Name: Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Keşfedin lantipeptid sentazlarının konformasyonel dinamiklerini HDX-MS ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, doğal koşullara yakın ortamda protein dinamiklerini etiketleme gerektirmeden inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Kanada İnovasyon Vakfı ve McGill Üniversitesi başlangıç fonları tarafından desteklendi.

1. Kısırlaştırılmış reaktiflerin ve enzim stok çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li> </li><li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61053/61053equ01.jpg"> </li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li> </li><li> <ol><li><li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li><li> <ol><li><li><li></li><li><li> </li><li> </li><li> <ol><li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li><li></li><li></li><li> </li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li> </li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li> </li><li><ol><li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li> </li><li></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li><li><li><li><ol><li></li><li></li><li> </li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li>
<li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li>
<li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamism+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).</li>
<li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry%3A+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522(1993).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS%2C+CXMS%2C+and+disulfide+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+performing%2C+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+%28HDX-MS%29+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883(2015).</li>
<li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy%3A+application+to+interleukin+1.beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li>
<li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li>
<li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li>
<li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li>
<li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li>
<li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li>
<li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li>
<li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li>
<li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).</li>
<li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).</li>
<li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li>
<li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteros%3A+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).</li>
<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Bu protokolde sunulan HDX-MS iş akışı, proteinlerdeki yapısal dinamik elemanların mekansal dağılımını haritalamak ve bu dinamiklerin pertürbasyona (ligand bağlama, enzim mutagenezi vb.) yanıt olarak nasıl değiştiğini araştırmak için son derece sağlam bir platform sağlar. HDX-MS, konformasyonsal dinamikleri araştırmak için yaygın olarak kullanılan diğer yapısal biyoloji yaklaşımlarına göre birkaç farklı avantaja sahiptir. En önemlisi, sadece az miktarda proteine ihtiyaç vardır. Burada açıklanan iş akışını kullanarak, 1 μM...

Proteinler, femtosaniye ölçeğindeki bağ titreşiminden, birçok saniye içinde meydana gelebilecek tüm protein etki alanlarının yeniden düzenlenmesine kadar zaman ölçeklerinde farklı konformasyonları örnekleyen yapısal olarak dinamik moleküllerdir1. Bu konformasyonsal dalgalanmalar genellikle enzim/protein fonksiyonunun kritik yönleridir. Örneğin, ligand bağlamanın neden olduğu konformasyonel değişiklikler, kataliz için gerekli aktif saha kalıntılarını düzenleyerek, sıralı kinetik mekanizmalarda substrat bağlama bölgelerini tanımlayarak, reaktif ara maddeleri ortamdan koruyarak veya allosterik ağlar aracılığıyla enzim fonksiyonunu modüle ederek enzim fonksiyonunu modüle etmek için genellikle kritik öneme sahiptir. Son çalışmalar ayrıca, konformasyonel dinamiklerin evrim boyunca korunabileceğini ve korunmuş moleküler hareketlere pertürbasyonların substrat özgüllüğündeki değişiklikler ve yeni enzim fonksiyonlarının ortaya çıkması ile ilişkili olabileceğini göstermiştir2,3.
Son yıllarda, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS), protein konformasyonel manzaraların ligand bağlama veya mutajensis 4 ,5,6,7gibi pertürbasyonlara nasıl tepki verdiğini araştırmak için güçlü bir teknik olarak hızla ortaya çıkmıştır. Tipik bir HDX-MS deneyinde (Şekil 1), D2O'da hazırlanan tampona bir ilgi proteini yerleştirilir, bu da çözücü değiştirilebilir protonların döter ile değiştirilmesini tetikler. Peptit bağlarının amid moiety'nin değişim oranı, pH'a, yerel amino asit dizisine ve amide8'inyerel yapısal ortamına bağlıdır. Hidrojen yapıştırma etkileşimleri yapan amidler (α-helices ve β yapraklarında bulunanlar gibi) proteinin toplu çözücüye maruz kalan yapılandırılmamış bölgelerindeki ortalardan daha yavaş değiş tokuş eder. Bu nedenle, döteryum alımının kapsamı enzimin yapısının bir yansımasıdır. Konformasyonsal olarak dinamik olan veya ligand bağlanması üzerine yapısal geçişler geçiren enzimlerin ölçülebilir bir HDX yanıtı vermesinin beklenebilir olması beklenir.
