Name: Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, fare B-1a hücrelerinde retroviral CXCR4 aşırı ekspresyonu ve benimsenmiş transfer yöntemiyle kemik iliği göçünü ve IgM üretimini inceleyin. Bu teknik, immün hücre gen terapisi potansiyellerini değerlendirmek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) ve R01GM100776 (T.P. Bender) Proje 3 tarafından desteklenmiştir. A. Upadhye Amerikan Kalp Derneği Ön doktora bursu 16PRE30300002 ve 5T32AI007496-20 tarafından desteklendi. Biz Joanne Lannigan, Mike Solga ve Claude Chew Virginia Flow Cytometry Core Üniversitesi onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan protokolleri Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Periton B-1 hücrelerinin manyetik ayrıştırılması ve zenginleşmesi
<ol><li>12−14 haftalık, erkek, CD45.1+ApoE-/- fare CO2kullanarak ötenazi .</li>
	<li>Düz cerrahi makas kullanarak karın yüzeysel bir kesim yapmak ve periton duvarı ortaya çıkarmak için kavisli makas kullanarak geri deri soyma. 10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak 10 mL 37 °C RPMI-1640 orta ile floş periton boşluğu. Kuyruğu kavrayarak ve fareyi 15−20 s boyunca iyice yan lara doğru hareket ettirerek hücreleri devre dışı kaldırmak için fareyi çalkalayın. NOT: Lavajlı periton masaj da hücre kurtarma maksimize edebilir.</li>
	<li>10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak periton sıvısını, peritonumun sağ alt tarafında, kalça seviyesinin hemen üzerinde, bağırsakların yakınında sıvı oluşturarak toplayın. Epidydimal yağ depoları ve altta yatan organları bozmaktan kaçının. Omental yağ kolayca şırınga içine çizilebilir gibi farenin sol tarafında sıvı çizim kaçının.</li>
	<li>~6−7 mL sıvı toplandıktan sonra, buz üzerine yerleştirilen 50 mL konik tüpe dağıtın. Daha sonra, kalan sıvının periton boşluğunun alt kısmında kalması için persepskullanarak diyaframın üzerindeki periton duvarını basılı tutarak fareyi dikey olarak yükseltin. Karaciğer üzerinde cerrahi makas kullanarak periton duvarında küçük bir kesim yapmak (karaciğer kesmek için değil emin olun) ve bir cam pipet ve ampul kullanarak kalan periton sıvısı toplamak.</li>
	<li>Tüm CD45.1+ApoE-/- farelerden (n = 15−20) 50 mL konik tüplere havuz periton yıkama hücreleri ve buz üzerinde depolayın. NOT: Gerekli fare sayısının hesaplanmasıiçin: B-1a hücreleri toplam periton popülasyonunun %5−10'unu oluşturur ve yazarların ellerinde fare başına yaklaşık 2,5−5 x 105 B-1a hücresi verir. Transdüksiyon verimliliği aşağıda gösterildiği gibi ~%30−40'dır.</li>
	<li>Trippan mavisi ve hemositometre gibi canlı lık boyası kullanarak canlı hücreleri sayın (seyreltik numuneler 1:5 trippan mavisinde ve hemositometre odasına 10°L yükleyin). Havuz hücreleri tüp başına 1 x 108 hücreye kadar. 4 °C'de 5 dk için 400 x g'de santrifüj hücreleri, daha sonra süpernatant aspire edilir.</li>
	<li>Fc reseptörlerini engellemek için8 1 mL anti-CD16/CD32 antikor(Malzeme Tablosu)içinde 1:50'ye kadar 1x fosfat tamponlu salin [PBS], %0,5 büyükbaş serum albumin [BSA], 2 mM EDTA) seyreltilmiş olarak yeniden askıya alın. Hücre sayısına göre gerektiği gibi ölçeklendirin. 4 °C'de 10 dakika buz üzerinde kuluçka.</li>
