirmeye yardımcı olur.</li>
	<li>HA hidrojel çözeltisindeki hücrelerle tek bir kanal tekrarlayan pipet ve yük için 1,5 μL hacimdağıtmak için bir ipucu yapıştırın. Hatta hücre dağılımı sağlamak için iyi karışık hydrogel aliquot tutmayı unutmayın.</li>
	<li>Mikroakışkan plakayı tohumlamak için pipet ucunu plakaya dik olarak hizalarken ucu jel girişinin ortasına (sütun 1, 5, 9, 13, 17, 21) yerleştirerek hidrojel çözeltisini dağıtırken temas ancak basınç yok. Erken hidrojel katılaşmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışarak, her jel girişine 1,5 μL jel çözeltisi dağıtın.</li>
	<li>Plakanın üst kısmından, plakanın alt kısmından veya mikroskopla görüntülenerek mikroakışkan kanalların dolgu durumunu gözlemleyin ve yüklemeyi bir kılavuz olarak Kullanarak Yüklemeyi değerlendirin (Şekil 3B'debaşarılı yükleme , Şekil 3B'depipet konumlandırma kılavuzu , Şekil 3C'decevapsız yükleme , Şekil 3B'desona erecek şekilde doldurulmamış , Şekil 3E'detaşma). Bir sonraki fiş turu için doldurma başarısını artırabilecek teknikte gerekli ayarlamaları belirleyin (sorun giderme ipuçları için tartışmaya bakın).</li>
	<li>4.6−4.9 adımlarını HA çözeltisindeki kalan 3 hücre ile tekrarlayın. Bir sonraki aliquot (~ 1 dk) hazırlarken plaka ters çevirin. NOT: 1 dk bekleme süresi ve plaka ters jelasyon oluşur gibi hücre yerleşme azaltarak hücrelerin 3D dağılımını artırmak.</li>
	<li>Tüm talaşlar doldurulduktan sonra, jelasyon tamamlanana kadar (~45 dk) 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Verilen kılavuzu kullanarak, perfüzyon rocker doğru perfüzyon ayarları (14 ° açı, 4 dakika aralıkları) ile hücre kültürü kuluçka yüklü olduğundan emin olun.</li>
	<li>Tüm orta girişlere (sütun 2, 6, 10, 14, 18, 22) 50 μL PDX kültür ortamı ekleyin ve kanalların plakayı çevirerek düzgün doldurulup dolmadığını kontrol edin. Sıvıyı mikroakışkan kanalları doldurmaya teşvik etmek için plakayı bir yüzeye hafifçe dokunun.</li>
	<li>Tüm orta çıkışlar için 50 μL DMEM-F12 (%10 FBS) ekleyin (sütun 4, 8, 12, 16, 20, 24). Perfüzyon kanalında herhangi bir hava kabarcığı sıkışıp kalırsa, plakayı bir yüzeye hafifçe vurarak çıkarın.</li>
	<li>Bir mikroskop ve plaka düzeni formu(Ek Şekil 1),kayıt çip dolum başarı kullanarak. Yanlış doldurulmuş yongaları daha fazla deneysel kullanımdan hariç tinler.</li>
	<li>Plakayı 14° eğime ve perfüzyona başlamak için 4 dk'lık bir döngüye ayarlı eğimli bir kayaç üzerine yerleştirin. PDX kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin (önce girişte 50 μL, sonra çıkışta 50 l).</li>
</ol>5. Hücre boyama, görüntüleme ve görüntü niceliği
<ol><li>Üç floresan boya (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]) içeren bir hücre canlılık titreşme çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>Her boyanın stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın: Deiyonize suda 1,6 mM (1 mg/mL) deechst 33342; susuz DMSO'da 4 mM'de kalcein AM; ethidyum homodimer-1 2 mM DMSO/H2O (1:4, v/v). NOT: Malzeme Tablosu'ndabelirtilen kitte calcein ve ethidium homodimer-1 çözeltileri bulunmaktadır.</li>
		<li>HBSS veya fenol kırmızıiçermeyen ortamda, üç boyaiçeren tek bir çalışma çözümü hazırlayın. Her hücre tipi ve matris için, Hoechst 33342 için 1,6−8,0 μM, calcein için 0,1−10 μM ve ethidyum homodimer-1 için 0,1−10 μM aralıkları içinde son çalışma konsantrasyonu optimize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve istenilen mikroakışkan yongalara (75°L giriş, çıkışta 25 l) çalışma canlılık boya çözeltisi uygulayın ve hücre kültürü kuluçka makinesindeki perfüzyon rocker'ın üzerine 1 saat süreyle geri yerleştirin.</li>
	<li>Floresan filtreler (uyarma/emisyon dalga boyları olarak listelenen) ile manuel veya otomatik konfokal mikroskop(Malzeme Tablosu)kullanarak lekeli kültürlerin gözlem pencerelerini görüntüle, nm) tüm çekirdekleri (Hoechst 33342, 350/461), ölü hücre çekirdeklerini (ethidium homodimer-1, 528/617) ve canlı hücre sitoplazmasını (calcein, 494/517) gözlemlemek için.</li>
	<li>20x hava hedefi kullanarak 140 μm Z-desteyi ≤1 μm adım boyutuna sahip yakalayın. Tüm mikro kanalı az miktarda çakışma ile görüntülemek için üç görüş alanı gereklidir. Çift örneklemeyi önlemek için, çip başına yalnızca iki görüş alanı görüntüleyin. NOT: Görüntüleme koşulları uygun NyQuist örnekleme sağlamak için optimize edilmelidir. Yazarların deneyimlerinde, konvansiyonel epi-floresan kaynağının dekonvolution veya bir konfokal üzerinde rezonans tarama modu dayalı hızlı bir görüntüleme sistemi, tam bir Z-yığın, üç lazer renkleri ile, makul bir süre içinde bir plaka üzerinde 96 yongaları arasında tam bir z-yığın (kurulum dahil olmak üzere otomatik görüntüleme ile yaklaşık 3,5 saat) tam olarak titretetmek için gereklidir.</li>
	<li>Görüntü çözümleme yazılımını kullanarak, morfoloji, toplama durumu veya diğer özellikler gibi istenen niceliksel veriler için Z yığını görüntülerini tarar. Hücre canlılığını ölçmek için ölü hücre (kırmızı) ve toplam hücre çekirdeği (mavi) sayısını sayın.</li>
</ol>