Yapılandırılmış bir amidin yavaş döviz kurunun mekanistik temeli Şekil 2 5,8,9'da gösterilmiştir. HDX'e tabi tutulabilmesi için, yapılandırılmış bölgenin öncelikle, hdx değişimini belirli bir asit / baz kimyasal mekanizma ile katalİze eden çözücü moleküllerinin değiştirilebilir amide erişebilmesi için geçici olarak açılmış bir uygunluğu örneklemesi gerekir. Sonuçta, kimyasal döviz kurunun(kkimyası)göreli büyüklükleri ve katlama ve yeniden katlama oranları (kaçık ve kkapanış) deneyde ölçülen HDX oranını belirler5,8. Bu basit kinetik modelden, döteryum alımının kapsamının alttaki konformasyonsal dinamikleri yansıtacağı açıktır (kaçık ve kkapanışıile tanımlandığı gibi). Çoğu HDX-MS deneyi, değişim reaksiyonunu takiben, ilgi proteininin peptitlere sindirildiği ve her peptit tarafından döteryum alımının kütle7'debir artış olarak ölçüldüğü aşağıdan yukarıya bir iş akışında gerçekleştirilir. Bu şekilde, HDX-MS, pertürbasyonların enzim konformasyonel dinamiklerin peptitlerin yerel mekansal ölçeğinde eşlenmesine izin verir ve araştırmacının pertürbasyonun ilgi enziminin farklı bölgelerindeki dinamikleri nasıl değiştirdiğini değerlendirmesini sağlar.
HDX-MS yaklaşımının protein yapısal dinamiklerini aydınlatıcı avantajları çoktur. İlk olarak, yöntem küçük miktarlarda yerli proteinle veya kuaterner yapıya sahip sistemlerde protein kompleksleri üzerindegerçekleştirilebilir 10. Aşağıdan yukarıya HDX-MS iş akışı, ilgi protein dizisini kapsayan yeterli sayıda güvenle tanımlanmış peptit sağladığı sürece, testte kullanılan enzim preparatının yüksek orandasaflaştırılması11,12, için bile gerekli değildir. Ayrıca, HDX-MS, tek moleküllü floresan çalışmalarında kullanılacağı gibi bölgeye özgü protein etiketlemesine gerek kalmadan yakın yerel koşullar altında konformasyonsal dinamikler hakkında bilgi sağlayabilir13ve araştırılabilen protein veya protein kompleksinin boyut sınırı yoktur (nükleer manyetik rezonans [NMR] spektroskopisi gibi yaklaşımları zorlaştırır)7,14. Son olarak, X-ışını kristalografisi 15 , 16,17,18ile incelenmesi zor olan özünde düzensiz proteinleri incelemek için zaman çözümlenmiş HDX-MS yöntemleri kullanılabilir. HDX-MS'in ana sınırlaması, verilerin düşük yapısal çözünürlükte olmasıdır. HDX-MS verileri, konformasyonsal dinamiklerin nerede değiştiğine işaret etmek ve birleştirilmiş konformasyon değişikliklerini ortaya çıkarmak için yararlıdır, ancak genellikle gözlemlenen değişimi yönlendiren hassas moleküler mekanizma hakkında çok fazla bilgi sağlamaz. Elektron yakalama ayrışma yöntemlerinin protein HDX-MS verileriyle kombinasyonundaki son gelişmeler, değişim alanlarının tek amino asit kalıntıları19ile eşlenmesi için umut vaat etmektedir, ancak HDX-MS verileri tarafından iletilen yapısal modellere netlik sağlamak için biyokimyasal ve yapısal çalışmaların takip edilmesi hala sıklıkla gereklidir.
