Name: Glioblastoma için 3D Spheroid Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, glioblastoma kök benzeri hücreler için 3D sferoid invazyon analizi geliştirmeyi. Bu yöntem, sağlıklı beyin dokusuna tümör invazyonunu inceleyerek ilaç etkilerini daha doğru değerlendirmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime) tarafından desteklenmiştir. Joris Guyon, Toulouse Üniversitesi Hastanesi'nden (CHU Toulouse) burs sahibidir.

Tüm hastalardan (Yerel etik komitesi yönetmeliklerine göre Haukeland Hastanesi, Bergen, Norveç'ten) yazılı onay alındı. Protokolümüz kurumumuzun insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.
1. Tek tip boyutta tümör küresellerinin üretimi
NOT: Kök benzeri hücreler b27 takviyesi ile tamamlanan nörobazal ortamda kültürlü, heparin, FGF-2, penisilin, ve streptomisin, önceki makalelerde açıklandığı gibi12. Bu hücreler kültürde kendiliğinden küresel oluştururlar.
<ol><li>Tümör hücrelerini 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri 0,5-1 mL ayrışma enzimi ile kuluçkaya yatırın (Bkz. Malzeme Tablosu)37 °C'de 5 dakika süreyle.</li>
	<li>4-4,5 mL PBS ile yıkayın ve tam büyüme ortamının 10 mL'sini ekleyin (komple nörobazal ortam, cNBM).</li>
	<li>Trypan mavisi ve hücre sayma odası slaytı ile otomatik sayma tekniği kullanarak hücreleri say.</li>
	<li>Sferoid başına 104 hücreli 100 küresel sferoid üretmek için (tercih edilen boyuta göre) 106 hücreyi 8 mL NBM'de 2 mL ile %2 ml'lik metilselüloz ile karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu steril bir sistem kabına aktarın ve çok kanallı pipetle 100 μL/iyi yi 96 iyi yuvarlak alt plakaya dağıtın.</li>
	<li>Plakayı 37 °C, %5 CO2 ve %95 nem de kuluçkaya yatırın. Eşit büyüklükte küresel ler oluşacak ve 3-4 gün sonra kullanılabilir.</li>
</ol>2. Üç boyutlu deneyler
<ol><li>Çoğalması<ol>
<li>Hazırlık<ol>
<li>Inhibitörleri (örneğin, Şekil 4A'dakigibi rotenon) ve 100°L ortadaki kimyasalları askıya alın ve her kuyuda 100°L orta (yani kuyu başına bir küresel oid) ekleyin.</li>
			<li>Plakayı 37 °C, %5 CO2ve %95 nem de kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Görüntü edinimi ve analizi<ol>
<li>T0'da bir dizi koşul oluşturmak için brightfield'da bir video mikroskobuyla fotoğraf çekin ve aşağıdaki saatlerde beklenen.</li>
			<li>Resimleri el ile veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu el ile yapmak için, serbest seçim aracı ile küresel çekirdek etrafında bir daire çizin ve her küresel alanın ölçün. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, Ek Belge 1'de yalnızca //Core Area ile gösterilen makroyu kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işgali<ol>
<li>Hazırlık<ol>
<li>1 mg/mL son konsantrasyonda tip I kollajen, 1x PBS, 0.023xVkollajen,1 M sodyum hidroksit ve steril H2O. 30 dakika buz üzerinde çözelti inkübün tip I kollajen ile buz üzerinde bir tüp kollajen matris hazırlayın.</li>
			<li>500 μL tüplerde yuvarlak alt kuyu plakasından küresel leri toplayın ve 200 μL 1x PBS ile 2x yıkayın.</li>
			<li>Pipet küresel leri kollajen matrisin 100 μL'lik kısmına dikkatlice yerleştirin ve normal 96 kuyu plakalı bir kuyunun ortasına yerleştirin.</li>
			<li>37 °C'de 30 dakika kollajen jel inkübün ve sonra jel üstüne cNBM ekleyin. Inhibitörler veya aktivatörler (örneğin, Şekil 4B, 4C'degösterildiği gibi hidrojen klorür) bu adımda ortama eklenebilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Görüntü edinimi ve analizi<ol>
<li>Kollajen eklenmesinden sonra brightfield modunda 24 saat video mikroskobu ile sırayla fotoğraf çekin.</li>
			<li>Resimleri el ile veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu el ile yapmak için, serbest seçim aracı ile çekirdek ve küresel toplam alanı etrafında çizmek ve çekirdek alanı ile toplam alanı çıkararak her küresel invaziv alanı ölçmek. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, invaziv alanı belirlemek için Ek Belge 1'de belirtildiği gibi makroyu kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geçiş<ol>
<li>Hazırlık<ol>
