Name: Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Keşfedin, organotipik tümör doku dilimlerinde gerçek zamanlı ilaç yanıtı ölçümü için orta verimli tarama yöntemini. Bu teknik, hasta kaynaklı tümör örneklerinde preklinik ilaç geliştirmeyi hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] ve Sidney Kimmel Vakfı [Kimmel Scholar Award], Akciğer Kanseri Discovery Ödülü (LCD-505536) tarafından desteklendi. Biz Dr Alana Welm (Utah Üniversitesi) meme kanseri PDX tümör sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Karşılaştırmalı Tıp, Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi (FHCRC) pdx modeli ve yararlı tartışmalar için Gujral laboratuvar üyeleri bakımı için personel teşekkür etmek istiyorum. N.N.A, FHCRC'nin JSPS Yurtdışı Araştırma Bursu ve Disiplinlerarası Eğitim Bursu ile desteklenir. A.J.B. FHCRC'den Kromozom Metabolizması ve Kanser Eğitim Bursu ile desteklenir.

Tüm fare deneyleri, Hayvan Refahı Yasası Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ndeki tavsiyelere ve biyomedikal araştırmalarda hayvanların bakımı ve kullanımına ilişkin Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak yapılmıştır.
1. Tümör doku dilimlerinin hazırlanması
<ol><li>Tablo 1'dekitarifi takip eden doku dilimi kültürünü (TSC) hazırlayın. Sterilize etmek için ortamı 0,45 m'lik vakum filtre ünitesiyle filtreleyin.</li>
	<li>Aliquot 250 μL tsc orta iyi başına 24 iyi plaka, ya da 6 iyi plaka için iyi başına orta 1 mL. Plakayı kullanıma kadar %5 CO2 nemli bir kuluçka makinesinde tutun. NOT: Ortam ve takviyeler doku tiplerine ve deneysel hedeflere bağlı olarak optimize edilebilir. Ortam miktarı sadece bir kültür eklemek gözenekli membran Emmek için yeterli olmalıdır. Membran seviyesini aşmayın. Orta seviye çok düşük veya çok yüksekse orta hacmi ayarlayın. Araştırmacılar immünomodülatör ajanları test ediyorsanız, IL-2 10 ile orta takviyesiöneririz.</li>
	<li>Farelerden elde edilen tümör dokusu nu kullanıyorsanız, önerilen bir prosedürle fareleri ötenazi, p etanol püskürterek farelerin maruz kalan derisini dezenfekte etmek ve tümörleri aseptik tekniklerle incelemek. Tümör dokusunu buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren bir tüpte saklayın.</li>
	<li>Taze hasta tümör dokuları kullanıyorsanız, kısa süreli buz gibi HBSS veya doku canlılığını korumak için uzun süreli depolama (24 saate kadar) için wisconsin Belzer Üniversitesi (UW) çözeltisi saklayın. NOT: Buz gibi UW çözeltisinde bir gecede gönderilen PDX dokusundan elde edilen dilimler başarıyla hazırlanmıştır.</li>
	<li>Tümör dokusunu buz gibi HBSS içeren 10 cm'lik bir kültür plakasına aktarın. Buz gibi HBSS batırılmış ise bir neşter ile yarıya tümör kesin. 6 mm çapında biyopsi zımba kullanarak silindiriçine tümör dokuları şekil ve düz bir yüzey oluşturmak için bir tarafı kırpma. Dokuları kullanıma kadar buz gibi HBSS'de saklayın. NOT: Genellikle merkezde olan ve opak ve kırılgan bir görünüme sahip olan dokunun nekrotik alanını kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Vibratome'yi kur. p etanol kullanarak tüm ekipmanları dezenfekte edin. Vibratom tampon tepsisi vibratom buz banyosu nun ortasına akrilik cam kapakla kaplanmış yerleştirin. Buz banyosuna buz ekleyin ve dilimleme sırasında doku serin tutmak için soğutulmuş HBSS ile tampon tepsisini doldurun. Bıçak tutucuya bir jilet takın. NOT: Vibratomların semisterile bir ortamda tutulması önceki deneyleri etkilemese de, vibratomu varsa biyogüvenlik kabini altında saklaması önerilir.</li>
	<li>Dişli forsepskullanarak HBSS'den biyopsi delikli tümör dokusunu dikkatlice kaldırın ve tiftiksiz kağıt havlu ile dokuyu dabbing ederek fazla tamponu çıkarın.</li>