Aşağıda, hdx-ms test geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol20. Aşağıda sunulan numune hazırlama protokolleri genellikle sulu tamponlarda iyi çözünürlük gösteren herhangi bir protein için geçerli olmalıdır. Proteinler için deterjan veya fosfolipidler21, 22, 23, 24varlığında test edilmesi gerekenden daha özel numune hazırlama yöntemleri ve HDX-MS iş akışları mevcuttur. HDX-MS veri toplama için enstrümantal ayarlar, sıvı kromatografi sistemine bağlı olarak yüksek çözünürlüklü dörtlü uçuş süresi kütle spektrometresi için açıklanmıştır. Benzer karmaşıklık ve çözünürlük verileri, piyasada bulunan bir dizi sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) sisteminden herhangi birinde toplanabilir. Ticari olarak kullanılabilen bir yazılım paketi kullanılarak veri işlemenin önemli yönleri de sağlanır. Ayrıca, daha geniş HDX-MS topluluğu12tarafından yapılan önerilerle tutarlı veri toplama ve analiz kılavuzları sunuyoruz. Açıklanan protokol, bir antimikrobiyal peptit doğal ürününün multistep olgunlaşmasını katalize eden bir lantiipeptid sentezi olan HalM2'nin dinamik yapısal özelliklerini incelemek için kullanılır20. HDX-MS'in alt tabaka bağlama sitelerini ve önceki karakterizasyondan kaçan allosterik özellikleri ortaya çıkarmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Protein HDX-MS ile ilgili diğer birkaç protokol son yıllarda yayınlanmıştır25,26. Mevcut çalışma ile birlikte, bu önceki katkılar okuyucuya deneysel tasarımda biraz esneklik sağlamalıdır.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>[glu-1] -fibrinopeptid B (Glu-Fib)</td> <td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k santrifüj filtrasyon cihazı (Millipore)</td> <td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>formik asit</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidin-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>BioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>potasyum fosfat</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Hydrochloride</td><td>TRC Canada</td><td>T012500</td><td>peptidi istek üzerine sentezlendi</td></tr><tr><td>Malzeme Adı/ Ekipman</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td> Yorumlar / strong<></td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy MC Lau, et al</td><td>sürüm 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>sürüm 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>sürüm 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>sürüm 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>sürüm 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Malzemenin / Ekipmanın Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/Açıklama</td></tr><tr><td>Alet ve ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analitik Kolon</td><td>Sular</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Ön Sütun</td><td>Suları</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Sınıfı HDX Sistem</td><td>Suları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Yöneticisi</td><td>Sular</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikrouçlu pH elektrodu</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH sütunu veya Pepsin solumn</td><td>Sular</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Sular Synapt G2-Si</td><td>Suları</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

peptit biyosintetik enzimleri araştırmak için hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (hdx-ms) platformu

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS), enzim konformasyon değişikliklerinin ve enzim-substrat etkileşimlerinin biyofiziksel karakterizasyonu için güçlü bir yöntemdir. HDX-MS, birçok faydası arasında sadece az miktarda malzeme tüketir, enzim/substrat etiketlemesine gerek kalmadan yakın yerel koşullar altında gerçekleştirilebilir ve büyük enzimler ve multiprotein kompleksleri için bile enzim konformasyonsal dinamikleri−hakkında mekansal olarak çözülmüş bilgiler sağlayabilir. Yöntem, ilgi çekici enzimin D2O'da hazırlanan tampona seyreltilmesiyle başlatılır. Bu, peptit bağı amidlerinde (N-H) protiyumun döteryum (N-D) ile değişimini tetikler. İstenilen değişim zaman noktalarında reaksiyon aliquotları söndürülür, enzim peptitlere proteoliz edilir, peptitler ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) ile ayrılır ve her peptitin kütleslerindeki değişim (hidrojenin döteryum ile değişimi nedeniyle) MS tarafından kaydedilir. Her peptit tarafından döteryum alımı miktarı, bu peptitin yerel hidrojen yapıştırma ortamına bağlıdır. Enzim değişim döteryumunun çok dinamik bölgelerinde çok hızlı bir şekilde bulunan peptitler bulunurken, iyi sıralanmış bölgelerden elde edilen peptitler çok daha yavaş bir değişime uğrar. Bu şekilde, HDX oranı lokal enzim konformasyon dinamiklerini rapor eder. Farklı ligandların varlığında döteryum alma seviyelerine pertürbasyonlar daha sonra ligand bağlama alanlarını haritalamak, allosterik ağları tanımlamak ve enzim fonksiyonundaki konformasyonel dinamiklerin rolünü anlamak için kullanılabilir. Burada, lanteptid adı verilen bir tür peptit doğal ürünün biyosentezini daha iyi anlamak için HDX-MS'i nasıl kullandığımızı gösteriyoruz. Lanthipeptides, geleneksel yapısal biyoloji yaklaşımlarıyla incelenmesi zor olan büyük, çok işlevli, konformasyonel dinamik enzimler tarafından çeviri sonrası değiştirilen genetik olarak kodlanmış peptitlerdir. HDX-MS, bu tür enzimlerin mekanistik özelliklerini araştırmak için ideal ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

Proteolitik sindirimin kalitesini ve her örnek enjeksiyon kümesi için iş akışının tekrarlanabilirliğini değerlendirmek gerekir. Bu nedenle, HDX-MS tahlillerini yapmadan önce, ilgi çekici proteinin proteolizi, ters faz sıvı kromatografisi ve gaz fazı iyon hareketliliği kullanılarak peptitlerin ayrılması ve MS kullanılarak peptitlerin tespiti için etkili koşulların oluşturulması esastır. Bu amaçla öncelikle ilgi çekici proteine yönelik referans örnekleri (döteryum yokluğunda toplanır) araştırılmalıdır (bölüm 3). <strong cl...

