Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi
20 Haziran 2020
Protokolün genel amacı, hücre içermeyen protein sentezi için kullanılabilecek 1 cm2 düzlemsel substrat üzerinde bir milyondan fazla sipariş, üniforma, kararlı ve biyouyumlu femtolitre damlacıkları hazırlamaktır.
Damlacıklardan bir milyondan fazla üniforma parmak büyüklüğünde substrat üzerinde üretilmektedir. Ve tek DNA molekülleri her damlacık içine rastgele dağıtılır. Protein verimi bir damlacıktaki molekül sayısıile orantılıdır.
Tekniğimiz karmaşık protein ekspresyonu ve saflaştırma olmadan enzim aktivitesinin hızlı ve nicel ölçümü için kullanılabilir. Başlamak için, bir boyama raf üzerinde bir kapak cam ayarlayın ve sekiz azı lı sodyum hidroksit raf yerleştirin. Kapak camı ve boyama rafını oda sıcaklığında 15 dakika sonicate edin.
Boyama rafını sodyum hidroksitten çıkarın ve kapak camı 10 kez suyla durulayın. Kapak camı hava tabancasıyla kurulayın. Sonra fırında ve beş dakika boyunca 200 derece santigrat bir sıcak tabakta kapak cam kuru.
%0.05 aminosilane çözeltisi hazırlayın. Kapak camı bu çözeltiye batırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Kapak camı saf suda beş kez durulayın.
Sonra bir hava tabancası kullanarak kapak cam kuru. Beş dakika boyunca 80 derece santigrat sıcak tabakta pişirin. Kapak cam yüzeyini spin kaplama için özelleştirilmiş bir vakum lu aynaya yerleştirin.
Cam substratının ortasına 70 ila 90 mikrolitre tip-A CYTOP polimer dağıtın. Sonra hemen polimer spin-coat. İlk polimer kaplama son mikrohaznöz dizinin kalitesine zarar verir.
Hava kabarcıkları tanıtmadan kapak camın ortasına polimer dağıtın. Köşelerde tutarak kaplamalı cam almak ve alüminyum folyo üzerine yerleştirin. 80 derece santigrat 30 dakika ve sonra 200 derece santigrat başka bir saat için pişirin.
Substrat merkezinde 0,2 ila 0,3 mililitre fotodirenç dağıtın. Hemen 60 saniye boyunca 6, 000 rpm photoresist spin-coat. Substrat kenarlarından fazla fotodirenç kaldırmak için etanol batırılmış bir silme kullanın.
Beş dakika boyunca 110 derece santigrat de substrat pişirin. Foto-rehidratasyon için, substrat 42-60% bağıl nem de 30 dakika bekletin maske hizalayıcı içine substrat yükleyin ve bir vakum temas modunda 25 saniye maruz. Daha sonra maruz kalan fotodirenç çözmek için beş dakika geliştirici substrat batırın.
Saf su kullanarak substratı 10 kez durulayın. Daha sonra hava tabancasını kullanarak substratı iyice kurulayın. Substratı reaktif iyon aşındırma makinesinin reaksiyon odasına yerleştirin ve fotodirenç kaplı CYTOP'u oksijen plazması ile aşındırın.
Gravürden sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca aseton içinde substrat sonicating tarafından kalan photoresist kaldırın. Sonra beş dakika boyunca propanol içine substrat sonicate. Durulayın, sonicate, ve tekrar saf su kullanarak substrat durulayın el yazması açıklandığı gibi.
Sonra bir hava tabancası ile substrat kuru. Masaüstü kesici kullanarak, tanımlanan mikrokanal şekilleri içine çift kaplamalı yapışkan Kapton film bandı kesti. PDMS'nin kalıplanmasında usta olarak hizmet vermek için kesilmiş bant parçalarını düz bir Petri kabının dibine yerleştirin.
PDMS karışımını bant desenli Petri kabına dökün. Sonra petri kabını mini vakum odasına yerleştirin ve PDMS karışımını 1-3 saat ayırın. Sonra 60 derece santigrat bir fırında Petri çanak yerleştirin ve PDMS tedavi etmek için bir gecede bırakın.
