Name: Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Keşfedin, hücre tipine özgü TRAP yöntemiyle Arabidopsis thaliana kök gelişimini inceleyin. Bu teknik, yüksek kaliteli RNA izolasyonu ve yan kök oluşumundaki hücre-hücre iletişimini araştırmak için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Zürih Genetik Çeşitlilik Merkezi'nden Jean-Claude Walser'a bu projenin erken evresinde önemli uzman tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Vermeer laboratuvarındaki çalışmalar, JEMV'ye verilen İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan (SNSF) SNF Profesörlük hibesi (PP00P3_157524) ve R'EQUIP ekipman hibesi (316030_164086) tarafından desteklendi.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

RPL18 yerelleştirme deseni doğrulaması Herhangi bir TRAP deneyinden elde edilen verilerin yanlış yorumlanmasını önlemek için çok önemli olan, etiketli ribozomal alt birimin uygun ifade desenidir. Bu nedenle, RPL18 bir epitop etiketi olarak GFP dahil çok zarif istenilen ifade deseni doğrulama ve ardışık, aynı dokudan polizom fraksiyonu çekme sağlar. Uygun organizatör desenleri sağlamak için daha invaziv yaklaşımlar Jiao ve Mayerowitz 2010, GUS boyama gerektirir ve Tian ve ark 2019 anti-FLAG antikorları...