	<li>Tükenmesi için ispat tamponunda biyotinylated antikorların(Tablo 1)2x ana karışımını hazırlayın. 2x ana karışım, anti-CD16/CD32 ile kuluçkaya yatıldığında hücrelerin zaten içinde olduğu sıvının hacmini hesaplar. Örneğin, hücreler 500 μL'lik seyreltilmiş anti-CD16/CD32'de kuluçkaya yatsalar, tablo 1'deverilen son konsantrasyonları elde etmek için 10 μL biyotinylated Ter119, Gr-1, CD23 ve NK1.1 antikoriçeren 500 μL 2x ana karışımı ekleyin. Hücrelere 2x ana karışımı ekleyin ve 4 °C'de 20 dk için leke.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk 400 x g'de 5 mL çıkma tamponu ve santrifüj ile hücreleri yıkayın ve süpernatant aspire edin.</li>
	<li>Anti-biotin mikroboncukları(Malzeme Tablosu)ile hücreleri resuspend ve inkübül, üretici tarafından önerilen konsantrasyon ve protokole göre test tamponu ile seyreltilir.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk 400 x g'da 5 mL çıkma tamponu ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatant aspire edin ve 500 μL'lik bir arabellekte 1 x 108 hücreye kadar yeniden askıya alın.</li>
	<li>3 mL'lik sayma arabelleği ile asal manyetik seçim sütunları(Malzeme Tablosu). Hücreleri astarlı manyetik seçim sütunlarına aktarın ve buzun üzerindeki 15 mL konik tüpte zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüenttop. Toplanan toplam hacim 10 mL olana kadar manyetik seçim sütununa ek bir çalışma arabelleği yle yıkayın. NOT: Önceden saflaştırılmış ve arınmış hücre fraksiyonlarının bir aliquot ayrı ayrı CD19 + B hücreleri, F480 + makrofajlar ve CD5 + T hücreleri için boyama tarafından saflaştırma verimliliği için akış sitometri tarafından ayrı ayrı analiz edilmelidir Şekil 2'degösterildiği gibi .</li>
	<li>1.6'daki gibi canlı hücreleri sayarak arınmış hücre fraksiyonu (zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüent) saymak, ve B hücre kültürü orta sında 1 x 106 hücre/mL'de (RPMI-1640, %10 ısı yalıtımlı fetal sığır serumu [FBS], 10 mM HEPES, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pirüuvat, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol).</li>
</ol>2. Periton B-1 hücre stimülasyonu
<ol><li>İki transduced koşullar (Ctl-GFP ve CXCR4-GFP) için bölünmüş havuzlu hücreler, bir kenara ayarı ve transeformasyonsuz kontrol için en az 10 x 106 hücreleri kaplama.</li>
	<li>96 kuyulu yuvarlak alt plakalara her biri 150 μL'ye (150.000 hücre) kadar plaka koyun.</li>
	<li>Hücre çoğalmasını uyarmak için tüm kuyulara 100 nM TLR9 agonist ODN1668 ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 16−18 saat, %5 CO2'dekuluçka .</li>
</ol>3. Periton B hücrelerinin retroviral transdüksiyonu
<ol><li>Ctl-GFP (MigR1) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanarak üretin14. NOT: Bu işlem birkaç gün sürer, bu nedenle retroviral stokları hazırlayın ve titretleyin ve bu protokolü başlatmadan önce -80 °C'de aliquots saklayın.</li>
	<li>Buz üzerinde çözülme retrovirüs stokları. Hemen kullanın ve virüs titresi donma-çözülme döngüleri sırasında önemli ölçüde azalır gibi yeniden donma yok. Ctl-GFP veya CXCR4-GFP retroviral süpernatantlarını hücrelere 20:1'de 8 μg/mL polibren ve 55 μM son konsantrasyonda taze β-mercaptoethanol varlığında enfeksiyon (MOI) çokluğuyla ekleyin. Transeolmayan kontrol için ayrılan hücrelere viral stoklar eklemeyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 90 dk için 800 x g'de santrifüj plakaları ile spenfeksiyon yapın.</li>
	<li>37 °C'de retrovirüslü kuluçka plakaları, ek 3 saat için %5 CO2.</li>
	<li>Taze B hücresi orta ve kuluçka hücreleri hasat ve replate 37 °C, 5% CO2 gecede.</li>
</ol>4. Transekin periton B-1a hücrelerinin hücre sıralaması
<ol><li>Kültürlenmiş hücreleri ve havuzu her durum için üç ayrı 50 mL konik tüpe ayırın: transere, Ctl-GFP transduced ve CXCR4-GFP transduced.</li>