PDMS iyileştikten sonra, Petri kabından kürlenmiş elastomeri soyun ve PDMS mikrokanal bloklarını kesmek için düz kablo kesici kullanın. Sonra her mikrokanalın her iki ucunda bir delik yumruk. Önceden hazırlanmış substrat mikrooda dizisi için bir alana sahip olacaktır.
PDMS mikrokanalını substratın bu kısmına yerleştirin. Ardından PDMS mikrokanalındaki deliklerden birine 200 mikrolitrelik pipet ucu takın. İlk olarak, CFPS reaksiyon çözümünü bir PCR tüpte hazırlayın.
Daha sonra, 200 mikrolitre filtre olmayan pipet ucu kullanarak çözeltinin 10 mikrolitresini çekin. Pipet ucunu PDMS mikrokanalının giriş deliğine takın ve çözelti mikrokanal çıkışından taşana kadar pipet pistonuna bastırın. FemDA cihazını önceden soğutulmuş alüminyum bir bloğa aktarın.
Mikrohazus dizi alanının yarı saydamdan saydama hızla döndüğünü doğrulayın. Önceden soğutulmuş floş yağı 300 mikrolitre çizin ve hemen mikrokanal giriş deliğinin pipet ucuna yağ aktarın. Floş yağı mikrokanala taşınır ve mikroodaların dışında bulunan aşırı reaksiyon çözeltisini dışarı taşır.
Aynı anda cihazdan iki takılı pipet ipucukaldırın. Cihazı hemen alüminyum bloktan parafin filmine taşıyın. Sızdırmazlık yağını içeren hazırlanan pipet ucunu PDMS mikrokanalının girişine takın ve yağ prizinden taşana kadar enjekte edin.
Femtolitre damlacıkları yağ tarafından ayrı ayrı mikroodalarda kapatılır. Defodaklanmış BF görüntüsünü açın. Her çerçeveden düzgün sürekli arka planlar kaldırmak için İşlem menüsünden Arka Planı Çıkar'ı seçin.
Yuvarlanan top yarıçapı için 20 girin. Önizleme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı seçin. Tüm görüntüleri işleyip işlemeyecekleri sorulduğunda Evet'i seçin.
Ardından, gürültüyü azaltmak için İşlem, Filtreler, Ortanca'yı seçin. Pikselyarıçapı için 2.0 girin. Önizleme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı seçin.
Tüm görüntüleri işleyip işlemeyecekleri sorulduğunda Evet'i seçin. Ardından, mikroodaların görüntülerini görüntünün arka planından ayırmak için Görüntü, Ayarla, Eşik'i seçin. Eklentiler menüsünden FemDA, FemDA Analysis'i seçin.
Tek bir mikro haznenin yaklaşık minimum ve maksimum piksel sayılarını girdi. Mikroodaların beklenen minimum ve maksimum daireselliği ve başlangıç ve bitiş karesi numaraları, ardından mikro odaları algılamak için Yatırım Getirisi Oluştur'u seçin. Başarıyla algılanan ROI'lar açılır menü ROITable'da gösterilir.
FemDA Çözümleme penceresinde, YG maskesi uygula'yı seçin. Mikro odaların doğru şekilde algılanıp algılanmadıgini görmek için görüntüyü inceleyin. Floresan görüntüsünü açın ve öne getirin.
Floresan resmine ROI'ları eklemek için YG maskesini tekrar uygula'yı tıklatın. FemDA Çözümleme penceresinde, görüntü uç noktası verilerini çözümlemek için Tek Çekim'i seçin. İlgili damlacık ortalama yoğunluğunu hesaplamak için her YG'nin üst uç piksellerini kullanmak için üst piksel sayısı için N girin.
Ardından, algılanan tüm damlacıkların ortalama yoğunluklarını hesaplamak için yoğunluğu ölçü'ye tıklayın. YGTable floresan görüntüden yeni verilerle güncelleştirilir ve histogram yeni bir pencerede görüntülenir. Metin Olarak Kaydet düğmesini tıklatarak verileri dışa aktarın.