Yeni nesil sıralama tekniklerinin giderek artan uygulamasıyla, gelişim biyolojisinde uzamsal çözünürlük artırılabilir. Çağdaş çalışmalar, tek hücreli seviye,1,2,3,,4değilse, dokuların özel hücre tiplerine kadar incelenmesini amaçlamaktadır. Bu amaçla, son elli yıl içinde farklı yöntemlerbir bolluk geliştirilmiştir (Şekil 1Abakınız )5,6,,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Bitki bilimindeki pek çok araç, hayvan araştırmalarında öncülük eden tekniklerin adaptasyonları olmuştur. Burada ayrıntılı olarak sunduğumuz yöntem için durum böyle değildir. 2005 yılında, protein çevirisi güçlü bir arka plan ile donatılmış, Bailey-Serres Lab sonraki yakınlık saflaştırma16için ribozomal proteinleri mühendisi yola çıktı. Böylece, bir sakaroz gradyan ile ultracentrifugation dayalı ve 1960'lardan beri ribozomçevirme değerlendirmek için kullanılan zaman alıcı ve emek yoğun polizom profilleme, önlemek olabilir17,18. Yöntem o zamandan beri çevirisel ribozom afinite arınma (TRAP)16olarak anılacaktır. Bitkilerde başarılı translatome çalışmalardan sonra, Heiman ve ark. hayvanlar için TRAP adapte19 ve diğerleri maya20, Drosophila21, Xenopus22 ve zebra balığı23,24.
Model sisteminin genetik modifikasyonu TRAP için bir ön koşul olmasına rağmen, hangi türler genetik dönüşüm için uygun uygulama sınırlar, bir aynı anda özel ilgi ve bozulmamış doku / organ25 izole etmek için son derece zor hücrelerin alt kümeleri hedef bu itiraz koşum olabilir (örneğin, bir fare beyin veya enfekte bitki dokusunda mantar hyphae yüksek dallı dendritik hücreler). Bitkilerde, tüm hücreler hidrostatik iskelet26temelini oluşturan hücre duvarları ile yerinde tutulur. Bu matris bir bitki hücresi serbest etmek için, bilim adamları ya fiziksel lazer yakalama mikrodizeksiyon (LCM)27 veya hücre duvarları28enzimatik sindirim gerçekleştirilen yoluyla çevresindeki doku hücre kesip var . İkinci hücreler arasında, sözde protoplastlar, ilgi popülasyonu floresan etiketli ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)7ile ayrılabilir. LCM genellikle sabit ve balmumu gömülü bir örnek gerektirir, hangi sonuçta onun RNA kalitesini bozar29. FACS tabanlı yöntemler yüksek kaliteli RNA verim, ancak protoplasting kendisi süreci gen ekspresyonu farklılıkları tanıttı30 ve modifiye ve kalın ikincil hücre duvarları ile dokuların tedavi etmek için kötü üne sahiptir. Ayrıca, bitkilerdeki birçok gelişimsel sürecin mekanik olarak iletilen sinyallere dayandığı varsayılır ve bu nedenle hücre duvarının bütünlüğü büyük önem taşımaktadır31. Çekirdek seviyesinde hareket ederek hücre izolasyonundan maksatlamak için kısayol kullanan iki yöntem, floresan tarafından aktive edilmiş nükleer sıralama (FANS) ve belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonudur (BOZULMASIN). TRAP olduğu gibi, onlar çekirdekleri işaretlemek için hücre tipine özgü organizatörleri kullanmak, daha sonra sıralama yoluyla zenginleştirilmiş olsun veya aşağı çekmek, sırasıyla8,15. Tüm bu yaklaşımlar için önemli bir sorun bir doku hücrelerinin alt kümelerinden yeterli RNA malzeme elde etmektir. TRAP hücresel RNA'ların sadece bir kısmını ele geçirirken, numune toplama önemli bir darboğazdır. Bu nedenle, düşük giriş tutarlarından yüksek kaliteli veri üretmek için özellikle hassas kitaplık hazırlama protokolleri gereklidir.
Kuruluşundan bu yana, TRAP ya DNA mikrodizileri ile birlikte kullanılmıştır ya da, sıralama maliyetleri son yıllarda önemli ölçüde düştü gibi, RNA-seq10,32,33. Sablok ve ark.34'teincelenmiş çok sayıda araştırma sorusu zaten açıklığa kavuşturulmuştur. Belirli hücre türlerini hedeflemek için farklı organizatörleri birleştirerek teknik çok yönlü olduğu için önümüzdeki yıllarda daha fazla rapor takip edeceğine eminiz. Sonunda, Bu indüklenebilir bir şekilde bile yapılacak, ve birçok biyotik ve abiyotik stres faktörlerine bitkinin reaksiyonu probing ile kombine edilebilir. Ayrıca, istikrarlı transgenik hatları mevcut değildir, kıllı kök ekspresyon sistemleri de başarıyla domates ve medicago35,36TRAP gerçekleştirmek için kullanılmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Şekil 1: Ribozom afinite arınma (TRAP) çevirisi "omiks" analiz portföyünü tamamlar. A. Analitik hassasiyet düzeylerini artırmak, aşağı tek hücreli hatta hücre altı çözünürlüğü yöntemleri veya bunların kombinasyonları bir bolluk ile elde edilebilir. Şema bitki ve hayvan alanında şu anda mevcut araçlar alabilen bir genel bakış sağlar. Hücresel çözünürlükte doku toplama lcm veya FACS gibi protokoller ile elde edilebilir, daha sonra standart transkripsime veya polizom profilleme / translatome analizi ile birleştiğinde. TRAP ve INTACT, epitop etiketlemeye dayalı olarak hem doku yakalama hem de RNA izolasyonu entegre ederler. Ancak, INTACT sadece hücre çekirdeklerini örnekler ve bu nedenle, transkripsiyon analizi özel bir durum oluşturur. Küçük bir tavşan simgesi hayvan alanında yeni geliştirilen yöntemleri işaretler: SLAM-ITseq ve Flura-seq izin veren enzim ifade hücrelerde değiştirilmiş uracil üsleri ile yeni doğan RNA metabolik targetting güveniyor iken, Slide-seq hücresel aralığında konumsal bilgi sağlayan DNA barkodları ile kaplı cam slayt kullanır. APEX-seq'da belirli hücre altı bölmelerde RNA örneklemesi için yakınlık etiketleme