<li>37 °C'de 30 dakika boyunca NBM'de Matrigel (0.2 mg/mL) ile 6 kuyulu bir plaka katın, sonra Matrigel'i çıkarın ve 2 mL cNBM ekleyin.</li>
			<li>Spheroidleri yuvarlak alt kuyu plakasından 6 kuyu plakasına 50 μL cNBM'ye aktarın.</li>
			<li>Plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve küresel lerin yapışmasını bekleyin.</li>
			<li>24 saat kuluçkadan sonra, 10 ng/mL Hoechst ile leke ve 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Görüntü edinimi ve analizi<ol>
<li>Brightfield'da bir video mikroskobu kullanarak görüntü elde edin. 405 nm lazer Hoechst boyama görselleştirme için kullanılır.</li>
			<li>Resimleri analiz etmek ve Makroyu Ek Belge 1'debelirtildiği gibi çalıştırmak için Fiji yazılımını kullanın. NOT: Kuyunun dibine dokunmak veya süpernatantı tamamen çıkarmak küresel lere zarar verir. Kollajen tip I jel işleme için, kollajen polimerizasyon önlemek için buz üzerinde jel tutmak, pH değişikliği jel kompaktlık etkileyecek, çünkü asidik bir bileşen eklemeyin, ve pipet hücreleri hızla hücre ölümü ve jel bozulmasını önlemek için kollajen içine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fiji Makro
NOT: Fiji, kamu malı olarak geliştirilen ve makroların geliştirilmesinin görüntü analizini hızlandırmasına olanak tanıyan bir görüntü analizi programıdır. Manuel analiz de mümkündür, ancak bu yavaş bir süreçtir ve önyargılar getirebilir. Görüntüler, yazılımdaki sürükle ve bırak ile içe aktarılabilir ve YG Manager Tools eklentisi ile ölçülebilir. Bu çalışmada kullanılan prosedür aşağıda açıklanmıştır:
<ol><li>Makro penceresini açın: Eklentiler | Makrolar | İnteraktif Tercüman.</li>
	<li>Aşağıdaki uyarlanmış mor döngüyü kopyalayın ve yapıştırın. Mor cümlelertutun ve ilgi yeşil cümleler ekleyin(Ek Belge 1).</li>
	<li>Tüm serileri analiz etmek için, belirli bir nicelik için parametreleri kırmızı ya da Makrolar'ı kullanarak çalıştırın | Makro'yu çalıştırın veya Ctrl+Rtuşuna basın.</li>
	<li>İlgi alanı (YG) tarafından kontrol edin ve gerekirse el ile uyarla.</li>
</ol>4. Küresellerin elektron mikroskobu
NOT: Aşağıdaki adımların çoğu kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.
<ol><li>Fiksasyon adımı<ol>
<li>Kesilmiş pipet ucu ile küresel toplamak, bir 1.5 mL tüp koymak ve 0.1 M fosfat tampon (PB) ile 1x yıkayın.</li>
		<li>Küresel oidi bir gecede 4 °C'de %2 glutaraldehit/%2 paraformaldehit (PFA) 0,1 M PB olarak düzeltin.</li>
		<li>Fiksasyon çözeltisini 0,1 M PB'de %1 PFA çözeltisi ve ardından numune hazırlama ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numune hazırlama<ol>
<li>Bir süzgeç içine spheroids aktarın ve küresel hasarı önlemek için bir cam kabına koyun.</li>
		<li>3x'i 0,1 M PB ile dikkatlice yıkayın.</li>
		<li>Karanlıkta 2 saat osmiyum ile kuluçka. Osmiyum%4'ü %1 0,1 M PB tamponunda seyreltin.</li>
		<li>3x'i 0,1 M PB ile dikkatlice yıkayın.<ol>
<li>Aşağıdaki gibi dehydrate: 10 dakika için% 50 etanol, 10 dakika için% 70 etanol, 15 dakika için 2x 90% etanol, 2x 100% etanol 20 dakika ve 30 dakika için 2x aseton.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnekleri 50/50 aseton/rekarn karışımında 2 saat kuluçkaya yatırın. Bu adımda EPON reşinini hazırlayın (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4.5 g).</li>
		<li>Aseton/rekarn karışımını atın, taze hazırlanmış rezorile değiştirin ve bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Resenini yenisi ile değiştirin ve 2-6 saat arasında kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Reşattaki küresel leri 60 °C'de 48-72 saat kalıba ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Tümör spheroid tahlilleri, proliferasyon, invazyon ve göçün yanı sıra hücre ölümü ve ilaç yanıtı gibi tümör özelliklerini incelemek için iyi adapte edilmiştir. Kanser hücreleri, Şekil 4B,C'degörüldüğü gibi invaziv bir mikrotümör oluşturan 3D matrisi istila eder. İnvaziv süreç sırasında, matriks metalloproteinazlar (MMP) tümör hücrelerini çevreleyen matrisleri sindirir13, ve MMP inhibitörleri (örneğin, GM6001 veya Rebimastat) hücre invazyonunu bozabili...