	<li>Numune plakasına bir damla tıbbi dereceli siyanoakrilat tutkal yerleştirin ve dokuyu bu damlanın üzerine yerleştirin. 2-3 dk tutkal için hava kuru ve tampon tepsiye plaka yerleştirin. Doku tamamen tampon batırılmış kadar bazı HBSS ile tamam. NOT: Dokuların dik ve sabit bir konuma montajı, düzgün kesilmiş dilimler oluşturmak için çok önemlidir. Monte edilmiş dokular kararsızsa, dik bir pozisyonda kalmak için çevre dokuya daha fazla tutkal ekleyin veya dokuyu boşaltın, alttabakayı düzleştirir ve tekrar yapıştırın. Elastik dokular dilimleme sırasında daha kolay itilip bükülme eğilimindedir, bu durumda daha kısa uzunluklarda (&lt;5 mm) ve birden fazla çalıştırma uygun olabilir. Son derece kırılgan dokular için, kağıt havlu doku yok edebilir. Bu durumda, doku bazı aşırı HBSS uzak wick plastik bir yüzeye yerleştirilebilir.</li>
	<li>Vibratom ayarlarını ayarlayın. Aşağıdaki ayarlar kullanılır: kesme kalınlığı = 250 μm, genlik = 3,00 mm, dilimleme hızı = 0,01-0,25 mm/s ve bıçak açısı = 15°–21°. NOT: Dilimleme ayarlarını dokunun sertliğine bağlı olarak optimize edin. Daha yumuşak dokular daha düşük hızda daha derin bir bıçak açısı ile daha kolay kesilir. 18°'lik bir bıçak açısı, 0.10-0.18 mm/sn arasındaki kesme hızı ve 3.00 mm genliği mouse 4T1 ve PDX HCI010 tümörleri için iyi çalışır. Daha sert doku daha hızlı bir bıçak hızı ile kesilebilir.</li>
	<li>Bıçağın başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın ve sahnenin yüksekliğini ayarlayın. Dokular düzgün bir şekilde kesilene kadar birkaç döngü için dilimleri kesmek için sürekli modile cihazı çalıştırın.</li>
	<li>Dokuyu dilimletmedevam et. Dilimleri az miktarda HBSS arabelleği ile birlikte geniş uçlu transfer pipetli orta hücre kültürü kesici uça aktarın ve dilimin tamamını kaldırmak için emme yi bırakın. 24 kuyu luk bir tabağa kesici uç başına bir dilim yerleştirin. 6 kuyu plakası için bir kesici uç, çoğaltma telbetteiçin en fazla dört dilim barındırabilir. NOT: Doku diliminin son kenarı hala kesilmemiş dokuya bağlıysa, vibratomu durdurun ve doku dilimlerine dokunmadan veya dürtmeden iki çift ince uçlu forceps ile doku dilimini ayırın. Ayrı bir jilet asılı doku çıkarmada yararlı olabilir.</li>
	<li>İnce uçlu transfer pipetiyle fazla arabelleği çıkarın.</li>
	<li>Bıçak yapıştırılmış dokulara yaklaştığında, aleti durdurun, sahneyi düşürün, sertleştirilmiş dokuyu ayrı bir bıçakla çıkarın ve yeni bir doku tonu. Yeterli dilim toplanana kadar dilimleme devam edin.</li>
	<li>Kültür 37 °C, 5% CO2olarak belirlenen bir nemlendirilmiş kuluçka plakaları . Doku dilimleri hücre kültürü eklemek hava-sıvı interfaz kültürlü. Doku dilimleri ilk dilim hazırlığından sonra 24-48 saat deneyler için hazırdır. Uzun süreli ekim için, her 2-3 günde bir orta değişimi.</li>
</ol>2. Canlılık ölçümü
<ol><li>Doku diliminin canlılık ölçümü için, üreticinin talimatları doğrultusunda TSC ortamda 1:1.000 seyreltme de hem luciferase hem de secde içeren bir lüminesans bazlı canlılık ölçüm reaktifi ile orta değişimi. Reaktif luciferin11metabolize secde canlı hücrelerin indüksiyon aktivitesini ölçer. Her doku diliminin üzerine 50 μL enzim-substrat karışımı aktarın.</li>
	<li>Bir gecede % 5 CO2 ile 37 °C'de bulunan nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinin içinde bulunan bir orbital shaker üzerinde nazik ajitasyon ile kuluçka.</li>
	<li>Parlak sinyaller bir mikroplaka okuyucu veya 24 kuyu plaka kültürlü dokular için bir in vivo görüntüleme aracı kullanılarak ölçülebilir. 6 kuyu plakaüzerinde birden fazla doku bireysel canlılığını ölçmek için, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılmalıdır.<ol>