yaklaşımı izlenir. Özellikle, artan çözünürlük genellikle transgenik malzeme (yıldız) üretimi gerektirir ve bu nedenle bu yöntemler ağırlıklı olarak model türler için kullanılır. TRAP özellikle hücre duvarı (CW) veya mekanik sinyalizasyon ve CW matrisserbest bırakmak zor hücre türleri içeren bitki bilimi çalışmaları için uygundur. B. TRAP prosedürünün ayrıntılı ıslak laboratuvar adımları: Farklı hücre tiplerinde (örn. kök endodermisi) GFP etiketli ribozomal proteini ifade eden fideler Petri kaplarında yedi gün boyunca yetiştirilir ve kök malzemesi yapışma donma ile hasat edilir. Toplam RNA kontrol numunesi, santrifüj yoluyla enkaz peletleme önce homojenize ham ekstresi toplanır. Manyetik anti-GFP boncukimmünenfazla yapmak için temizlenmiş ekstrese eklenir. Kuluçka ve üç yıkama adımından sonra polizomla ilişkili RNA (TRAP/polizom RNA) doğrudan fenol-kloroform ekstraksiyonu ile elde edilir. LCM: lazer yakalama mikrodiseksiyon, FACS / FANLAR: floresan aktif hücre / nükleer sıralama, APEX-seq: mühendislik askorbate peroksidaz dayalı yöntem, INTACT: belirli hücre tiplerinde etiketli çekirdeklerin izolasyonu, SLAM-ITseq: dokuda RNA metabolik sıralama için thiol(SH) bağlı alkylation, Flura-seq: fluorourasil etiketli RNA sıralama (Biorender.com ile oluşturulmuş) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu makalenin amacı, TRAP yönteminin ayrıntılı bir açıklamasını sağlamak, kritik adımları vurgulamak ve olası bir kitaplık hazırlama yöntemi için rehberlik sağlamaktır.
Genel bir TRAP deneyi temelde aşağıdaki adımlardan oluşacaktır (ayrıca bkz. Şekil 1B):(1) Ribozom etiketleme yapısının klonlanması, transgenik hat üretimi ve seçimi, tohumların büyümesi ve şişirilmesi, sterilizasyon ve kaplama, stres uygulaması/tedavisi (isteğe bağlı) ve doku hasadı; (2) doku homojenizasyonu ve ham ekstresi temizlenmesi, boncuk yıkama ve immünpurifikasyon ve yıkama adımları da dahil olmak üzere immünsafifikasyon; (3) RNA çıkarma ve kalite değerlendirmesi; ve (4) kütüphane hazırlama.
Arabidopsis kökü bir model bitki olarak piyasaya beri bitki geliştirme çalışma için bir model sistemi olmuştur37,38. Burada TRAP uygulaması bitki yanal kök gelişimi bağlamında sergilenir. Bitkilerde, tüm kök sisteminin birikimi bu programın yürütülmesine dayanır ve bu nedenle organizmanın hayatta kalması için çok önemlidir39. Arabidopsis'telateral kökler ksilem damarlarının yanında bulunan pericycle dokusundan kaynaklanır ve bu nedenle ksilem direk pericycle (XPP; bkz. Şekil 2C)40olarak adlandırılır. Kökün derinliklerinde bulunan bazı XPP hücreleri, kurucu hücre kimliği kazanır ve yerel bir hormonal tetikleyici üzerine, anticlinal41'işişirerek ve bölerek çoğalmaya başlar. Ancak, sert bir hücre duvarı matris varlığı nedeniyle, bu süreç çevre dokular üzerinde mekanik stres uygular. Özellikle, örten endodermis etkilenir, yanal kök büyüme ekseni şekilde olduğu gibi42,43,44. Gerçekten de, yeni oluşan primordium örten endodermis hücre yoluyla büyümek zorunda kalacak(Şekil 2C2) korteks ve epidermis hücreleri sadece sonunda ortaya çıkarmak için primordium için kenara itilirise 45,46. Laboratuarımızda yapılan son çalışmalar, endodermisin peridöngüsündeki çoğalmaya aktif olarak katkıda bulundugunu göstermiştir. Endodermal hormonal sinyalhedefli engelleme XPP hücrelerinde bile ilk bölümü inhibe etmek için yeterlidir47. Bu nedenle, pericycle-endodermis iletişim Arabidopsislateral kök gelişimi için çok erken bir kontrol noktası oluşturmaktadır. Ancak bu çapraz konuşmanın nasıl yapıldığı bilinmemektedir. Bu gizemi çözmek için XPP ve endodermal hücreleri hedeflemek için TRAP-seq yaklaşımını seçtik. Lateral kök programında hücreler için zenginleştirmek için, biz ekseksen bir auxin analog uygulayarak hormonal tetikleyici taklit (1-naftaneasetik asit, NAA)48, hangi aynı zamanda zamansal lateral kök oluşumunun ilk aşamasıçözmek için izin.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Sterilizasyon< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ağartıcı,% 13</td> <td>Sigma</td><td>71696</td><td></td></tr><tr><td>beher</td><td>VWR</td><td>214-1172/74/75</td><td></td></tr><tr><td>porselen plakalı kurutucu (DURAN)</td> <td>Sigma / Merck</td><td>Z317454-1EA / Z317594-1EA</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, pa</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl, %37</td> <td>Roth</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Plaka büyümesi + hasat</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS tuzları, bazal tuz karışımı, MES tamponu dahil</td><td>Duchefa</td><td>M0254</td><td></td></tr><tr><td>agar bitkisi hücre kültürü için</td><td>Applichem/Panreac</td><td>A2111.