Birincil veya ticari olarak mevcut hücre hatları kullanılarak yapılan çalışmaların çoğunda, tahliller tek katmanlı kültürler olarak plastik yüzeylerde yetiştirilen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Hücre kültürünü n in vivo 3D hücre ortamını taklit etmediği için, hücre kültürünü 2B olarak yönetmek dezavantajları temsil eder. 2B kültürlerde, tüm hücre yüzeyi ortamla doğrudan temas halindedir, hücre büyümesini değiştirir ve ilaç bulunabilirliğini değiştirir. Ayrıca, fizyolojik olmayan plastik yüzey hücre farklılaşmasını tetikler1. Bu zorlukların üstesinden gelmek için üç boyutlu kültür modelleri geliştirilmiştir. Onlar tümörlerin çok hücreli mimarisi ve heterojenite taklit avantajı var2, ve böylece katı tümörler için daha uygun bir model olarak kabul edilebilir3. Küresel lerin karmaşık morfolojisi ilaç penetrans ve direnç4daha iyi değerlendirilmesine katkıda bulunur. Küresel tümör heterojenitesi oksijen ve besin lerin difüzyonunu ve farmakolojik ajanlara yanıtı etkiler (Şekil 1A). Küresel boyut 300 μm'ye ulaştığında oksijen difüzyonu değişir ve küreseloidin merkezinde hipoksik bir ortam ortaya çıkarır(Şekil 1A,C). Metabolitler de hücre tabakaları ile daha az nüfuz ve metabolik reaksiyonlar telafi5yer alır. Küresel çapı arttığında, nekrotik çekirdekler görülebilir, daha fazla taklit özellikleri birçok katı kanserlerde bulunan, agresif beyin kanseri glioblastoma dahil (GBM)6.
Glioblastom için birkaç 2D veya 3D invazyon tahlilleri literatürde bildirilmiştir7,8. İki boyutlu tahliller esas olarak ince bir matris tabakası üzerinde yatay bir düzlemde veya Boyden odası tahlil9işgali incelemek içindir. Klasik glioblastoma hücre hatları10kullanılarak 3Boyutlu spheroid kültürleri ile üç boyutlu tahliller tanımlanmıştır. Daha karmaşık varyantlar çatışma kültürleri11tümör spheroids tarafından beyin organoidlerin invazyonu ile temsil edilmektedir. Ancak, herhangi bir laboratuvar için kolay kullanımlı ve tekrarlanabilir bir test geliştirmek hala önemlidir. Hasta örneklerinden glioblastoma kök benzeri hücreler üretmek için bir protokol geliştirdik. Bu tahlillerin sayısallaştırılması kolayca yönetilebilir ve sadece açık erişimli çevrimiçi yazılım gerektirir. Kısaca, tümör parçaları küçük parçalar halinde kesilir ve enzimatik olarak sindirilir. Sindirimden elde edilen tek hücreler nörobazal ortamda yetiştirilir. 4-7 gün sonra küresel yapılar kendiliğinden oluşur. Fare modellerinde intrakranial implantasyon üzerine, psödo-palisading hücreleri ile çevrili bir nekrotik çekirdek sergileyen tümörler oluştururlar12. Bu, GBM hastalarında bulunan özelliklere çok benzer.
Bu makalede, tekrarlanabilirliği sağlamak için belirlenen sayıda hücreden küresel üreme protokolümüzü açıklıyoruz. Bu amaçla iki tamamlayıcı matris kullanılabilir: Matrigel ve kollajen tip I. Matrigel büyüme faktörleri ile zenginleştirilmiştir ve hücre bağlanması ve göçü için gerekli olan memeli bazal zarını taklit eder. Öte yandan, kollajen tip I, stroma yapısal bir unsur, en sık görülen fibrillary ekstrasellüler matriks ve hücre invazyon tahlillerinde kullanılır. Burada, göç ve proliferasyon tahlilleri yaparak GBM küresel modelimizi gösteriyoruz. Analiz sadece sabit zaman noktalarında değil, aynı zamanda canlı görüntüleme ile küresel genişleme ve hücre hareketi izleyerek yapıldı. Ayrıca morfolojik detayları görselleştirmek için elektron mikroskobu yapıldı.