	<li>1.6 adımdaki gibi canlı hücreleri sayın, 400 x g'de 4 000 x g'de 4 °C'de 5 dk ve aspire süpernatant.</li>
	<li>Fc reseptörlerini engellemek için 1:50 anti-CD16/CD32 antikor(Malzeme Tablosu)içeren sıra tampon (PBS + %1 BSA) 100.000 hücre/μL'deki hücreleri yeniden askıya alın. 4 °C'de 10 dakika buz üzerinde kuluçka.</li>
	<li>Telafi kontrolleri için Aliquot hücreleri (kompanzasyon kontrolü başına~30.000 hücre): transeedilmemiş numuneden lekesiz ve tek leke kontrolleri aliquot ve transduced numunelerden GFP tek leke kontrolü aliquot için. NOT: Transeme edilemeyen hücre sayısı düşükse, ticari olarak kullanılabilen kompanse boncuklar tek leke kontrolleri için alternatif olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Sıra tampon florofor konjuge antikorlar içeren bir 2x antikor ana karışımı hazırlayın(Tablo 1). Transe, CTL-GFP transduced ve CXCR4-GFP transduced örneklerine 2x ana karışım ekleyin. Tek leke kontrolleri için bireysel antikorlar ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 20 dk kuluçka. NOT: 2x ana karışım, 1.8 adımda olduğu gibi anti-CD16/CD32 ile kuluçkaya yatıldığında hücrelerin zaten içinde olduğu sıvı nın hacmini hesaplar. CXCR4 aşırı ekspresyonunu onaylamak için cxcr4 için her koşuldan bir hücre aliquot ayrı ayrı boyanabilir.</li>
	<li>Numuneleri 1 mL tür tamponla yıkayın ve 70 μm filtreler den polipropilen tüplere süzün.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk 400 x g'de santrifüj ve aspire süpernatant. 50.000 hücre/μL'deki numuneleri sıralama tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre sıralamadan önce 1 mL toplama ortamı içeren etiketli floresan aktif hücre sıralama (FACS) toplama tüpleri (RPMI-1640, Her popülasyon için %20 ısı yalıtımlı FBS, 10 mM HEPES, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pirüuvat, 50 μg/mL gentamisin, 55 μM β-mercaptoetanol) sıralanır.</li>
	<li>Hücre ayırıcısında örnekleri çalıştırmadan önce ölü hücre ayrımcılığı için 2x DAPI (sıra tampon1:5000 seyreltme olarak hazırlanan) ekleyin.</li>
	<li>GFP+ B-1a hücrelerini DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ CTL-GFP ve CXCR4-GFP örneklerinden toplama ortamı içeren FACS tüpleri halinde sıralayın. GFP+ kapısını ayarlamak ve DAPI - CD19+ GFP- - B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ transduced olmayan B-1a hücrelerini sıralamak için transize olmayan örneği kullanın. NOT: Alternatif olarak, transeedilemeyen hücreler de CTL-GFP ve CXCR4-GFP örneklerinden GFP fraksiyonu içindeki B-1a hücrelerini ayrı ayrı ayırarak sıralanabilir. Transduced veya non-transduced B-1b hücreleri de DAPI olarak bu sıralama stratejisi kullanılarak sıralanabilir- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- hücreleri.</li>
</ol>5. Evlat edinme transferi
<ol><li>Hücre ayrıştırma sonra, 4 °C'de 5 dakika 400 x g santrifüj hücreleri ve aspire supernatant dikkatle.</li>
	<li>Soğuk steril 1x PBS'deki hücreleri 1.000 hücre/μL'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Anestezi erkek Rag1-/- ApoE-/- fareler isoflurane kullanarak ve bir ultra-ince insülin şırınga kullanarak intravenöz retro-orbital veya kuyruk damar enjeksiyonu ile fare başına 100 μL (100.000 hücre) enjekte. Kontrol olarak birkaç fareye 1x PBS enjekte edin.</li>
</ol>6. Donör hücrelerin ve plazma IgM'nin nicelleştirilmesi
<ol><li>İstenilen zamanda post-adoptive transfer, kemik iliği ve dalak doku hasat4 ve akış sitometri ile alıcı farelerde transfer hücreleri analiz. CD45.1, CD45.2 ve CXCR4 için boyama yaparak donör hücre lokalizasyonu ve CXCR4 aşırı ekspresyonu ölçün ve Flowjo gibi bir yazılım kullanarak akış sitometri sonuçlarını analiz edin. NOT: Bu adımda kullanılan antikorlar için Tablo 1'e bakınız. Transedonör hücrelerde GFP mevcut olacağından, FITC kanalındaki floresan bir antikor eşleği kullanmamaya devam edin.</li>
	<li>Hayvan kurban sırasında kardiyak delinme ile toplanan tam kana 0,5 M EDTA'nın 10 μL'sini ekleyerek plazmayı izole edin. 7.000 x g ve aliquot plazmada santrifüj tam kan ayrı 1.5 mL santrifüj tüpler içine. ELISA4tarafından IgM gibi salgılanan faktörlerin analizi yapılana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1a+cell+diversity%3A+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li>
<li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+%28IgH%29+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083(2015).</li>
<li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li>
<li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells%3A+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li>
<li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li>
<li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li>
<li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li>
<li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Syndromes+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).</li>
<li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function%3A+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li>
<li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li>
<li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li>
<li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation%2C+cell+survival%2C+and+Ig+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li>
<li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li>
<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double+life+of+a+B-1+cell%3A+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sağlanan yöntem, kararlı ve nispeten verimli primer B-1a hücre gen idamı, in vivo adoptive transferi ve enjekte edilen hücrelerin tanımlanması ve lokalizasyonu sağlar. Hücreler hücre transferi sonrası 17 hafta saptandı ve artmış CXCR4 ekspresyonu tutuldu. Retrovirüs aracılı doğum, elelerimizdeki hücre canlılığı üzerinde en az etkiye sahip primer murine B-1a hücrelerinin %30-40 transdüksiyon verimi elde etti(Şekil 4e). Bu retroviral enfeksiyon, adenoviral enfeksiyon, nükleofection veya...

Son çalışmalar önemli bağışıklık hücresi göstermiştir, ve özellikle B hücre, henotypik ve fonksiyonel heterojenite hücre lokalizasyonuna bağlı olarak1,2,3,4,5. B-1a hücreleri koruyucu IgM antikorları üretmek için heterojen kapasiteye sahip tür bir popülasyondur; kemik iliği B-1a hücreleri igM salgılar ve plazma IgM titreleriönemliölçüde katkıda 6 , periton B-1a hücreleri homeostaz düşük seviyeli IgM salgısı varken ve bunun yerine doğuştan gelen ücretli reseptör ile aktive edilebilir (TLR) veya sitokin aracılı sinyal hızla çoğalmak için, göç, ve gizli IgM7,8,,90.10 B-1a hücreli IgM antikorları patojenlerde, apoptotik hücrelerde ve okside LDL'de bulunan oksidasyona özgü epitoplar (OSE) tanır ve OSE'ye bağlanan IgM, ateroskleroz11gibi hastalıklarda inflamatuar akıntı sinyalini önleyebilir. Bu nedenle, kemik iliği gibi bölgelere peritoneal B-1a hücre göçlerini artırarak IgM üretimini artırma stratejileri terapötik olarak yararlı olabilir. Ancak, bu tür stratejilerin hedef alınması ve hücre tipine özgü olması önemlidir, çünkü hedef dışı etkiler bağışıklık fonksiyonunu veya sağlığını olumsuz etkileyebilir.
Burada primer murine B-1a hücrelerinde CXCR4'ün hedefli ve uzun süreli aşırı ekspresyonu ve hücre göçünü ve fonksiyonel IgM antikor üretimini görselleştirmek için sonraki evlat edinici transfer için bir yöntem açıklıyoruz (Şekil 1). Birincil B hücrelerinin genetik manipülasyonu, dönüştürülmüş hücre hatlarının transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında düşük transfeksiyon verimliliği ile sınırlıdır. Ancak, dönüştürülmüş hücre hatları önemli ölçüde birincil hücrelerden sapma olabilir12,13, birincil hücrelerin kullanımı daha yakından normal fizyolojisi hizalamak sonuçlar sağlamak olasıdır. Çeşitli teknikler retroviral transdüksiyon, adenoviral transdüksiyon, lipofection, ya da elektroporasyon tabanlı transfeksiyon, verimlilik, geçicilik değişen düzeylerde ve hücre sağlığı üzerinde etkisi13,,14,15dahil olmak üzere primer murine B hücrelerinde gen transferi için tanımlanmıştır. Aşağıdaki yöntemde retroviral transdüksiyon ,hücre canlılığını en az düzeyde etkilerken %gt;%30 oranında yeterli gen aktarım verimi vermiştir. CXCR4-ekspres retrovirüs daha önce açıklanan retroviral yapı murine kök hücre virüs-iç ribozomal giriş sitesi-yeşil floresan protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, içine fare CXCR4 gen alt klonlanmış olduğu4. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) ve CXCR4-GFP retroviral partikülleri daha önce yayınlanmış protokollerde açıklandığı gibi kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanılarak üretildi4,14.
Başarılı bir şekilde transebed B-1a hücreleri daha sonra intravenöz lenfosit eksikliği Rag1-/- farelere transfer edildi. Hem donör hem de alıcı fareler ayrıca apolipoprotein E (ApoE) geninin nakavtını içeriyordu, bu da OSE birikiminin artması ve aterosklerozla sonuçlanarak in vivo B-1 hücre aktivasyonu ve IgM üretimi için bir model sağladı. Ayrıca, donör ve alıcı fareler CD45 allotype farklı; donör B-1 hücreleri CD45.1+ ApoE-/- farelerden geldi ve Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- alıcılarına transfer edildi. Bu, donör CD45.1'in alıcı CD45.2 B hücrelerinden akış sitometrisi analizi sırasında B hücre belirteçleri için ek olarak lekelemeye gerek kalmadan transfer sonrası farklılaşmasına olanak sağladı. Burada verilen sonuçlar, B-1a hücrelerinde hedeflenen CXCR4 aşırı ekspresyonu, B-1a hücrelerinin kemik iliğine geçiş yapma yeteneğini n arttırdığını ve bu da artmış plazma anti-OSE IgM ile ilişkilendirdiğini göstermektedir. Ayrıca negatif seçim yoluyla periton B-1 hücrelerinin zenginleştirilmesi için bir yöntem sağlamak ta ve verimli transdüksiyon için B-1 hücre aktivasyonu gereksinimini göstermektedir. Bu yöntem, protein aşırı ekspresyonunun B-1a hücre göçü, fenotip veya fonksiyon üzerindeki etkisini incelemek için diğer retroviral yapılara uyarlanabilir. Ayrıca, CD45.1 karşı CD45.2 allotype ayrım kullanımı teorik olarak endojen B hücreleri içeren diğer bağışıklık-yeterli murine modelleri ne transfer izin verebilir.