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>forcepts</td><td>Rubis İsviçre</td><td>5-SA model</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>60370</td><td></td></tr><tr><td>mikro gözenek/cerrahi bant</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>NAA</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>petri kapları 120x120 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>neşter</td><td>VWR / Swann-Morton</td><td>233-5454</td><td></td></tr><tr><td>dokular, nötr, iki katmanlı</td><td></td><td></td><td>seçtiğiniz herhangi bir tedarikçi</td></tr><tr><td>< güçlü > immünopresipitasyon< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GFP boncukları: gtma-100 GFP-Trap_MA</td><td>Chromotek</td><td>örneğin gtma-100</td><td></td></tr><tr><td>Brij-35</td><td>Sigma</td><td>P1254-500G</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj tüpleri ( santrifüj)</td><td>Beckman Coulter</td><td>357001</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Uygulaması</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>pamuklu eldiven</td><td>VWR</td><td>113-7355</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid, HPLC sınıfı</td><td>Sigma</td><td>01810-1G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>VWR</td><td>E174</td><td>uzun teslimat sürelerine sahip olabilir</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>homojenizatörler DUALL 23</td><td>KONTES GLASS CO (VWR üzerinden)</td><td>SCERSP885450-0023 (set)</td><td>SCERSP885451-0023 sadece havaneli - sadece SCERSP885452-0023 silindir; uzun teslimat süreleri</td></tr><tr><td>Igepal CA-360</td><td>Sigma</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrat</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>harç ve havaneli</td><td>VWR</td><td>470148-960 & 470019-978</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10 837 091 001</td><td></td></tr><tr><td>Polioksietilen-(10)-tridesileter/PTE</td><td>Sigma</td><td>P2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>Roth</td><td>T143.3</td><td></td></tr><tr><td>RNAZap</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780/AM9782</td><td>yüzeyleri temizlemek için</td></tr><tr><td>Tris, >99.3% </td><td>Roth</td><td>AE15.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>T8787-250ml</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>RNA ekstraksiyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol, pa</td><td>Sigma</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform, HPLC sınıfı</td><td>Scharlau CL02181000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH, pa</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>düşük retansiyonlu mikrosantrifüj tüpleri, 1,5 ml</td><td>Eppendorf/Sigma</td><td>Z666548-250EA</td><td>LoBind</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen DNaz seti</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Temizleme Kiti</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Library hazırlama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 mL Tüp Manyetik Ayırıcı</td><td>Abraxis</td><td>PN 472250</td><td></td></tr><tr><td>AMPure boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>İndeks Kiti A</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>İndeks Kiti D</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>neodimyum mıknatıslar</td><td>Amazon/diğer</td><td>6 x 1,5 mm aralık: N42 (NdFeB)</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024/1096</td><td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td></tr><tr><td>PCR şeritleri</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer v4 kiti</td><td>Takara Bioscience</td><td>634892</td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td>2100 Biyoanalizör Cihazı</td>, <td>RNA/DNA kalite kontrolü için özel ekipman</td></tr><tr><td>Tapestation</td><td>Agilent</td><td>4200 Tapestation Cihazı</td>, <td>RNA/DNA kalite kontrolü için özel ekipman</td></tr><tr><td>Fragment Analyzer</td><td>Agilent</td><td>5400 Fragment Analyzer Sistemi</td><td>RNA/DNA kalite kontrolü için özel ekipman (yüksek verim)</td></tr><tr><td>LabChip</td><td>PerkinElmer</td><td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td><td>RNA/DNA kalite kontrolü için özel ekipman (yüksek verim)</td></tr><tr><td>Qubit 4 Florometre</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td><td>RNA/DNA konsantrasyonu tayini için özel ekipman</td></tr><tr><td>qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA23</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; devir: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC</td></tr><tr><td>GH3.3</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; devir: ACTTATCCGCAA CCCGACT</td></tr><tr><td>LBD29</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; devir: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA</td></tr><tr><td>UBC21</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5038</td><td></td></tr><tr><td>çeşitli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri 15 ml, Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri 50 ml, Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>filtre uçları 1 ml</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>filtre uçları 10 & mikro; l</td><td>Axygen</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>filtre uçları 100 & l</td><td>Axygen</td><td>TF-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>filtre uçları 20 & l</td><td>Axygen</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>filtre uçları 200 & l</td><td>Axygen</td><td>TF-200-RS</td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpleri 1.5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4170-100MG</td><td></td></tr><tr><td>dizileme şirketi</td><td>Novogene</td><td></td><td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td></tr></tbody></table>