<table><tbody><tr><td>96 kuyulu yuvarlak alt plaka</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>4 &°C'de saklanır; C, küre ayrışma enzimi</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20 °C'de saklanır; C, kullanmadan önce buzunu çözün</td></tr><tr><td>Temel Fibroblast Büyüme Faktörü</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 ° C'de saklanır; C, kullanmadan önce buz çözme</td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Fiji yazılımı</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Resimleri analiz etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Şişe 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>-20 °C'de saklanır; C, soğukta 0.2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş NBM</td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>% 2 nihai konsantrasyon için NBM içinde seyreltilmiş</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>4 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Penisilin - Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Tripan mavisi% 0.4</td> <td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Hücre sayımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Tip I Kollajen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>4 °C'de saklanır; Ç</td></tr></tbody></table>

glioblastoma için 3d spheroid model

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

İki boyutlu (2D) hücre kültürleri in vivo tümör büyümesini tatmin edici bir şekilde taklit etmez. Bu nedenle üç boyutlu (3D) kültür spheroid modelleri geliştirilmiştir. Bu modeller nöro-onkoloji alanında özellikle önemli olabilir. Gerçekten de, beyin tümörleri sağlıklı beyin ortamı işgal eğilimi var. Burada tümör invazyonunu incelemek için geliştirdiğimiz ideal 3Boyutlu glioblastoma spheroid tabanlı bir test tanımlıyoruz. Bu analizi başarıyla gerçekleştirmek için tüm teknik ayrıntıları ve analitik araçları salıyoruz.

Protokoller bölümünde açıklandığı gibi spheroidler hazırlandı ve göç, invazyon, proliferasyon ve mikroskopi ile ilgili gözlemler yapıldı. Küresel yapının farklı alanlarında ki hipoksiyi ölçmek için hipoksik aktiviteyi belirlemek için karboksik anhidraz IX boyama kullanılmıştır(Şekil 1A-C). Küresel merkezde daha fazla CAIX-pozitif hücre gözlendi (Şekil 1A-C). Küresel çekirdekte bulunan hipoksik hü...