Floresan solüsyon FemDA mikroodalarında kapsüllenmiş ve damlacık boyutu ile ilişkili floresan yoğunluğu mikroskopi ile ölçüldü. Damlacıkların dar boy dağılımı saptadı. Konfokal mikroskopiden elde edilen yeniden yapılan 3Boyutlu görüntü de zaman içinde tutarlı damlacık boyutunu gösterdi.
Damlacıklar oda sıcaklığında buharlaşma kaybı veya damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon olmaksızın en az 24 saat stabildi. Floresan protein mNeonGreen FemDA sentezlendi. Ve yığın görüntü verileri eşzamanlı deodaklanmış parlak alan görüntüsü yardımıyla analiz edildi.
Her damlanın floresan yoğunluğu protein verimi ile ölçüldüğünde, histogram damlacık başına eşit olmayan sayıda DNA molekülü önerir. Farklı sayıda DNA molekülü içeren damlacıkların olasılığı Poisson dağılımına mükemmel bir uydu. FemDA'da her beş dakikada bir çekilen görüntülerle alkali fosfataz enziminin sentezi de gerçekleştirildi.
Reaksiyon, damlacıkların floresan yoğunluğunun daha önceki bir zaman noktalarında benzer bir şekilde gizli bir dağılım gösterdiğini ve histogram sonuçlarının damlacıklarda DNA moleküllerinin eşit olmayan sayılarının doğruladığını gösterdi. Tek tek damlacıklarda kapsüllenmiş tek DNA molekülü daha da kurtarılabilir, güçlendirilebilir ve sıralı olarak en yüksek protein taraması mümkün kılabilir. Küçük hacimli ve yüksek stabilite içeren damlacık tekniği, belirli biyobelirteçlerle kanser hastalıklarının hızlı ve hassas moleküler tanısına olanak sağlar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücre dışı protein sentezi için düzlemsel bir alt tabaka üzerinde bir milyondan fazla tekdüze ve kararlı femtolitre damlacığın hazırlanmasını açıklamaktadır. Damlacıklar, hızlı ve kantitatif enzim aktivite ölçümünü kolaylaştırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Protein Sentezi
- Enzim Aktivitesi Ölçümü
Arka Plan
- Hücresiz protein sentezi, biyoteknolojide değerli bir araçtır.
- Tekdüze damlacıklar, reaksiyon koşullarını ve ürün verimini artırabilir.
- Geleneksel protein ekspresyonu ve saflaştırma yöntemleri karmaşık olabilir.
- Bu teknik, doğrudan ölçüm için damlacıklar kullanarak süreci basitleştirir.
Çalışmanın Amacı
- Üniform femtolitre damlacıklar üretmek için bir yöntem geliştirmek.
- Hücre dışı protein sentezini basitleştirilmiş bir şekilde mümkün kılmak.
- Hızlı ve kantitatif enzim aktivite ölçümlerine olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Damlacık oluşumu için düzlemsel bir substratın hazırlanması.
- Tekil DNA moleküllerinin damlacıklara dağıtılması.
- DNA molekül konsantrasyonuna dayalı protein veriminin ölçümü.
- Düzenli damlacık oluşumunu sağlamak için lamel camın sonikasyonu.
Temel Sonuçlar
- Bir milyondan fazla tek tip damlacık başarıyla üretilmiştir.
- Protein veriminin, her bir damlacıktaki DNA molekülü sayısı ile orantılı olduğu bulunmuştur.
- Teknik, etkili enzim aktivite ölçümüne olanak tanır.
- Karmaşık protein ekspresyonu ve saflaştırma basamaklarının ortadan kaldırılması sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, damlacık tabanlı protein sentezi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Bu yaklaşım, enzim aktivite analizlerini önemli ölçüde kolaylaştırabilir.