bir hücre tipine Özel Ölçekte arabidopsis thaliana kök gelişimini araştırmak için ribozom affinity arınma (trap) Çevirisi

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Bu makalede, ribozom afinite arınma (TRAP) yöntemi ve ardışık optimize edilmiş düşük girişli kitaplık hazırlama yöntemi ile farklı Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinden translatom verileri elde etmek için uygulamalı talimatlar veriyoruz.
Başlangıç malzemesi olarak, yeterli organizatörlerin kullanımı ile gfp etiketli ribozomal protein RPL18'i hücre tipine özgü bir şekilde ifade eden bitki hatlarını kullanırız. Önce immünpurifikasyon ve RNA ekstraksiyon, doku, doku bütünlüğünü korur ve aynı anda yüksek zamansal çözünürlük ile zaman serisi çalışmaların yürütülmesine olanak sağlar dondurulmuş snap. Özellikle, hücre duvarı yapıları bozulmadan kalır, bu da farklı hücre popülasyonlarını izole etmek için protoplasting dokuya dayanan floresan-aktive hücre tasnisi temelli yaklaşımlar gibi alternatif prosedürlerde büyük bir dezavantajdır. Ayrıca, yüksek kaliteli RNA elde edilmesine olanak sağlayan lazer yakalama mikrodiseksiyon tabanlı teknikler gibi doku fiksasyonu gerekli değildir.
Ancak, hücrelerin alt popülasyonlarından örnekleme ve sadece polizom ilişkili RNA izole ciddi RNA verimleri sınırlar. Bu nedenle, RNA-seq tarafından başarılı veri toplama için yeterince hassas kütüphane hazırlama yöntemleri uygulamak gereklidir.
Trap, hücre duvarıyla ilgili ve mekanik sinyal yolları içerdiğinden, birçok gelişimsel süreç hücre duvarı yla ilgili olduğu için bitki araştırmaları için ideal bir araç tır. Organizatörlerin belirli hücre popülasyonlarını hedeflemek için kullanımı, organ ve tek hücre düzeyi arasındaki boşluğu köprülemektedir ve bu da çok az çözünürlük veya çok yüksek maliyetlerden muzdariptir. Burada, lateral kök oluşumunda hücre-hücre iletişimini incelemek için TRAP uyguluyoruz.