<ol><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%3A+Official+Journal+of+Korean+Cancer+Association%22%5BJournal%5D)">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+one+patient+paradigm%3A+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX-MI%3A+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li>
<li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li>
<li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709(2017).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856(2016).</li>
<li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseguides%3A+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li>
<li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+CD15%2FSSEA-1%2C+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66(2010).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431(2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, yüksek iş yapımı, perfüzyonlu 3D kültür sisteminde uygulanabilir PDX kaynaklı tümör hücrelerinin işlenmesi ve kültürlenmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolpca PDX dokusu nu kullanırken, diğer epitel kaynaklı tümörler için de aynı derecede etkilidir. Tümör özellikleri, menşe dokuda (prostat, meme, vb.) bile bireysel PDX çizgileri arasında farklılık gösterir. Bazı PCa PDX hatları daha fibrotik ve diğerleri daha hücresel iken canlı hücreleri izole etmek zordur. Burada belirtilen tümör boyutu özellikle düşük...

Son on yılda, kanser araştırma alanı hasta kaynaklı ksenogreftler için yenilenen coşku göstermiştir (PDXs) kanser hücre yolu güven ve ilaç duyarlılık değerlendirmek için bir araç olarak1. En sık görülen PDX modelleri insan tümör hücrelerinin deri altı veya ortotopik implantasyonu ile kurulur-bir tümör parçası, ayrışmış tümör türevi hücrelerin bir küme, ya da izole dolaşan tümör hücrelerinin bir örnek (CtCs)—bir kemirgen konak içine. Tümör "almak" başarılı olursa, ksenogreft hücreleri çoğalır, vaskülarite, ve aksi takdirde bir tümör oluşturmak için konak doku ile etkileşim, hangi optimal boyutta hasat edilebilir, bölünmüş, ve diğer konakiçine yeniden implante. Bir model sistemi olarak birçok avantajları arasında, PDXs genellikle yerli tümör hücre nüfusunun heterojenlik önemli bir kısmını korumak ve insana özgü yollar ve hücre yanıtları değerlendirilmesi sağlamak2,3. In vivo bağlam vaskülatür ve diğer komşu stroma ile tümör etkileşimi sağlar ve ilaç difüzyon dinamikleri gibi doku özellikleri recapitulates, oksijen gerginliği, ve ekstrasellüler matriks etkisi biyolojik ve mekanik tümör ilerlemesini etkiler. PDXs olumsuz bir yönü bir kemirgen konak onların güven, tümör genişlemesi için hem de sonuçta hipotez testi için. Birçok PDX'ler, arzu edilen özelliklerinin çoğunu kaybetmeden doku kültürü polistiren geleneksel iki boyutlu (2D) kültüre adapte olamayacağından, bu nispeten kontrollü in vitro yöntemi ile in vivo PDX kullanımı için gider, tesis ve zaman gereksinimlerindeki önemli artış arasında araştırmacılar için en az orta zemin olmuştur.
Biz destekleyici bir matris içinde 3D hücre kültürü uygulamak birden fazla in vitro modelleri tarif ettik, ve son zamanlarda birden fazla prostat kanseri ex vivo kültürünü göstermek için bu işi genişletti (PCa) türetilmiş PDXs, hem tek başına ve kemik iliği kaynaklı fibroblastlar ile co-kültür4,5. Hyaluronik asit (HA) bazlı hidrojel matrisler, hidrojelderinliği6 ile görüntüleme için hidrojel özellikleri ve optik netlik üzerinde kolay kontrol ile, her iki hücre tipleri için özelleştirilebilir ve biyolojik olarak ilgili destek sağlar.