Lanthipeptide sentezleri peptit doğal ürünlerin biyosentezi sırasında katalizör multistep reaksiyonları. Burada, lanteptid sentezlerinin konformasyonel dinamiklerini ve peptit doğal ürün biyosentezinde yer alan diğer benzer enzimleri incelemek için bunların kullanılabileceği sürekli, aşağıdan yukarıya, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) iş akışını açıklıyoruz.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Bu protokol, protein konformasyonel dinamikleri hakkında özel olarak çözülmüş bilgiler sağlayabilir. Bu, ilgilenilen proteinde işlevsel olarak önemli bölgelerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu teknik, doğal olmayan koşullar altında protein konformasyonel dinamiğini araştırır.Her reaksiyon için nanomolar miktarda malzeme kullanarak protein etiketlemesine gerek kalmadan. İlgilenilen protein için 500 mikrolitrelik tüplerde üç kopya halinde döteryumsuz referans numuneleri hazırlayarak başlayın. 2.5'lik bir pH metre okuması elde etmek için numuneleri tüp başına uygun hacimde söndürme tamponu ile söndürün.Numuneleri, analizlerine kadar eksi 80 santigrat derecede saklamak için sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Ardından, standart protokollere göre aşağıdan yukarıya sıvı kromatografisi kütle spektrometresi iş akışı kullanarak protiated enzim referans örneklerini analiz edin. Ham kütle spektrometresi verilerini uygun Proteomik Yazılım Programında analiz etmek.İlgilenilen proteinin amino asit dizisini içe aktarmak için Kitaplıklar ve Protein Dizisi Veri Bankaları'na gidin. İlgilenilen protein dizisi için bir ad girin ve protein dizisini FASTA biçiminde içe aktarın. Kitaplık menüsü altında işleme parametrelerini tanımlamak için, veri toplama türü olarak Electrospray MSE'yi seçin.Şarj 2 için Kütleyi Kilitle alanına, iki artı glukan bir lif içermeyen peptit B iyonu için ana şarj oranı için 785.8426 girin ve Bitir'e tıklayın. İş akışı parametrelerini tanımlamak için, arama türü olarak Electrospray MSE'yi seçin. İş Akışı ve Veritabanı arama sorgusu başlığı altında, Veri Bankası alanında oluşturulan veritabanı proteinini seçin ve birincil özet reaktifini nonspecific (belirsiz) olarak değiştirin.Sabit değiştirici reaktif alanını temizlemek için, çıktı dizinini belirtmek C.To Karbamidometil'e tıklarken kontrol düğmesini basılı tutun, Seçenekler, Otomasyon Kurulumu ve E'yi Tanımla'yı seçin. Ve istediğiniz dizini belirtin. Referans verilen numune verilerini işlemek için, yeni bir plaka oluşturmak üzere mikrotitre plakasına sağ tıklayın.Başvurulan her örnek için bir kuyuyu vurgulamak için bir kutuya sol tıklayın ve diğer üç kuyuya sürükleyin. Ardından, sağ tıklayın ve Ham Veri Ekle'yi seçin. Pencerede, başvurulan üç dosyayı içeren dizine gidin ve üç dosyayı da aynı anda seçin.İleri'ye tıklayın ve tanımlanan işleme parametrelerini seçin. Tekrar İleri'ye tıklayın ve tanımlanan iş akışı parametrelerini seçin. Ardından Son'a tıklayın.Ham veriler, işleme parametreleri ve iş akışı parametreleri plakadaki her bir kuyuya atandıktan sonra, kuyular maviye dönecektir. Kuyuları seçin, sağ tıklayın ve En Son Ham Verileri İşle'yi seçin. Verilerin işlenmesini izlemek için pencerenin sağ alt köşesine tıklayın.Çalıştırılacak bir iş görünmediğinde, işlem tamamlanmıştır ve mikrotitre plakasındaki kuyucuklar yeşile dönecektir. Kuyucuklara sağ tıklayın ve İş Akışı Sonuçlarını Görüntüle'yi seçin. Başvurulan her veri dosyası için ayrı bir pencere açılacaktır.Referans verilen numune verilerindeki kütle spektrometresi sinyallerinin çoğunun, ilgilenilen proteinin in silico sindiriminden tahmin edilen peptitlerle başarılı bir şekilde eşleştirildiğinden emin olmak için verileri inceleyin. Eşleşen peptitler, çıktı spektrumunda mavi görünecektir. Tamam filtresine çift tıklayın ve yüzde kapsama alanının %99'dan büyük olduğunu kontrol edinEk eşikleme için Proteomic