Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi
March 3rd, 2020
Protokol, sendelenmiş herringbone micromixer microfluidics cihazını kullanarak termosensitli lipozomların hazırlanması için optimize edilmiş parametreleri sunar. Bu aynı zamanda lipozomlar içine doksorubisin ve indosiyanyeşil co-kapsülleme ve kontrollü / tetiklenen ilaç salınımı için doksorubisin fototermal tetiklenen serbest sağlar.
Mikroakışkanlar, ölçülebilir nanopartikül boyutunda lipozomları hazırlamak ve büyük tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik ile ortaya çıkan bir tekniktir. Bu protokol, doksorubisin gibi bir kemoterapötik ilaç ve indosiyanyeşil gibi floresan boya ile birlikte yüklemek için düşük ısıya duyarlı lipozomların çıkış yoluyla sürekli yüksek sağlar. Hücre hazırlığı öncelikle lipid film hidrasyon ve ekstrüzyon gibi yukarıdan aşağıya yaklaşım kullanın.
Klinik uygulamalar için büyük ve tekrarlanabilir gruplar hazırlamak zor olmaya devam etmektedir. Mikroakışkanların en büyük avantajı, sürekli ve otomatik bir şekilde çalışırken uzay ve zamanda yüksek kontrol edilebilirlik ile küçük sıvı hacmini idare edebilme yeteneğidir. Calvin Cheung'la prosedürü gösteren guanglong Ma ve Amalia Ruiz olacak.
Şırınga pompalarını monte etmek için, ikincil şırınga pompasının bilgisayar portunu ana şırınga pompasının ağ noktasına bağlamak için pompadan pompaya ağ kablosunu kullanın. Ana pompanın bilgisayar bağlantı noktasını bilgisayarın RS-232 seri portuna bağlamak için ağ kablosunu pompalamak için bilgisayarı kullanın. Staggard herringbone micromixer microfluidic cihaz monte etmek için, cihazın giriş ve çıkışları her tüp bağlamak için bir somun ve ferrule kullanın.
Sonra ikinci bir somun ve ferrule ve bir sendika montaj bir kadın luer her iki giriş için tüp terminali dönüştürmek için kullanın. Pompa kontrol yazılımını kurmak için, ana şırınga pompasının adresini ve ikincil şırınga pompasını sırasıyla Ad:01 ve Ad:02'ye atamak için şırınga pompasının kurulum düğmesini kullanın ve ardından bilgisayardaki pompa kontrol yazılımını açın. İki şırınga pompası otomatik olarak tespit edilmeli ve ardından bir bip sesi alınmalıdır.
Seçili HSW Norm-Ject 5cc çapı 12,45'e eşittir ve çapı 12,45 milimetreye atamak için. Pompa iki pompa için dakikada bir ve 0,75 mililitre için dakikada 0,25 mililitre oranı ayarlayın. Sesi beş mililitrenin üzerindeki herhangi bir değere ayarlayın ve her iki pompa için infüzyon modunu seçin.
Ardından ayarları onaylamak için ayarla'yı tıklatın. LTSL10 veya LTSL10 ICG lipid karışımı hazırlamak için, bir mililitre likit luer kilit şırıngasını kullanarak bir mililitre lipid karışımını ve diğer beş mililitrelik luer kilidi şırıngasını en az üç mililitre amonyum sülfat çözeltisini geri çekin. Yüklü şırıngaları dik pozisyondaki şırınga pompalarına yerleştirmek için şırınganın namlu flanşını pompanın tutucusuna kaydırın ve şırınganın dalgıç flanşını pompanın itici bloğuna takın ve ısıtma bandının diğer ucunu ve sıcaklık probunu yağ çözeltisini içeren termostatın etrafında termostatla sarın.
Isıtma bandının ucunu sulu solüsyonu içeren şırıngaya sarın, lipid karışımını içeren şırıngayı etanol girişine bağlayın ve amonyum sülfat çözeltisini içeren şırıngayı sulu girişe bağlayın. Gerektiğinde şırıngalardan hava kabarcıklarını çıkarmak için pistin konumunu ayarlayın ve şırıngaların sıcaklığı yaklaşık 51 dereceye ulaşana kadar ısıtma bandını 10 saniye aralıklarla takın ve çıkarın. Termostat uygun bir sıcaklık gösterdiğinde, şırınga pompalarını çalıştırmak ve sıvı akışının hava kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı dan arınmış olup olmadığını kontrol etmek için pompa kontrol yazılımının tamamını tıklatın.
Lipozom örneklerini bir şişeye toplayın ve şırınga neredeyse boşolduğunda infüzyonu duraklatın veya durdurun. Anneal 60 derece santigrat su banyosunda toplanan lipozom solüsyon1-1/2 saat diyaliz tüpleri için diyaliz tüpleri için bir litre karşı 240 milimolar amonyum sülfat karşı en az dört saat 37 santigrat derece için çözümler aktarmadan önce toplanan lipozom çözeltileri. Sonra saflaştırılmış lipozomları 4 santigrat derecede saklayın.