Olgun PDX tümör dokuları heterojen insan kanser hücreleri ve fare stroma (fibroblastlar, endotel hücreleri, vb) değişken bir karışımını oluşturmaktadır. İn vitro tümör ilerlemesiiçin hücre tipi spesifik katkıları incelemek için, tümörleri ayırmak, hücre popülasyonlarını ayırmak ve deneysel olarak hücreler arası iletişim yollarını ayırmak için düzenli bir şekilde birleştirmek avantajlı olabilir. Doku digestates içinde karışık hücre popülasyonları belirli kültür koşulları ile diferansiyel uyumluluk var. Örneğin, tümörle ilişkili fibroblast canlılığı ya yüzey ekibe veya integrin ligandlarla işlevsel 3D matrisler gerektirirken, epitel kaynaklı PDX hücreleri genellikle bu gereksinimlere sahip değildir, bunun yerine hücre-hücre etkileşimlerini tercih eder. Bu farklılıklar, PDX hücrelerinin fare stromal hücrelerini kontamine olmaktan etkin bir şekilde ayrılmasını sağlamak için kullanılabilir. Doku digestates rotasyon kültürü doku-hücre yapışıklıkları 24−48 h supernatant çok hücreli kümeler oluşturmak için dönen kültür yüzeyinin üzerinde yüzen PDX hücreleri sürücü ise doku kültür yüzeyine stromal hücre yapışmasını sağlar. Bu kümelerin özel özellikleri PDX'e (örn. büyük, sıkı, yüksek küresel kümeler veya üzüm demetlerini andıran daha küçük, daha gevşek agregalar) göre değişir, ancak genellikle biyolojik olarak ilgili boyutlardadır (50−250 μm çapında), hücreler arası temaslara dayanan hücresel etkileşimleri değerlendirmek için yeterlidir.
Tümör alımı ve işlenmesi kaçınılmaz olarak, mekanik/enzimatik bozulmadan kaynaklanan kısa süreli hasar veya alt popülasyonların seçilen kültür koşullarıyla uzun süreli uyumsuzluğu nedeniyle kaçınılmaz olarak bir miktar teminat hücre ölümüyle sonuçlanır. İlk toplu ayırma olarak rotasyon kültürünün yararına rağmen, ölü veya ölmekte olan hücreler kaçınılmaz olarak PDX kümeleri ile aktarılır ve ortaya çıkan kültürü etkileyebilir. Bu ölü hücreler genellikle bir kümeye entegre olmayan tek tek PDX hücreleri, seçili kültür koşullarında yaşayamayan fare stromal fibroblastları veya özellikle kırılgan endotel hücreleridir. Bu tür ölmekte olan hücreler "hayatta kalanların" deneysel sonuçlarını etkileyebilir ve floresan görüntü tabanlı canlılık tarama testlerinden sayısallaştırmayı önemli ölçüde etkileyebilir. Bu yöntemden canlı PDX hücrelerinin seçimini iyileştirmek için, PDX karışımlarından tek tek ölü/ölmekte olan hücreleri kolayca çıkarmak ve ağırlıklı olarak canlı çok hücreli kümeleri korumak için yoğunluk adımlarıyla santrifüj yöntemlerini uyarladık.
3D kültürde ortaya çıkan PDX kaynaklı kümelerin çalışmasını geliştirmek için, mikroakışkan tabanlı perfüzyon kültür platformu organoPlate(Şekil 1),96 kişiye kadar özel perfüzyon, 3D kültürlerin 384 kuyudaki mikrotiter plaka tabanı(Şekil 1A) 77,8' e kadar eşzamanlı kültüre olanak tanıyan yüksek işletilmiş bir organ-on-a-chip platformundan yararlandık. 2 şeritli mikroakışkan plakada, tek bir doku çipi iki mikroakışkan kanalla bağlanır(Şekil 1B, jel kanal: kırmızı, perfüzyon kanalı: mavi) üst üste dört kuyuya yayılan. İki mikroakışkan kanal, komşu komşu kanaliçine bir kanal taşmasını önler phaseguide denilen kısa bir plastik sırt ile ayrılır, ve aynı anda jel ve perfüzyon kanal9içeriği arasında bir membran-free arayüzü sağlar . Mikroakışkan plakanın alt kısmı mikroskop sınıfı camdan oluştuğu için, kültürler standart veya otomatik mikroskopla plakanın alt kısmından gözlem penceresinden görülebilir. Perfüzyon, mikroakışkan plaka içinde programlanabilir bir rocker ile kurulur, mikroakışkan kanallar aracılığıyla medya sürücü yerçekimi kullanarak, rezervuar kuyuları arasında(Şekil 1C). Perfüzyon akışı-mimik daha yakından statik kültüre göre tümör mikroortamı özetler, kesme stresi ve gazve besin lerin gelişmiş dağılımı dahil edilmesine olanak sağlar. Mikroakışkan plaka bir perfüzyon kanser hücresi kültürünün korunmasının yararları daha önce aynı hücrelerin statik 3D kültür ile karşılaştırıldığında optimum canlılık sergilenen perfüzyon meme kanseri kültürleri olarak tarif edilmiştir7.
Bu rapor, canlı çok hücreli PDX kümelerini yalıtmak için uyarlanmış bir yoğunluk gradyan santrifüj yöntemini açıklar ve perfusable mikroakışkan plakalar içinde 3D PDX kültürleri oluşturmada yarar göstermektedir. Giderek artan sayıda araştırma laboratuvarı PDX kullanımını kolaylaştırmak için yöntemler aradığından, burada sunulan protokollerin hemen faydalı olacağını öngörüyoruz.