Yazılım çıktısını Hidrojen Döteryum Değişim İşleme Yazılımına aktarın.Ve tıklayın Veri ve PLGS sonuçlarını içe aktarın. Ekle simgesine tıklayın ve işlenen veri dosyalarını seçmek için uygun dizine gidin. İleri'ye tıklayın ve minimum ardışık iyonları ikiden büyük veya ikiye eşit olarak ayarlayın.Milyonda beş parçaya kadar kütle hatası. Ve dosya eşiğini üçe getirin, ardından Son'u tıklayın. Hidrojen döteryum değişim reaksiyonlarını gerçekleştirmek için, 500 mikrolitrelik tüplerde aliquot söndürme tamponu.Ve tüm söndürme tamponunu her tüpün dibine aktarmak için kısaca santrifüjleyin. Söndürülmüş çözelti içeren tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, tüm döteryumlu reaksiyon bileşenlerini ayrı bir 1.5 mililitrelik tüpte önceden karıştırın.Daha sonra reaksiyon karışımını 10 dakikalık bir inkübasyon için 25 santigrat derece sıcaklık kontrollü bir su banyosuna aktarın. Değişim reaksiyonunu başlatmak için döteryumlu reaksiyon bileşenlerine enzim ekleyin. Reaksiyon içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.Uygun deneysel değişim zaman noktalarında, her hidrojen döteryum değişim reaksiyonundan 50 mikrolitre alikot çıkarın. Ve reaksiyonları, ayrı ayrı 500 mikrolitrelik tüplerde bir adet buz gibi soğuk söndürme tamponu ile hızlı ve eşit bir şekilde karıştırın. Ardından, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma için tüpleri hemen kapatın.Numuneleri analize hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dondurulmuş numuneler çözüldükten sonra, döteryumsuz referans numuneler için geliştirilen aynı aşağıdan yukarıya sıvı kromatografisi kütle spesifikasyonu iş akışını kullanarak döteryumlu enzim referans numunelerini analiz edin. Döteryumlu numuneler için LCMS verilerini topladıktan sonra, verileri veri işleme için daha önce oluşturulan hidrojen döteryum değişim projesine aktarın.Ve analizle ilgili biyokimyasal durumları ve döteryum maruz kalma sürelerini tanımlamak için Yeni Durum ve Yeni Maruz Kalma'ya tıklayın. Analiz edilecek hidrojen döteryum değişim veri dosyalarını seçmek için Yeni Ham'a tıklayın. Ve içe aktarılan her ham veri dosyasına uygun değişim sürelerini ve biyokimyasal durumu atayın.Verilerin analizi ve görselleştirilmesi için, Peptit listesindeki ilk peptidi seçin ve Görünümler menüsünden yığılmış spektral grafiği açın. Verilerde uygun izotop dağılımının bulunduğundan emin olmak için çubukları gerektiği gibi atamak ve atamasını kaldırmak için fareyi tıklayın. Ve her bir izotop zirvesi atanmıştır.Her şarj durumu için çubuk atamalarını kontrol etmek için, yığılmış spektral çizim penceresinin üst kısmındaki şarj durumunu değiştirin. Görünümler menüsünde peptit döteryum alım değerlerinin standart sapmasını kontrol etmek için kapsam haritasını seçin. Bu, ilgilenilen proteinin amino asit dizisi boyunca eşlenen Peptit listesindeki her bir peptidi görüntüler.Peptitleri nispi standart sapmaya göre renklendirin ve yüksek nispi standart sapmaya sahip aykırı peptitler için haritada görsel olarak arama yapın. Yığılmış spektral grafikleri ve veri görüntüleyici penceresini hedef peptitle doldurmak için kapsam haritasındaki aykırı peptitlere tıklayın. Kapsam haritasında ilgilenilen farkı görüntüleyin ve fark verilerini bir CSV dosyasına aktarmak için haritaya sağ tıklayın.Farkı ve durum verilerini ve ilgilenilen proteinin PDB dosyasını Deuteros'a aktarın. Ve %99 güven aralığını seçin ve Toplamı Etkinleştir ve verileri işleyin. Ardından, pi mol altında, önemli değişim farkı bölgelerini PyMOL yazılımında ilgilenilen proteinin PDB yapısına eşlemek için bir PyMOL komut dosyası oluşturmak için Dışa Aktarma, Alma ve Dışa Aktarma'yı seçin.Hal-M2 lambda peptit sentetazın üç referans numunesi için bu temsili toplam iyon kromatogramları, kütle spektral taramasına dahil edilen kütle-yük oranı değerlerinin tümünde tüm iyon sayımlarının toplamındaki