Lipozomların transmembran pH gradyanı ile uzaktan yüklenmesi için, 25 mililitre HBS'yi bir boyut dışlama kromatografi sonuna yükleyin ve tüm eluentin sütundan akmasını bekleyin. Sütuna bir mililitre diyalizli lipozom yükleyin. Tüm lipid çözeltisi sütundan geçtiğinde, sütuna 1,5 mililitre taze HBS ekleyin.
Arabellek sütunun içinden geçtiğinde, sütuna üç mililitre taze HBS ekleyin ve eluent'i toplayın. Daha sonra, 1:20 DOX:fosfolipid molar oranı bir Mililitre tampon değişimi lipozom çözeltisi bir Biju şişesinde dox çözeltisi ekleyin ve 1-1/2 saat boyunca 37 derece santigrat su banyosunda şişe yerleştirin. Yüklendikten sonra lipozomları az önce gösterildiği gibi boyut dışlama kromatografisi ile arındırın.
Lazer ısıtma lipozom içeriğinin tetikleme salmak için, 37 santigrat derece su banyosu ayarlayın. Sıcaklık stabilize olduğunda, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 200 mikrolitre DOX yüklü lipozom ekleyin ve tabağı su banyosuna yerleştirin ve alt kısmı suya batırılır. Daha sonra lazer sistemi akımını 2,27 amper olarak ayarlayın ve lazer sistemi kolimatör'ü 96 kuyulu plakanın yüzeyinin beş santimetre yukarısına dikey olarak yerleştirin.
Lazeri açın ve sıcaklığı dakikada bir kez izlemek için fiber optik sıcaklık probu kullanın. Beş ve 10 dakika, dox 10 mikrolitre net 96-iyi plaka her kuyudan lipozomlar yüklü aspire ve siyah 96-iyi plaka üç ayrı kuyulara HBS 190 mikrolitre ekleyin. Tam ilaç salınımını değerlendirmek için, 10 mikrolitre lipozom ile 170 mikrolitre HBS ve 20 mikrolitre %1 Triton X-100 deterjan çözeltisini siyah 96 kuyulu plakanın üç ayrı kuyularında karıştırın.
Daha sonra bir plaka okuyucu üzerinde DOX floresan yoğunluğunu ölçün. LTSL4'ün mikroakışkan üretimi, çok sayıda sıkışmış hava kabarcığı yla gösterilen jel benzeri viskoz bir solüsyon la sonuçlanırken LTSL10'un hazırlanması açık, viskoz olmayan bir sıvının oluşmasına neden olabilir. LTSL10'un 51 santigrat derecede hazırlanan dinamik ışık saçılma ölçümü, beklenen Z ortalaması çapını ve dağılımını gösterir ve deneyin başarısını gösterir.
LTSL10 20 santigrat derecede hazırlandığında, daha büyük ve daha dağınık lipozomlar elde edilir ve bu da optimal olmayan bir ürünle sonuçlanır. Konvansiyonel lipid film hidrasyon yöntemi ile ekstrüzyon ile hazırlanan LTSL'ler, mikroakışkanlar tarafından hazırlanan LTSL10 ile DOX kapsülleme veriminde önemli bir artış ile DOX kapsülleme veriminin ortalama %85 oranında artarak DOX'un uzaktan yüklenmesinin başarısını ve transmembran pH gradyanının varlığını gösteren bir DOX kapsülleme verimini göstermektedir. LTSL10'un DOX salınım profilinin ısıya duyarlı olduğu belirlenmiştir.
LTSL10 41.6 santigrat derece de başlangıcı ile nispeten geniş faz geçiş vardır 42.6 santigrat derece zirveleri. ICG yüklemesinin verimliliği ilk ICG konsantrasyonuna ve numunelerin büyüklüğüne ve dağılımına bağlıdır. Ayrıca, yakın kızılötesi lazer ile LTSL10 ICG ışınlama DOX serbest bırakılması tetikleyen fototermal ısıtma indükler.
Bu prosedürü denerken, sıvının karıştırılması ve bu nedenle lipozomların oluşumunun tekrarlanabilir kalması gibi kararlı bir akışkan akışı sağlamak önemlidir. Lipozom annealing ve diyaliz yüksek yükleme kapasitesi ile istikrarlı bir lipozom formülasyonu sağlamak için iki önemli adımdır. In vivo test de LTSL10 biyo-dağıtım değerlendirmek için yapılabilir, ilaç salınımı, ve antikanser aktivitesi.
Protokolümüz, ilaç dağıtım uygulamaları için kolesterol içermeyen lizozlipid içeren termoduyarlı lipozomların başarılı mikroakışkan üretimi için kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, bir kademeli balıksırtı mikromikser mikrofluidik cihaz kullanarak termosensif lipozomların hazırlanmasını özetlemektedir. Doksorubisin ve indokyanin yeşili'nin birlikte kapsüllenmesini sağlayarak, kontrollü ilaç dağıtımı için fototermal tetikli salımı mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrofluidik
- İlaç Dağıtım Sistemleri
- Nanoteknoloji
Arka Plan
- Mikrofluidik, lipozom hazırlamasında kesin kontrol sağlar.