<table><tbody><tr><td>1N, NaOH</td><td></td><td></td>, <td>herhangi bir uygun doku kültürü derecesi,</td></tr><tr><td>60 mm, yuvarlak doku kültürü kapları</td><td></td><td></td>, <td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakası</td><td></td><td></td>, <td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>70 ve mikro; m hücreli süzgeçler</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R, 15/50 mL konik santrifüj tüpleri veya eşdeğeri için uygun rotor ve kovalara sahip</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyanlı santrifüj çözeltisi</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit</td><td></td><td></td><td>herhangi bir uygun doku kültürü sınıfı</td></tr><tr><td>Ayrışma enzimi çözeltisi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07921</td><td>ACCUMAX</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039021</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td><td></td><td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>HA hidrojel kiti</td><td>ESI BIO</td><td>GS311</td><td>HyStem (Hyaluronik asit-SH ve PEGDA)</td></tr> <tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B Hausser BrightLine</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H1398</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Görüntü işleme yazılımı</td><td>Oxford Instruments</td><td>Imaris 9.3</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Hücre Canlılığı/Sitotoksisite Kiti (Calcein-/ Etidyum Homodimer-1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Mikroakışkan kültür plakası</td><td>Mimetas</td><td>9603-400-B</td><td>2 şeritli OrganoPlate</td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>PDX türevi tümör dokusu</td><td></td><td></td><td>insan dokusu için IRB onayı ve hayvan konakçısı için IACUC onayı kapsamında alınmıştır</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Perfüzyon rocker</td><td>Mimetas</td><td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td><td></td></tr><tr><td>pH şeritleri (pH 5-9)</td><td></td><td></td> <td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td></td><td></td><td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>Döner xy-çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>Gelişmiş 3500 Orbital Çalkalayıcı</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Neşter kolu</td><td></td><td></td><td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>Tek kanallı tekrarlayan pipet</td><td>Eppendorf</td><td>22260201</td><td></td></tr><tr><td>Steril, 15 mL konik santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>herhangi bir uygun</td></tr><tr><td>Steril, 50 mL Konik santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>herhangi bir uygun</td></tr></tbody></table>