- Gelecekteki uygulamalar çeşitli biyoteknolojik alanlara genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Femtolitre Damlacık Dizisi (FemDA), tekil DNA moleküllerinden kitlesel paralel protein sentezine olanak tanıyarak yüksek kapasiteli tarama ve kantitatif enzim aktivite analizlarını destekler. Protein verimini her damlacıktaki DNA kopya sayısı ile ilişkilendiren bu teknoloji, erken keşif aşamasında hedef doğrulama ve öncü bileşik tanımlama için istatistiksel olarak güçlü bir platform sunar. Minimum reaktif tüketimi ve standart mikroskopi ile uyumluluğu, biyofarma Ar-Ge süreçlerindeki biyolojik hipotezlerin risklerini azaltmak için ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir araç olmasını sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Protein çıktısını tek molekül DNA girdileriyle ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kantitatif, damlacık çözünürlüklü protein sentezi okumaları aracılığıyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Tekrarlanabilir, istatistiksel olarak anlamlı protein verim dağılımları sağlayarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tutarlı, kantitatif hücre dışı protein sentezi için tek tip femtolitre reaktörler oluşturur.
- Operasyonel Değer: Karmaşık saflaştırma işlemleri olmadan hızlı enzim aktivitesi ölçümüne olanak tanıyarak analiz geliştirme süresini kısaltır.
- Ölçeklenebilirlik: Cihaz başına bir milyondan fazla damlacık, çok yüksek düzeyde paralel tarama kampanyalarına olanak sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: DNA girdisini fonksiyonel protein çıktısı ile ilişkilendirerek biyobelirteç odaklı assay tasarımını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Genotip-fenotip ilişkilerini açıklığa kavuşturmak için protein sentezindeki değişkenleri izole eder.
- Öngörücü Güven: Poisson dağılımlı DNA yüklemesi, ekspresyon değişkenliğinin istatistiksel modellenmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
FemDA teknolojisi; hipotez testi, assay standardizasyonu ve kantitatif analizlere olanak tanıyarak erken keşif iş akışlarına entegre olur ve protein verimi korelasyonu ile tekrarlanabilirlik yoluyla translasyonel uygunluk sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Protein sentez olaylarının tek molekül çözünürlüğünde analizi yoluyla hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir, yüksek yoğunluklu protein ekspresyon taramaları için analize hazır, tekdüze damlacık dizileri sağlar.
- Analitik: Protein verimiyle orantılı floresan yoğunluğu okumaları sunarak farklı koşullar arasında kantitatif karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: DNA kopya sayısını fonksiyonel protein çıktısıyla ilişkilendirerek biyobelirteç odaklı analiz translasyonunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standart temiz oda ve floresan mikroskobu ile uyumlu olup keşif ekipleri arasında geniş çaplı yeniden kullanıma imkan verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tek moleküllü protein sentezi korelasyonu aracılığıyla hedef doğrulamada öngörü güvenilirliği.
- Operasyonel Değer: Tekdüze damlacık boyutu ve sızdırmaz femtolitre odacıklar sayesinde standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Kantitatif, istatistiksel olarak çözümlenebilir ekspresyon verileri ile geliştirilmiş devam/durdur kararları.
- Portföy Etkisi: Yüksek verimli, düşük tüketimli tarama ile mümkün kılınan risk ayarlı önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Mikrofabrikasyon, yüzey kimyası ve mikroakışkan sızdırmazlık protokolleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Cihaz fabrikasyonu için spin coater'lara, plazma aşındırıcılara ve vakum odalarına erişime bağlıdır.
- Damlacık stabilitesi için ekipler arasında yağla sızdırmazlık ve sürfaktan protokollerinin standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı protein sistemlerine adaptasyon, hücre dışı sentez koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Floresan tabanlı okuma, uyumlu raporlayıcılar ve sönümleme kontrolleri gerektirir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Cleaning and Silanizing the Glass
1:26
Spin-Coating the Glass Substrate
2:40
Photolithography, Etching, and Cleaning
3:47
Fabricating the Microchamber Array Device
5:04
Generating the Femtoliter Droplet Array (FemDA)
6:35
Image Data Analysis
8:45
Results: Cell-Free Protein Synthesis in FemDA
10:07
Conclusion