zamana bağlı değişiklikleri gösterir. Toplam iyon kromatogram profilinin şekli ve yoğunluğu benzer olmalıdır. Hal-M2'nin proteolitik sindiriminin tekrarlanabilir olduğunu gösterir.Ve her üç referans örneğinde de benzer verimliliğe sahiptir. Belirli bir zaman aralığındaki kütle spektrumları da benzer olmalıdır. Her numunede benzer peptitlerin bulunduğuna ve C18 kolonundan benzer zamanlarda ima edildiğine dair güven sağlamak.Döteryum değiş tokuş edilen örneklerdeki peptitlerin çoğu, izotopik dağılımlarda daha yüksek kütle-yük oranı değerlerine doğru belirgin kaymalar göstermelidir. Örneğin, bu veriler, döteryum etiketinin önemli bir kısmının asit söndürme, pepsin sindirimi ve sıvı kromatografi kütle spektrometresi veri toplama süreci boyunca korunduğunu göstermektedir. Enzimin biyokimyasal özelliklerinin gösterildiği gibi karakterizasyonundan sonra, bunlar gibi temsili hidrojen döteryum değişim kütle spektrometresi sonuçları oluşturulabilir.Hal-A2 öncü peptidinin Hal-M2 AMP, PMP kompleksine bağlanmasını göstermek için. Hidrojen döteryum değişim reaksiyonları tutarlı bir şekilde hazırlanmalı ve söndürülmelidir. Ve tespit edilen çok sayıda peptit için döteryum değişim değerlerini belirlerken metodik olmalısınız.Hidrojen döteryum değişim kütle spektrometresi, peptit düzeyinde bilgi ve dinamik protein konformasyonel değişiklikleri sağlar. Herhangi bir hidrojen döteryum değişiminin işlevsel alaka düzeyi, Meter Genesis için doğrulanmalıdır. Ve ortogonal aktivite deneyleri.

a-hydrogen-deuterium-exchange-mass-spectrometry-hdx-ms-platform-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

MALDI-TOF kütle spektrometresi başarıyla protein kinaz Pak2 aktivasyon amid hidrojen / döteryum değişimini izlemek için kullanılmıştır.

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Protein yapı ve dinamikleri protein yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için anahtardır. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte hidrojen alış veriş proteinlerin konformasyonel dinamiklerini incelemek ve temas arayüzler ve allosterik etkileri de dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimleri, karakterize için çok yönlü bir yöntemdir.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Burada, katı tozlardaki proteinler için katı hal amid hidrojen/döteryum değişim kütle spektrometrisi (ssHDX-MS) ve katı hal fotolitik etiketleme kütle spektrometrisi (ssPL-MS) için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Yöntemler, formülasyon tasarımında yararlı olabilecek amorf katı haldeki protein konformasyonu ve etkileşimleri hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlar.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Burada, yukarıdan aşağıya kütle spektrometrisi ile birlikte kılcal elektroforez bazlı hidrojen / döteryum değişimi (HDX) yaklaşımı için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, eşzamanlı diferansiyel HDX ve elektroforetik ayırma gerçekleştirerek, farklı durumlardaki proteinler ve farklı proteoformlar da dahil olmak üzere farklı protein türleri arasındaki yüksek dereceli yapılardaki farkı karakterize eder.

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Monomerik alfa-sinükleinin yapısal topluluğu fizyolojik fonksiyonunu ve fizikokimyasal özelliklerini etkiler. Mevcut protokol, fizyolojik koşullar altında bu içsel olarak düzensiz proteinin monomeri hakkında konformasyonel bilgileri belirlemek için milisaniye hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisinin ve müteakip veri analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Keşfedin lantipeptid sentazlarının konformasyonel dinamiklerini HDX-MS ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, doğal koşullara yakın ortamda protein dinamiklerini etiketleme gerektirmeden inceler.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Daha fazla video keşfet