<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanırken, kapak olmadan mikroplaka ayarlayın. Parlak yoğunluğu ölçebilen her türlü mikroplaka okuyucu deney için uygun olmalıdır. Biz aşağıdaki ayarları kullanılır: okuma süresi = 1 s, üstten ölçüm, kazanç = 200. NOT: Daha yüksek doğruluk için, denemeyi ayarlamak için beyaz duvarlı bir mikroplaka kullanın. Beyaz duvar, açık alt 24 kuyu plakaları test edilmiştir, ve çoğu durumda, net kuyu plakaları sonuçları tehlikeye yok.</li>
		<li>Canlılığı ölçmek için in vivo görüntüleme sistemi kullanırken, plakayı sahnenin ortasına yerleştirin ve kapağı çıkarın. C'de sahne ayarı alanı, otomatik pozlama süresi, f-stop = 1, nesne yüksekliği = 0,0 cm olan mikroplaka olarak nesnel ayar ile parlak görüntüler takip normal fotoğrafgörüntüleri elde edin.</li>
		<li>In vivo görüntüleme sistemi ile birlikte görüntüleme yazılımı kullanarak Parlak yoğunluğunu ölçün. Her doku diliminin etrafına tutarlı ilgi alanları (YG) çizin. Bu protokol, yg'ler olarak 1 cm çapında bir daire kullanır (Bkz. Şekil 1). Alanın toplam akısı (p/s) ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Doku dilimleri üzerinde ilaç etkisinin değerlendirilmesi
<ol><li>Bölüm 2'de açıklandığı gibi, lüminesans bazlı canlılık ölçüm reaktifini kullanarak tedaviden önce temel canlılığı ölçün. NOT: Birkaç doku diğerlerine göre önemli ölçüde daha düşük canlılığa sahipse, tözden dokuları atla.</li>
	<li>Stok çözeltileri yapmak için dimetil sülfoksit (DMSO) içinde ilaç çözünür. TSC veya diğer kültür ortamı (25 μL/iyi, 250 μL orta içeren 24 kuyu plakası için) istenilen konsantrasyonlarda 10 x uyuşturucu çözeltisi hazırlayın. Araç kontrolü için, eşdeğer bir DMSO hacmi içeren ortam hazırlayın.</li>
	<li>Ek 10x ilaç çözümü kuyunun altındaki kültür ortamına. Pipetleme ile karıştırın ve dokuların üzerine ortamın 50°L'sini aktarın. NOT: Birkaç doku dilimi varsa, her durum için test yinelemeleri veya üçlemeler.</li>
	<li>Bir gecede 37 °C, %5 CO2,nemlendirilmiş bir inkübatörde bir orbital shaker üzerinde hafif çetren sallayarak inkübül.</li>
	<li>37 °C, %5 CO2,nemlendirilmiş inkübatörde plakayı çalkalayıcıdan çıkarın ve statik olarak inkübedin.</li>
	<li>İstenilen zaman noktalarında, bir mikroplaka okuyucu veya in vivo görüntüleme sistemi kullanarak dokulardan gelen Parlak yoğunluğu ölçün. Genellikle, ilaç etkileri tedavinin 1-6 gün sonra tespit edilebilir hale gelir. NOT: Lüminesans bazlı canlılık reaktifi kültür koşullarında en az 3 gün stabildir. Ancak, substrat doku metabolik aktivitesine bağlı olarak tsurel sırasında tükenmiş olabilir. Daha önce yüksek sinyallere sahip dokularda önemli bir sinyal düşüşü gözlenirse, tüm kuyularda substrat tamam.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak tedavi edilen tümör dokularının kalan canlılığını hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> Tedavi edilen dokunun canlılığı, kontrol tümör dokularının temel canlılığı ve canlılık değişimi ile normale döner.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, organotipik tümör doku dilimleri üzerinde kantitatif ve gerçek zamanlı ilaç etkinliği çalışmaları için bir platform gösteriyoruz. Doku dilimi kültür sistemi, hücre heterojenliğini ve doğal tümör mikroortamının fizyolojik özelliklerini yakalayarak geleneksel hücre bazlı in vitro yöntemlere göre farklı avantajlar sağlar. Bu platform aynı zamanda uyuşturucu etkinliği testi için daha yüksek verim sağlar, hücre kültürü çalışmaları ve in vivo deneyler arasındaki boşluğu köprü yardımcı.
<p class="jove_content...