perfüzyonlu mikroakışkan platformda hasta kaynaklı ksenogreftlerin ex vivo 3d hidrojel kültürleri için geliştirilmiş canlılık

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), rezeke edilen hasta tümör dokusu doğrudan immünazatlı farelere aşılandığında ortaya çıkan, biyolojik olarak stabil kalır, böylece moleküler, genetik ve histolojik özelliklerin yanı sıra orijinal tümörün heterojenliği de korur. Ancak, bu modellerin uyuşturucu taraması da dahil olmak üzere çok sayıda deney icra etmek için kullanılması hem maliyet hem de zaman açısından engelleyicidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yaygın olarak kanser hücrelerinin biyokimyasal etkileşimler, morfoloji ve mimari yoluyla biyolojik bütünlüklerini korudukları platformlar olarak görülür. Ekibimiz hyaluronik asit (HA) oluşan 3D matrisler kullanarak in vitro PDX hücreleri kültürleme geniş bir deneyime sahiptir. PDX'lerle ilişkili fare fibroblaststromal hücrelerini ayırmak için, stromal hücrelerin doku kültürü yle tedavi edilmiş plakaların yüzeyine yapıştığı, ayrıştırık PDX tümör hücrelerinin yüzdüğü ve çok hücreli kümelere kendi kendini bağdaştırdığı rotasyon kültürünü kullanıyoruz. Ayrıca supernatant yüzen tek, genellikle ölü hücreler, hangi 3D hücre kültürü için hidrojeller içine aşağı kapsülleme için canlı PDX kümeleri toplama bir sorun mevcut. Bu tek hücreleri canlı hücre kümelerinden ayırmak için yoğunluk adım gradyan santrifüj uyguladığız. Burada açıklanan protokol, daha fazla in vitro deney için kullanılacak hücre kümelerinin sağlıklı popülasyonundan canlı olmayan tek hücrelerin tükenmesine olanak sağlar. Çalışmalarımızda, kültür sırasında medya perfüzyonuna olanak sağlayan mikroakışkan plakalara 3Boyutlu kültürleri dahil ediyoruz. Arınmış ve saflaştırılmayan hücrelerin floresan görüntü tabanlı canlılık tahsini kullanılarak ortaya çıkan kültürleri değerlendirdikten sonra, elde edilen sonuçlar, bu ek ayırma adımının kültürlerimizden canlı olmayan hücrelerin sayısını önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Programlanabilir bir perfüzyon rocker standart bir su jacked hücre kültürü kuluçka hazırlandı ve iki şeritli mikroakışkan plakalar yükleme için standart bir biyogüvenlik kabini(Şekil 1)hazırlanmıştır. Bir MDA-PCA-118b PDX tümörü in vivo olarak genişletildi, maksimum boyuta ulaştığında hasat edildi ve protokol bölüm 2'de açıklandığı gibi hücrelerin bulamaç süspansiyonu oluşturmak için ayrıştırıldı, yaklaşık olarak tek hücreli bir durumda(Şekil 2A). Bulamaç 6 kuyu...

Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Alan konvansiyonel hücre hatlarının kullanımından uzaklaşır gibi hasta kaynaklı tümör örnekleri için geliştirilmiş kültür yöntemleri kritik öneme sahip. Bu protokol, in vivo kanser modellerinin aksine, yüksek iş ve yüksek içerik taraması için uygun bir platformda hasta kaynaklı tümör hücrelerinin in vitro kültür sağlar. PDX'leri içeren platform, yerli tümörleri yansıtan daha heterojen sistemleri değerlendirmemizi sağlar.Bu, uyuşturucu mekanizmaları hakkında bilgi verebilir ve daha hızlı uyuşturucu taraması na olanak sağlayabilir. Yöntem stroma, endotel ve bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi yoluyla genişletilebilir. Bu ortak kültürler yerli tümör popülasyonu ve mimarisini daha da yansıtıcı olabilir.PDXs gibi daha değerli hücrelere geçmeden önce son derece yeterli hale gelmek için mikroakışkan plakaları kolayca genişletilmiş hücre hatlarıile yükleme alıştırması. Başlamak için, önceden tartılmış steril 50 mililitrekonik tüp tümör dokusu transferi.Kan ve kirletici maddeleri çıkarmak için steril PBS 30 mililitre ile altı kez durulayın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve tümör dokusu tartmak. Tümör dokusunu 60 milimetrelik yuvarlak doku kültür yemeğine aktarın ve steril bir jilet veya neşter kullanarak bir milimetrelik parçalara ayırın.Tümör bulamaç toplamak için PDX işleme orta beş mililitre ekleyin. Tümör bulamaç toplamak için dissociation enzim çözeltisi beş mililitre ekleyin. Kültür yemeğini beş mililitre daha dissosiasyon enzim çözeltisi ile durulayın.Sonra PDX işleme ortamı beş mililitre ekleyin. 37 santigrat derecede 20 dakika hafif çetrenle kuluçkaya yat. Kuluçka süresinin yarısında, tüpü yavaşça döndürün.Kuluçkadan sonra, pipet yukarı ve aşağı yavaşça bir serolojik pipet ile kümeleri kırmak için. Yeni bir steril 50 mililitrelik tüp üzerine 70 mikron hücreli süzgeç yerleştirin ve hücreleri filtreleyin. Sonra hücreleri pelet lemek için iki dakika boyunca 1, 200 rpm santrifüj.PdX kültür ortamının 2-3 mililitresinde süpernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Çip başına istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için gerekli ilişkili PDX türetilmiş hücrelerin gerekli sayısını tahmin etmek için bu tabloyu kullanın.Altı kuyulu doku kültürü plakası başına PDX kültür ortamının beş mililitresinde altı hücreye 1-2 çarpı 10 plaka. Küme oluşumunu teşvik etmek için 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nem ile %50 ila 55 rpm'de hafif sallayarak 48 saat kuluçkaya yatırın. Kümeler oluştuktan sonra santrifüjedine doğru ilerleyin.İlk iyice steril 50 mililitrelik konik tüp steril 10X HBSS iki mililitre ile yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi 18 mililitre karıştırarak% 100 yoğunlukgradient çözüm 20 mililitre hazırlamak. Steril 1X HBSS ile bu % 100 çözüm seyreltmek 10 mililitre her 20% 30% 40 ve% 55 yoğunluk gradyan çözümleri yapmak. 15 mililitrelik konik tüpün dibine %55 yoğunluklu degrade çözeltisinin üç mililitresini ekleyin.Tüpü bir açıda tutarak, tüpün açılı tarafına ve %55'lik katmanın üzerine %40 yoğunlukgradient çözeltisi üç mililitre yavaşça dağıtın. %30 yoğunluk gradyan çözeltisi ile tekrarlayın. Daha sonra bir tüp içine beş mililitrelik serolojik pipet ile PDX rotasyon kültürlerin supernatant toplamak, yavaşça plaka yüzeyi durulama.Pelet hücrelerine iki dakika boyunca 1, 200 rpm'de santrifüj. Supernatant çıkarın ve% 20 yoğunluk gradyan çözeltisi üç mililitre hücre pelet resuspend. %20 yoğunlukgradient çözeltisini hücrelerle birlikte 15 mililitrelik tüpteki degradenin üstüne dikkatlice katlayın.Dört santigrat derece, 2,000 kez G ve sıfır mola bir salıncak kova rotor santrifüj 30 dakika tüpler ve santrifüj kapağı. Santrifüjden sonra kesirler görünür. Uygun PDX hücre kültürleri genellikle % 40-55 yoğunlukgradyon çözüm arabiriminde bulunur.Taze 15 mililitretüpler halinde her kesir iki ila üç mililitre toplayın. Her fraksiyona üç ila dört cilt steril 1X HBSS ekleyin ve iyice karıştırmak için tersine çevirin. Hücreleri peletlemek için üç dakika boyunca 1,000 kez G'de santrifüj.Supernatant çıkarın. PDX işleme ortamının bir ila iki mililitre içinde hücre pelet yeniden askıya. Bir tüp içine 50 ila 100 mikrolitre arasında küçük bir aliquot aktarın ve redissociation için dissociation enzim çözeltisi eşit hacimli ekleyin.Kümelenmiş hücre süspansiyonundaki hücre numarasını değerlendirin. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri sayın. Hyaluronik asit hidrojel çözeltilerini üreticinin talimatlarına göre yeniden oluştur.Çok kanallı pipet kullanarak, kültür nemini ve optimum görüntüleme koşullarını korumak için iki şeritli mikroakışkan plakanın gözlem penceresi sütunlarında bulunan tüm kuyulara 50 mikrolitre HBSS ekleyin. 50 mikrolitre hidrojel için gerekli olan hücre süspansiyonunun hacmini istenilen hücre yoğunluğunda hesaplayın, örneğin, mikrolitre başına 5,000 hücre. Bir mikroakışkan plaka tohumlama için, dört steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerin her biri içine hesaplanan hacmi aliquot.Kullanmadan hemen önce 1 normal sodyum hidroksit ile HA tiol çözeltisinin pH'ını sekize ayarlayın. 40 mikrolitre HA tiyol ile 10 mikrolitre PEGdA'yı karıştırarak ve zaman içinde jelasyonu izleyerek bir test jelasyonu gerçekleştirin. Daha sonra, hücre süspansiyonu 200 kez G ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca hücreleri pelet için santrifüj.Dikkatle supernatant kaldırmak ve 50 mikrolitre son hacmi için HA tiyol 40 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. HA tiyol hücrelerinin bir aliquot PEGdA 10 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve mikroakışkan plaka tohumlama önce 1-3 dakika bekleyin.Tek kanallı yinelenen pipete 1,5 mikrolitre dağıtmak için bir ipucu yapıştırın ve HA hidrojel çözeltisindeki hücrelerle yükleyin. Hidrojen aliquot iyi bile hücre dağılımı sağlamak için karışık tutmak unutmayın. Mikroakışkan plakayı tohumlamak için pipet ucunu bıçak için dik olarak hizalayın ve ucu jel girişinin ortasına yerleştirerek 1,5 mikrolitre hidrojel çözeltisi dağıtırken temas ancak basınç yok.Plakanın üst kısmından, tabağın altından veya mikroskopla görüntüleyerek mikroakışkan kanalların dolgu durumunu gözlemleyin. Bu rakamı kılavuz olarak kullanarak yüklemeyi değerlendirin. Yüklemeden bir dakika sonra, bir sonraki aliquot için hazırlanırken plakaters.HA çözeltisindeki kalan üç hücre için mikroakışkan plakanın tohumlanmasını tekrarlayın. Tüm çipler doldurulduktan sonra, jelasyon tamamlanana kadar 45 dakika nemli bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede plaka kuluçka. Bundan sonra, sağlanan kılavuzu kullanarak, perfüzyon rocker 14 derecelik açı ve dört dakikalık aralıklarla doğru profüzyon ayarı ile hücre kültürü kuluçka yüklü olduğundan emin olun.Tüm orta girişlere 50 mikrolitre PDX hücre kültürü ekleyin. Sıvıyı mikroakışkan kanalları doldurmaya teşvik etmek için plakayı bir yüzeye hafifçe dokunun. Ardından, kanalların düzgün doldurulıp doldurulmamasını kontrol etmek için plakayı çevirin.Tüm medya kuruluşları için 50 mikrolitre DMEM/F-12 ekleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları perfüzyon kanalında sıkışıp ise, bir yüzeye plaka nazik dokunarak kaldırın. Bir mikroskop ve plaka düzeni formu kullanarak, kayıt çip dolum başarı.Yanlış doldurulmuş yongaları daha fazla deneysel kullanımdan hariç tinler. Plakayı 14 dereceeğime ve perfüzyona başlamak için dört dakikalık bir döngüye ayarlanmış eğimli bir kayaç üzerine yerleştirin. Her iki günde bir, PDX kültür ortamını, girişlerde ilk 50 mikrolitreyi, sonra çıkışlarda 50 mikrolitreyi değiştirin.Bu çalışmada, standart su ceketli hücre kültürü kuluçka makinesine programlanabilir bir perfüzyon rocker yerleştirildi ve yükleme için standart bir biyogüvenlik kabininde iki şeritli mikroakışkan bıçaklar hazırlandı. 3D mikroakışkan PDX kültür canlılığı ve morfolojisi hem ayrılmamış hem de yoğunluk gradyan santrifüjlü santrifüj ayrı koşullarda değerlendirildi. İlk gün, ayırma yöntemini kullanan kültürler, ayrılmamış kültürlere göre on kat daha az tek ölü hücre sergilediler.Daha da önemlisi, ayrılmış kümeler öncelikle canlı hücrelerden oluşuyordu. Küme büyüklüğü dağılımı için istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. Kültürler daha yedi gün boyunca mikroakışkan plaka muhafaza edildi.Toplam canlı hücre sayısı tutarlı kaldı ve kümeler kültürün yaşamı boyunca yaklaşık %80 canlılığını korudu. Her PDX hattının benzersiz olduğunu unutmayın, bu nedenle tümör sindirim kolaylığı, kümelerin fenotipik boyutu ve morfolojisi ve kümenin degrade saflaştırma içindeki konumu değişir. Bu yöntem kullanılarak kurulan PDX kültürleri, görüntü veya plaka okuyucu tabanlı canlılık tahlilleri, sabit ve immünoffloresan olarak etiketlenmiş veya diğer protokoller için hücre likatları toplamak için ayrıştırılabilir.Bu yöntem, araştırmacıların tümör hücrelerinin biyoloji sini veya ilaç yanıtını araştırmak için tümör mikroçevresini yeniden özetlemelerine olanak sağlayacaktır. Kullanıcılar insan kaynaklı dokularla çalışmadan önce standart insan denekleri eğitimini ve kan yoluyla bulaşan patojeneğitimini tamamlamalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.