- Klinik kullanım için büyük, tekrarlanabilir parti üretiminde zorluklar vardır.
- Termosensif lipozomlar, ilaç dağıtım verimliliğini artırabilir.
- Kemoterapötikler ve floresan boyalarla birlikte yükleme, izleme için faydalıdır.
Çalışmanın Amacı
- Termosensif lipozomlar için hazırlama parametrelerini optimize etmek.
- Terapötik ajanların birlikte kapsüllenmesini sağlamak.
- Fototermal yöntemler kullanarak kontrollü ilaç salımını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Kademel balıksırtı mikromikser mikrofluidik cihazı.
- Lipozomların sürekli üretimi.
- Doksorubisin ve indokyanin yeşili'nin birlikte yüklenmesi.
- Fototermal tetikli salım mekanizması.
Ana Sonuçlar
- Termosensif lipozomların başarılı bir şekilde hazırlanması.
- Doksorubisin ve indokyanin yeşili'nin birlikte kapsüllenmesinin gösterilmesi.
- Fototermal stimülasyon ile doksorubisinin kontrollü salımının sağlanması.
- Yöntemin ölçeklenebilirliğinin ve tekrarlanabilirliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, lipozom hazırlama verimliliğini artırır.
- Mikrofluidik, ilaç dağıtım sistemleri için umut verici bir yaklaşım sunar.
- Fototermal tetikli salım, terapötik sonuçları iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, reproducible production of temperature-sensitive liposomes for co-loading chemotherapeutics and imaging agents, addressing scalability challenges in nanomedicine manufacturing. The microfluidic approach supports predictive formulation control and rapid iteration in early-stage drug delivery development, reducing batch-to-batch variability that impacts preclinical consistency. It positions microfluidics as a scalable platform for generating lysolipid-containing liposomes with defined size and release properties, facilitating translational progression from discovery to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables rapid screening of lipid compositions for temperature-triggered release profiles to interrogate drug delivery hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized liposome batches with consistent Z-average diameter (~100 nm) for reliable structure-activity relationship studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports co-loading of doxorubicin and indocyanine green to develop dual-readout assays for drug release and photothermal response.
- Operational Value: Ensures high encapsulation efficiency (>80%) and reproducible size distribution, critical for assay robustness in compound screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates liposomes with defined phase transition onset (41.6°C) and peak release (42.6°C) to enable hyperthermia-triggered efficacy studies in tumor models.
- Operational Value: Facilitates remote loading via ammonium sulfate pH gradient, improving drug payload consistency for pharmacokinetic and biodistribution evaluations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery through lead optimization by providing tunable, scalable liposome formulations that support iterative design of thermosensitive nanocarriers.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of lipid composition effects on membrane permeability and drug release kinetics under mild hyperthermia.
- Screening: Delivers reproducible, monodisperse liposomes suitable for high-content screening of drug release under thermal or laser-triggered conditions.
- Analytics: Provides quantifiable outputs including Z-average diameter, encapsulation efficiency, and temperature-dependent release profiles for formulation comparison.
- Translational Research: Supports continuity into preclinical studies by producing liposomes capable of NIR laser-triggered release via ICG co-loading, enabling photodynamic therapy modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a continuous microfluidic platform adaptable to other lipid systems and therapeutic payloads, reducing revalidation burden across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in liposome performance by eliminating variability from bulk methods like lipid film hydration and extrusion.
- Operational Value: Delivers high-throughput, continuous production with precise flow control, improving manufacturing throughput and reducing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in formulation development by providing rapid, scalable access to liposomes with defined thermal release thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating consistent nanocarrier batches that improve reproducibility in efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system setup, including syringe pump synchronization and temperature control for lipid and aqueous phases.
- Depends on access to staggered herringbone micromixer devices and compatible tubing, fittings, and heating elements for stable lipid solution handling.
- Necessitates standardized operating procedures for annealing, dialysis, and buffer exchange steps to ensure pH-gradient formation and remote loading efficiency.
- Involves adaptation considerations when shifting lysolipid ratios or cholesterol content, which may affect phase transition behavior and liposome stability.
- Includes practical limitations such as the need to avoid air bubble formation during syringe loading and maintain precise flow ratios (0.25 mL/min and 0.75 mL/min) for reproducible mixing in the SHM device.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:06
Equipment Setup
2:46
Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposome (LTSL) Preparation
4:48
Remote Doxorubicin (DOX) Loading
5:48
Laser Heating and Triggered Release
7:13
Results: Representative LTSL10 Characterization, Loading, and Photothermal Heat Triggering
8:59
Conclusion