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

İki boyutlu hücre kültürleri in vivo tümör büyümesini yeterince taklit etmez. Geliştirmek için, 3D prosedürleri küresel kullanılarak geliştirilmiştir. Bizim 3D glioblastoma spheroid tabanlı test özellikle sağlıklı beyin tümörü ortamına beyin tümörü invazyonu araştırmak için uygundur.Üç boyutlu kültür modelleri, çok hücreli bir mimariyi, heterojenliği ve tümörlerin metabolik durumunu özetlemek için kullanılabilir ve ilaç etkilerinin daha sıkı bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlar. Kuyunun dibine dokunmamaya veya süpernatantı tamamen çıkarmamaya, jeli buzda tutmadığından ve hücreleri hızlı bir şekilde jele eklemeye özenli bir şekilde. Düzgün büyüklükte tümör spheroidleri üretmek için, ilk PBS beş mililitre ile ilgi tümör hücre kültürünü yıkayın ve dissosiasyon enzim0.5 ile bir mililitre ile hücreleri tedavi.37 santigrat derecede beş dakika sonra, pbs dört ila 4,5 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve tam büyüme orta 10 mililitre içeren 15 mililitre konik tüp içine müstakil hücreleri aktarın. Sayma sonra, bir kez 10 tam büyüme orta sekiz mililitre başına altıncı hücrelere bir kez yeniden askıya 2% metilselüloz konsantrasyonu iki mililitre ile takviye ve steril bir sistem konte

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, beyin tümörlerinden türetilen gliomasferlerin nasıl tek hücrelere ayrıldığını ve hyaluronik asit bazlı bir hidrojel içinde nasıl kapsüllendiğini göstermektedir. Bu süreç, yapılandırılmış, üç boyutlu bir glioblastoma modeli oluşturarak hücre-hücre etkileşimlerini teşvik eder.

Glioblastoma hücrelerinin 3 boyutlu kültürü için hyaluronik asit bazlı bir hidrojel

Kaynak: Guyon, J.,  et al. Glioblastoma için bir 3D sferoid modeli. J. Vis. Uzm. (2020)Video, tümör hücresi istilasının üç boyutlu küresel bir modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Sferoidler, insan beyni tümör hücrelerinden oluşur ve bir kollajen matrisine gömülür. Küresel periferdeki tümör hücreleri, kollajeni parçalamak için proteazlar salgılayan ve çevredeki matrisi istila etmek için ilerleyen istilacı bir fenotip benimser.

Tümör Hücresi İstilasının Üç Boyutlu Küresel Modelinin Oluşturulması

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli tümörlerinden türetilen hücrelerin intrakraniyal enjeksiyonu ile kurulan GBM için klinik öncesi bir ortotopik fare modelini tarif ediyoruz. Bu model, insan GBM'sinin hastalık özelliklerini gösterir. Translasyonel çalışmalar için, fare beyin tümörü in vivo MRG ve histopatoloji ile izlenir.

Glioblastoma multiforme'un Translasyonel Ortotopik Modelleri

Civciv embriyoları, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerini ovo ve in vivo beyin dilimi ko-kültürlerinde incelemek için kullanılır. GBM hücre davranışı, ex vivo ko-kültürlerde hızlandırılmış mikroskopi ile kaydedilebilir ve her iki preparat da deneysel son noktada ayrıntılı 3D konfokal analiz ile analiz edilebilir.

Civciv Embriyo Beynini, İnsan Glioblastoma Hücre Davranışının In Vivo ve Ex Vivo Analizleri için Bir Model Olarak Kullanma

Burada, tümör sferoidlerinin hızlı, sağlam ve ucuz bir şekilde üretilmesini ve ardından hidrojel kapsüllenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Özel ekipman gerektirmediği için yaygın olarak uygulanabilir. Sferoid-matriks etkileşimlerini araştırmak ve in vitro doku fizyolojisi veya patoloji modelleri oluşturmak için özellikle yararlı olacaktır.

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi

İnvaziv cephede glioma tümör mikroçevresini replike etmek için interstisyel sıvı akışını içeren bir yöntem sunuyoruz. Bu model, bir sıvı basınç başlığının uygulanabileceği bir doku kültürü ekinde bir hyaluronan-kollajen I hidrojeldir. İstila ölçülebilir ve hücreler izole edilebilir veya parçalanabilir.

İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Öğrenin, glioblastoma kök benzeri hücreler için 3D sferoid invazyon analizi geliştirmeyi. Bu yöntem, sağlıklı beyin dokusuna tümör invazyonunu inceleyerek ilaç etkilerini daha doğru değerlendirmenizi sağlar.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Daha fazla video keşfet