Kalite değerlendirmesi için, yukarıda belirtilen prosedür birkaç ara adımda incelenmelidir: planta'da ifade deseni doğrulaması, izole edilmiş polizomal RNA'nın ve son kütüphanelerin kalite kontrolü. qRT-PCR bilinen marker genleri kullanarak, ek olarak, tedavi durumuna yanıtı onaylamak veya deneysel koşullar ince ayar yapılabilir.
GFP sinyal dağılımının konfokal analizi Hem endodermal hem de XPP ekspresyon des...

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

TRAP ile, hücresel çözünürlükte gelişimsel işlemeyi araştırabiliriz. Etiketli bir ribozomal alt üniteyi kullanmak için hücre tipine özel organizatörler kullanıyoruz ve oradan polizom RNA'yı izole edebiliriz. Bu protokol yüksek kaliteli RNA verir, ancak çok sınırlı miktarlarda, bu nedenle, ultra-düşük giriş için uzmanlaşmış yöntemler güvenilir yüksek kaliteli RNA kütüphaneleri üretmek için gereklidir.TRAP bitki araştırmaları için ideal bir araçtır, çünkü birçok gelişimsel süreç hücre duvarı yla ilgili ve mekanik sinyal yollarına dayanır. Lateral kök oluşumunda hücre-hücre iletişimini incelemek için TRAP kullanıyoruz. Kaliteli RNA elde etmek beklediğimiz kadar yalın bir şekilde ortaya çıkmadığı için, bu adım adım video talimatının TRAP uygulanabilirliğini artıracağını ve bu güçlü tekniğin desteklenmesine yardımcı olacağını umuyoruz.Yayılan homozigot çizgileri sterilize etmek için, 12'ye 12 santimetre kare petri tabaklarına eşit olarak 300 mikrolitreden daha az tohum yayılır ve tabakları 60 litrelik bir kurutucuya dizin. Bir gecede gaz sterilizasyonu sonra, 50 mililitredepolama tüpü içine tohumları toplamadan önce gaz buharlaşmasına izin. Kaplama önce, plaka başına imbibed tohum karış

translating-ribosome-affinity-purification-trap-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada...

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur.  Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Eğer RNA arıtma ile birlikte ribozomlarda içinde gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) EC özgü genetik etiketi ile doğrudan fare beyin, akciğer ve kalp dokularda vasküler endotel hücrelerden (ECS) ribosome bağlı mRNA arındırmak için bir yaklaşım sunuyoruz .

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Arabidopsis ve Medicago'nun kök sistem mimarisini (RSA) incelemek için basit laboratuvar araçları kullanıyoruz. Fideler ağ üzerinde hidroponik olarak yetiştirilir ve RSA'yı ortaya çıkarmak için bir sanat fırçası kullanılarak yayılır. Görüntüler tarama veya yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanılarak alınır, daha sonra özellikleri haritalamak için ImageJ ile analiz edilir.

Bitki kök sistemi mimari özelliklerini haritalamak için basit bir protokol

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Keşfedin, hücre tipine özgü TRAP yöntemiyle Arabidopsis thaliana kök gelişimini inceleyin. Bu teknik, yüksek kaliteli RNA izolasyonu ve yan kök oluşumundaki hücre-hücre iletişimini araştırmak için güçlü bir araçtır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Daha fazla video keşfet