Kanser hücresi etkileşimleri ile çevreleyen stromal dokunun fiziksel ve biyokimyasal özellikleri TME'yi oluşturur. TME tümör büyümesini uyarabilir, metastaz, ve tedaviye tümör yanıtı modüle1. Konvansiyonel klinik öncesi ilaç geliştirmede, ilaç adayları genellikle ilk kültürlü kanser hücre hatları kullanılarak taranır, kritik TME yoksun bir test platformu2. Hücre bazlı ön tarama aşamalarında fizyolojik TME Bu eksikliği tümör taşıyan hayvan modellerinde etkili ajanların keşfi ni sınırlayabilir ve gelişmenin daha sonraki klinik aşamalarında birçok umut verici onkoloji ilaçların yüksek yıpranma oranına katkıda bulunabilir3.
TME'nin tümör ilaç yanıtlarının modüle edilmesindeki önemine rağmen, deneysel kısıtlamalar ilaç keşfi ve gelişiminin erken aşamalarında fizyolojik olarak daha alakalı sistemlerin uygulanmasını sınırlandırmaktadır. Hayvan modellerinden veya hasta tümör örneklerinden tümörler de yüzlerce terapötik ajanın taranması pratik değildir. Gerçekten de, cerrahi örnekler çeşitli genetik geçmişe sahip kıt kaynaklardır ve hayvan modellerinde binlerce aday molekülün taranması deneysel ölçek, maliyet ve hayvan refahı nedeniyle mümkün değildir.
Tümör doku dilimi kültürü, tam olarak kesilmiş, ince tümör bölümleri kültürlü ex vivo, ilaç tarama tahlillerinde fizyolojik TME sınırlama adresi olabilir. Tarihsel olarak, nöroloji alanında öncülük ve beyin dokusu için dilim kültürünün geniş optimizasyonlar yaptı4. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, hücre hattı kaynaklı tümörler, spontan tümör modelleri, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) ve primer hasta tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli tümör dokusu tiplerinden dilimlerin hazırlanmasını göstermiştir. Ex vivo doku dilimi kültürü hem in vivo hem de in vitro kültür5yararları entegre. Tümör doku dilimleri bozulmamış doku mimarisi ve alacalı hücre bileşimi korumak, TME bağlamında kanser hücrelerinin çalışma sağlayan.
Bu protokol, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için gerçek zamanlı, son derece hassas bir canlılık testile birlikte bir organotipik tümör doku dilimi kültür sistemi tanıttı. Daha önce tanıtılan protokollerde organotipik tümör doku dilimleri üzerinde ilaç etkinliği testleri floresan boya dahil, immünohistokimya (IHC) veya MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenil tetrazolium bromür) tahlil6,,7,8,9. Ancak, tüm bu yöntemler in bitiş noktası tahlilleri dir ve düşük hassasiyet, uzun işlem süresi, karmaşık veri analizleri, dar sinyal aralığı ve yüksek deneysel hata dan muzdariptir. Bizim lüminesans tabanlı canlı hücre uyumlu reaktif geniş bir sinyal aralığı ve anlık (~ 5 dakika) ölçüm ön işleme ve minimum post processing olmadan sağlayarak bu tahlilleri geliştirir. Bu reaktif son derece hassastır ve hücre kültürü medyasında bir arada bulunabilir, hücre canlılığının sürekli ve zaman içinde ölçülmesine izin verir. Bu araştırma sistemi, klinik öncesi ilaç gelişiminde ilaç adaylarının doku dilimleri üzerinde yüksek işlem taraması için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>10 cm çanak</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu çanak</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>6 mm çaplı Biyopsi yumruğu</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>TSC için CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td> orta</td></tr><tr><td>Belzer UW soğuk hava deposu çözümü (UW çözümü)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membran Karışımı</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Çift Kenarlı Paslanmaz Çelik Kesme Bıçakları</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Doksorubisin (hidroklorür)</td> <td>dilimlemek için Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu forseps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu forseps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum, Magnezyum veya Fenol içermeyen TSC ortamı HBSS için Kırmızı</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, Utah Üniversitesi</td><td>Meme kanseri PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>TSC ortamı</td></tr><tr><td>için ITS + Premix</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>TSC ortamı IVIS</td></tr><tr><td>Spektrumu</td><td>için PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>TSC orta</td></tr><tr><td>Milicell Hücre Kültürü Eki, 12 mm, hidrofilik PTFE, 0.4 & m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Milicell Hücre Kültürü Eki, 30 mm, hidrofilik PTFE, 0.4 & m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>TSC ortamı</td></tr><tr><td>için PELCO Pro CA44 Doku Yapıştırıcısı</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>Tutkal</td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TSC ortamı için</td><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>15140163</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT Hücre Canlılığı Testi</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>TSC orta</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135 Tek Kenarlı</td><td></td></tr><tr><td>Endüstriyel Tıraş Bıçakları</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Yapıştırılmış dokuları çıkarmak için</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>TSC orta</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Fisher için </td><td>TSC ortamı</td>için <td>bilimsel BW13115E</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tooothed forseps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Geniş uçlu</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>İnce uç</td></tr><tr><td>William'ın ortamı E, TSC ortamı için glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td></td></tr></tbody></table> yok