<table><tbody><tr><td>70 mikron filtre kapakları</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>anti-biyotin mikroboncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16 / CD32 veya Fc blok</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>MFCR00</td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0452-83</td><td>Klon: RA3-6B2</td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APCef780</td><td>eBioscience</td><td>47-0193-82</td><td>Klon: eBio1D3</td></tr><tr><td>CD23 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0232-81</td><td>Klon: B3B4</td></tr><tr><td>CD23 PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0232-82</td><td>Klon: B3B4</td></tr><tr><td>CD3e biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0033-85</td><td>Klon: eBio500A2</td></tr><tr><td>CD45.1 ApoE-/- fareler</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Evde yetiştirilen</td></tr><tr><td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560580</td><td>Klon: A20</td></tr><tr><td>CD45.2 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562895</td><td>Klon: 104</td></tr><tr><td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- fareler</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Evde yetiştirilen</td></tr><tr><td>CD5 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0051-83</td><td>Klon: 53-7.3</td></tr><tr><td>Ctl-GFP retrovirüsü</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. TP tarafından sağlanan GFP eksprese eden retroviral plazmid MigR1 kullanılarak evde üretilmiştir. Bender</td></tr><tr><td>CXCR4 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td>Klon: 2B11</td></tr><tr><td>CXCR4-GFP retrovirüs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fare CXCR4'ün MigR1 retroviral plazmid</td></tr><tr><td>F4/80 biotin</td><td>Life Technologies</td><td>MF48015</td> klonlanmasıyla evde oluşturulur <td>Klon: BM8</td></tr><tr><td>Flowjo Software v. 9.9.6</td><td>Treestar Inc.</td><td>Lisans gerekli</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td>Klon: RB6-8C5</td></tr><tr><td>ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IgM PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562565</td><td>Klon: R6-60.2</td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Sarı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L34968</td><td></td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 biotin</td><td>BD Biosciences</td><td>553163</td><td>Klon: PK136</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ODN 1668</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-1668</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-82</td><td>Klon: Ter119</td></tr></tbody></table>

murine b-1a hücrelerinde cxcr4'ün retroviral aşırı ekspresyonu ve hedeflenen b-1a hücre nakliiçin kemik İliği ve igm Üretimine geçişinde benimsenmiş transfer

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Hücre fonksiyonu hücresel mikroortamda niş özgü faktörlerden etkilendiği gibi, hücre lokalizasyonu ve göç incelemek için yöntemler hücre fonksiyonu hakkında daha fazla fikir sağlayabilir. B-1a hücreleri, sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkan oksidasyona özgü epitoplara karşı koruyucu doğal IgM antikorları üreten farelerde benzersiz bir B hücre alt kümesidir. B-1a hücre igM üretimi B-1a hücre konumuna bağlı olarak değişir, ve bu nedenle yüksek antikor üretimini destekleyen nişler b-1a lokalizasyonu hedef terapötik bir açıdan yararlı olur. Burada C-X-C motifi kemokin reseptör4 (CXCR4) retroviral aracılı aşırı ekspresyonu ile kemik iliği B-1a hücre göçünün hedefsini hedefleyen bir yöntem açıklıyoruz. Primer murine B hücrelerinde gen indüksiyonu zorlu olabilir ve genellikle teknik bağlı olarak %10-20 oranında düşük transfeksiyon verimi verir. Burada primer murine B-1a hücrelerinin retroviral transdüksiyonunun %30-40 transdüksiyon verimi ile sonuçladığını gösterdik. Bu yöntem, donör B-1a hücre göçü ve lokalizasyonu görselleştirilebilmek için transduced B-1a hücrelerinin B hücresi eksikliği alıcı farelere benimseyen hücre transferini kullanır. Bu protokol diğer retroviral yapılar için değiştirilebilir ve donör hücre veya konak hücre fenotip ve fonksiyonunun analizi veya B-1a hücre transferi sonrası salgılanan çözünür faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel tahliller sonrası adoptive transfer, kullanılabilir. CD45.1 ve CD45.2 allotipi ile farklılaşan farklı donör ve alıcı farelerin kullanımı ve retroviral plazmid içinde bir GFP muhabirinin varlığı da endojen B hücre popülasyonları içeren diğer, bağışıklık-yeterli fare modellerinde donör hücrelerinin tespitini sağlayabilir.

Protokolegenel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2, diğer periton hücre tiplerinin manyetik tükenmesi sonrasında periton B-1a hücrelerinin zenginleşmesini gösterir. Tükenme sonrası fraksiyondaki canlı tekli hücreler F4/80+ makrofajlara göre CD19+ B hücrelerinin daha büyük bir oranına sahiptir, CD5hi CD19- T hücrelerinden yoksundur ve ön tükenme fraksiyonuna göre CD19+ CD5orta B-1a hücrelerinin artan fr...

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Bu protokol, hedeflenen gen iletiminin B-1a hücre lokalizasyonunu ve işlevini nasıl etkilediğini değerlendirebilir ve in vivo gen terapötik potansiyellerini incelemek için kavram yaklaşımının yararlı bir kanıtı olabilir. Bu yöntem primer B-1a hücrelerine istikrarlı ve nispeten verimli gen iletimi sağlar ve donör hücre fenotip ve fonksiyon post-adoptive transferi belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, hücre sağkalım, çoğalma ve fonksiyon da dahil olmak üzere vivo çeşitli donör ve konak hücre süreçlerini incelemek için kullanılabilir ve diğer benimseyen transfer sistemlerine uygulanabilir.Periton sıvısı hasat zor olabilir. Iyice kurtarma maksimize etmek ve periton hücre popülasyonunu kontamine edebilir bağırsakdelinmek önlemek için hücreleri devre dışı emin olun. Periton B-1 hücre koleksiyonu için, 12-14 haftalık, erkek, CD45.1+apolipoprotein E nakavt farenin karnında yüzeysel bir kesik yapmak için düz cerrahi makas kullanın ve periton duvarını ortaya çıkarmak için cildi soymak için kavisli makas kullanın.25 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik şırınga kullanarak, 37 derece RPMI-1640 orta 10 mililitre ile periton boşluğu floş. Farenin 15 ila 20 saniye boyunca bir taraftan diğer taraf

retroviral-overexpression-cxcr4-on-murine-b-1a-cells-adoptive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir...

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Bir hücre sedimantasyon manifoldu/slayt aparatı kullanarak yapışık olmayan bağışıklık hücrelerinin radyal hareketliliğini in vitro olarak izlemek için bir protokol açıklıyoruz. Hücre göçü, tümör hücrelerinin tek katmanlarında veya hücre dışı matriks proteinlerinde izlenir. Işık ve floresan mikroskobu ile inceleme, hücre hareketliliğinin ve sitotoksik işlevselliğin gözlemlenmesine izin verir.

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için rekabetçi hedef arama için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve gelecekteki temel ve terapötik araştırmalarda potansiyel uygulamalara sahiptir.

Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Öğrenin, fare B-1a hücrelerinde retroviral CXCR4 aşırı ekspresyonu ve benimsenmiş transfer yöntemiyle kemik iliği göçünü ve IgM üretimini inceleyin. Bu teknik, immün hücre gen terapisi potansiyellerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer (Video) | JoVE Journal

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Daha fazla video keşfet