enhanced-viability-for-ex-vivo-3d-hydrogel-cultures-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Bu yöntem, standart mikroakışkan bir platformda 40 perfüze 3D mikrokap olarak iPSC kaynaklı endotel hücrelerinin kültürünü açıklar. Bu platform, anastomoz ve anjiyojenik filizlerin ölçeklenebilir ve yüksek iş lenme tarzında stabilizasyonu da dahil olmak üzere, degrade odaklı anjiyojenik filizlenmenin 3Boyutlu olarak incelenmesini sağlar.

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Kemik iliği vasküler nişinin in vitro bir modeli, mezenkimal ve endotel hücrelerinin önceden dökülmüş 3D PEG hidrojelleri üzerine tohumlanmasıyla oluşturulur. Nişlerin endotel ağları, ECM bileşenleri ve ALP aktivitesi kullanılan büyüme faktörüne bağlı olarak değişir. Platform, gelişmiş kanser modelleri için kullanılabilir.

Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) 3D Baskılı Biyoreaktörde Büyük Kan Damarlarının Perfüzyon Kültürü

Burada, mikrofizyolojik bir sistemde kollajen ve kollajen-agaroz matrisleri kullanarak 3D hücre kültürlerinin uygulanması için talimatları detaylandıran protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, renal proksimal tübül ve renal hücreli karsinom sferoidlerinin ko-kültürünü destekleyerek in vivo koşulları simüle eder ve böbrek kanseri hücre etkileşimlerinin ileri düzeyde araştırılmasını sağlar.

Böbrek Kanseri İlerlemesini Modellemek için Renal Sağlıklı ve Tümör Epitelinin Mikroakışkan Ko-kültürü

Bu protokol, metakrilatlenmiş jelatin (GelMA) hidrojellerine gömülü insan osteositleri kullanılarak 3D kemik yapılarının üretilmesini ve decellularize ekstrasellüler matriks ile desteklenmesini açıklar. Yöntem düşük maliyetli, ölçeklenebilir ve temel laboratuvar ekipmanlarıyla uyumludur; bu da kas-iskelet hastalıkları süreçlerini incelemek için translasyonel bir platform sağlar.

Kas-iskelet hastalıklarının modellenmesi için insan osteositleri ve hücresizleştirilmiş ekstrasellüler matriks kullanan 3D kemik kültürü platformu

Keşfedin hasta kaynaklı ksenogreftlerin 3D hidrojel kültüründe canlılık artırma yöntemlerini. Perfüzyonlu mikroakışkan platform kullanarak yüksek verimli ilaç taraması ve tümör mikroçevresi araştırmaları yapın.

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Daha fazla video keşfet