organotipik tümör doku dilimlerinde gerçek zamanlı İlaç yanıtının Ölçülmesi

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Tümör dokuları kanserli hücreleroluşur, infiltrasyon bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, ve ekstrasellüler matriks. Bu karmaşık ortam tümör mikroçevresini (TME) oluşturur ve in vivo veya ilaç yanıtı ex vivo tedaviye yanıtı modüle edebilir. Konvansiyonel kanser ilaç keşif ekranları tek katmanlı kültürlü hücreler üzerinde yapılır, kritik TME etkisi yoksun bir sistem. Böylece, hassas ve yüksek iş yapma lı tahlilleri fizyolojik TME ile birleştiren deneysel sistemler klinik öncesi ilaç keşif sürecini güçlendirecektir. Burada, orta-yüksek-eldeli ilaç taraması için bir platform olarak ex vivo tümör doku dilimi kültürü tanıtmak. Organotipik doku dilimi kültürü, sıvı hava arabiriminde gözenekli bir zarın desteği ile sürdürülen hassas kesimli, ince tümör kesitleri oluşturur. Bu protokolde fare tümörlerinden ve hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinden alınan tümörlerden hazırlanan doku dilimlerinin hazırlanması ve sürdürülmesi ni açıklanmıştır. İlaç tedavisine yanıt olarak doku canlılığındaki değişiklikleri değerlendirmek için, dokudaki canlı hücrelerin gerçek zamanlı, hızlı ve hassas ölçümlerini sağlayan biyouyumlu lüminesans tabanlı canlılık testinden yararlandık. Bu platformu kullanarak doku dilimlerinin çoklu kiril inhibitörü, staurosporin ve sitotoksik ajan doksorubisin'e verdiği doza bağlı yanıtları değerlendirdik. Ayrıca, tek bir PDX tümöründen hazırlanan doku dilimleriüzerinde 17 klinik ve preklinik ilaç taranarak ex vivo farmakoloji için doku dilimlerinin uygulanmasını gösteriyoruz. Fizyolojik olarak ilgili, son derece hassas ve sağlam ex vivo tarama platformumuz klinik öncesi onkoloji ilaç keşfini ve tedavi karar verme kararını büyük ölçüde güçlendirecektir.

Burada, fare 4T1 meme tümörü dokuları ve meme kanseri PDX modeli, HCI01012hazırlanan tümör doku dilimleri için bir zaman ders, çoklu ilaç etkinliği değerlendirme protokolü göstermek. Biz başarıyla birkaç fare kaynaklı tümörler, PDX ve taze hasta tümörleri10doku dilimleri hazırladı. Tümör doku preparatı ve ilaç etkinliği testinin genel iş akışı Şekil 1'deaçıklanmıştır. Genel olarak, 1.000-1.500 mm3 hacimli tek bir tümörden 20-40 doku ...

Organotipik tümör doku dilimlerinde gerçek zamanlı ilaç yanıtını ölçmek için bir protokol uyguluyoruz. Burada özetlenen deneysel strateji, ekstrem koşullarda klinik veya fare tümörlerinden elde edilen doku dilimlerinde orta-yüksek iş yapma ilaç ekranları yürütmek için bir platform sağlar.

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Protokolümüz diğer moleküler analiz yöntemleri ile uyumludur ve ilaçların in-tact doku dilimlerinin canlılığını nasıl etkilediğinin ve orta iş bölümü taramasının performansını nasıl etkilediğinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, tüm doku diliminin canlılığını çok az işlem öncesi veya sonrası ile gerçek zamanlı olarak ölçebilmemizdir. Bu teknik, doğrudan hasta tümör doku örneklerinden elde edilen ilaç adayları veya doku dilimlerini test ederek klinik öncesi ilaç gelişimini ve onkolojiyi hızlandırır.Gerçek zamanlı doku canlılığı değerlendirme yöntemimiz oldukça yönlüdür ve kanser biyolojisi, nöroloji ve gelişimbiyolojisi çalışmalarına uygulanabilir. In-tact canlı doku dilimleri hazırlanması prosedürün başarısı için anahtardır. Orta bileşimdeki Vibratom ayarları doku tipine ve sıkılığına göre ayarlanmalıdır.Tümör doku dilimi edinimi gününde, aliquot 250 mikrolitre doku dilimi kültür orta iyi başına 24 iyi plaka ve her kuyu içine bir doku kültürü eklemek yerleştirin. Sonra kullanıma kadar 37 derece santigrat yüzde beş karbondioksit ile nemlendirilmiş bir kuvöz plaka yerleştirin. Tümör dokusu parçaları elde etmek için, 10 santimetre lik bir kültür plakas

measuring-real-time-drug-response-in-organotypic-tumor-tissue-slices

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kaynak: Ciraku, L., et. al. Meme kanseri beyin metastatik tümör büyümesini incelemek ve hedeflemek için bir ex vivo beyin dilimi modeli. J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, organotipik bir fare beyin diliminde lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Luciferin ortama eklenir ve plaka, in vivo görüntüleme sisteminin haznesinin içine yerleştirilir. Görüntü yakalama parametreleri ayarlanır ve tümörün şekli ve boyutu tanımlanır. Tümör hücreleri tarafından yayılan...

Organotipik Bir Fare Beyin Diliminde Tümör Büyümesini Değerlendirmek için Biyolüminesans Görüntüleme

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

İnsan beyni tümörlerinin birçok türü, beynin belirli bölgelerine lokalizedir ve kültürde büyümesi zordur. Bu protokol, tümör mikroçevresinin rolünü ele alır ve organotipik bir fare beyin diliminde büyüyen floresan primer beyin tümörü hücrelerini analiz ederek yeni ilaç tedavilerini araştırır.

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Biz üretimi, yetiştirme ve fare akciğer tümörleri türetilmiş organotypic dilimleri sistematik analizi için bir yöntem sağlar. Biz de dilim kalınlığı için en iyi duruma getirme ve tümör dilimleri tedavisi için ilaç konsantrasyonları seçin anlatan.

Kuruluş ve tümör dilim analizini Explants tanı testleri için bir önkoşul olarak

Bu protokol, organotipik dilim kültürlerinin (OTSC'ler) hazırlanmasını tanımlar. Bu teknik, sağlam çok hücreli dokunun ex vivo olarak yetiştirilmesini kolaylaştırır. OTSC'ler, çok hücreli bir ortamda ilaçlara karşı ilgili yanıtlarını test etmek için hemen kullanılabilir.

Primer Pankreas Kanseri ve Metastazında Tümör Mikroçevresinin Preklinik Modelleri Olarak Organotipik Dilim Kültürleri

Bu protokol, orta ila yüksek verimli organoid ilaç taramaları için yarı otomatik bir yöntemi ve intratümör heterojenitesini yakalamak için multiparametrik, tek organoid ilaç yanıtlarını ölçmek ve görselleştirmek için mikroskoptan bağımsız, otomatik görüntü analiz yazılımını açıklamaktadır.

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.

Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Keşfedin, organotipik tümör doku dilimlerinde gerçek zamanlı ilaç yanıtı ölçümü için orta verimli tarama yöntemini. Bu teknik, hasta kaynaklı tümör örneklerinde preklinik ilaç geliştirmeyi hızlandırır.

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet