Name: Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Keşfedin, RNA-Seq ve biyoinformatik kullanarak HT29 türetilmiş kolorektal kanser kök benzeri tümörkürelerde aşırı ifade edilen sürücü genleri. Bu yöntem, kanser köklülüğünün moleküler mekanizmalarını anlamak için hedefli tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Radyasyon Biyoloji çekirdek laboratuvarı Radyolojik Araştırma Enstitüsü, Chang Gung Memorial Hastanesi, teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) ve Mackay Memorial Hastanesi (MMH-CT-10605 ve MMH-106-61) tarafından desteklenmiştir. Finansman kuruluşlarının çalışmanın ve verilerin toplanması, analiz ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında herhangi bir etkisi yoktu.

1. Hücre kültürü ve tümörlü küre oluşumu
<ol><li>Kültür HT29 hücreleri 10 cm çanak Dulbecco modifiye kartal orta içeren (DMEM) ile 10% fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik (P / S).</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2 ve %95 nem oranıyla aseptik koşullarda %80 biraraya gelene kadar büyütün.</li>
	<li>37 °C'de 5 dakika boyunca %0,25 tripsin ile 1 mL'lik HT29 hücrelerini tripsini nötralize etmek ve dolayısıyla %10 FBS ve %1 P/S ile 2 mL DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak HT29 hücrelerini say.</li>
	<li>%1 P/S ile 2 mL serumsuz DMEM içeren ve %0,2 B27 ile desteklenen düşük bağlı 6 kuyu plakasına 2.000 hücre/kuyu ekleyin, Epidermal büyüme faktörünün 20 ng/mL'si (EGF), fibroblast büyüme faktörünün 20 ng/mL'si (bFGF), 20 ng/mL hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve 20 ng/mL ininterlökin 6 (IL6).</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ve %95 nem ile aseptik koşullarda büyütün.</li>
	<li>Tümör küreleri en az 7 gün çapı >100 μm ölçene kadar her 2 günde bir 0,5 mL kanser kök hücre lisi ekleyin.</li>
	<li>Dijital hücre görüntüleme sistemi ile ters bir mikroskop kullanarak tümörküre çapını gözlemleyin ve ölçün.</li>
	<li>Tümör küreleri >100 μm çapa ulaştığında, 37 °C'de 5 dk için %0.25 tripsin ile tümör kürelerini deneyin ve büyüme ortamının hacmini 2 katlayarak tripsini nötralize edin. Hemositometre kullanarak hücreleri say.</li>
	<li>10 dakika için 1.200 rpm santrifüj ve supernatant kaldırın.</li>
	<li>5 x 104 hücreleri 2 μL anti-LGR5-PE ve 2 μL anti-CD133-PE 100 μL dmem ayrı ayrı 30 dakika oda sıcaklığında, 200 rpm sallayarak. NOT: CD133 ht29 hücrelerinde yüksek ifade edilen genel bir kanser kök hücre biyomarker.</li>
	<li>900 μL PBS ekleyin ve akış sitometrisini kullanarak LGR5 ve CD133 ifadesini analiz edin. FL2-H kanalında floresan değişimi gen ekspresyonunu gösterir.</li>
</ol>2. RNA yalıtımı
NOT: Üreticinin talimatları doğrultusunda RNA yalıtımı için hızlı bir sütuniçeren ticari bir kit (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
<ol><li>Hasat edilen hücrelere (2 x 105 hücre) 50 μL PBS ekleyin ve pipetleme ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>2 μL beta-mercaptoetanol (β-ME) içeren 200 μL likte tampon ekleyin. Girdap hızlı ve 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Çözeltiyi 10 dk için 16.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>1 dk için 14.000 x g santrifüj ile çözücü kaldırmak için ekli sütun kullanın.</li>
	<li>1 dk boyunca 14.000 x g'de santrifüj ile rna olmayanları tamamen temizlemek için 1 ve 2'yi yıkama solüsyonu kullanarak yıkayın.</li>
	<li>Santrifüj tekrar 14.000 x g için 2 dakika artık etanol kaldırmak için.</li>
	<li>50 μL distile su ekleyin, 14.000 x g'de 1 dk santrifüj alın ve çözeltiyi toplayın.</li>
	<li>RNA konsantrasyonunu OD260 kullanarak spektrofotometre ile ölçün. RNA konsantrasyonu (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) ve OD260/OD280 > 2. RNA örneklerinde RNA bütünlük numarası (RIN) > 7 olmalıdır.</li>
</ol>3. RNAseq profilleme ve biyoinformatik analizi
NOT: HT29 türetilmiş tümörkürelerdeki diferansiyel genleri ebeveyn HT29 hücrelerine göre araştırmak için rnaseq analizi ticari olarak (Bkz. Malzeme Tablosu)yapıldı.
<ol><li>Kütüphane inşaatı, kütüphane kalite kontrolü ve DNA dizilemesi gibi RNAseq adımları için ticari hizmetler kullanın.</li>
	<li>Veri raporu, okuma sayıları, log2 kat değişikliği ve p değeri gibi önemli bilgiler içermelidir. Diferansiyel genleri aşağıdaki parametrelere göre seçin: HT29 tümörküre grubunda okuma sayıları >100 ile 1 log2 kat değişim, HT29 ebeveyn grubunda okuma sayısı >100 ile genler >100 ile genler değişim. Bu durumda, p değeri < 0.05 kabul edilebilir kabul edildi ve veriler kullanıldı (Tablo 1). NOT: Burada, belirli bir genin incelenmesine devam etmek ve ekspresyonunu doğrulamak için eşik olarak bir gen sayısı >100 kullanılmıştır.</li>
	<li>Bir ısı haritası göstermek ve aşırı ifade edilmiş genleri tanımlamak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın (bkz.</li>
	<li>X ile Volkan Arsa çizmek için R yazılımı kullanın: log2 kat değiştirmek; y: -log10 (p değeri) diferansiyel genleri göstermek için.<ol>
<li>R kitaplığını yükleme install.packages(library(calibrate))</li>
		<li>Aşağıdaki programile RStudio'daki verileri okuyun: res <-read.csv("/Kullanıcılar/xxx.csv", başlık=T) kafa(res) ile(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0")) ile (subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red")) ile (subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="mavi")) ile (subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444")) abline(h=1.3, lty=2) abline(v=1, lty=2) abline(v=(-1), lty=2)</li>
		<li>Volkan Arsa elde etmek için çalıştırmak yürütmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Sürücü gen seçimi
<ol><li>NetworkAnalyst'de Tek gen Girişi'ni seçin.</li>
	<li>Seçilen aşırı ifade edilen genleri Tablo 1'den organizma ve Kimlik tipi Resmi Gen Sembolüolarak belirtilen "insan" ile kopyalayıp yapıştırın. NOT: Alternatif olarak, kopyalama kullanabilirsiniz ve yapıştırın ensembl Gen Kimliği'ni kullanın.</li>
	<li>Verileri Yükle'ye tıklayarak ekleyin ve genetik ÜFE'yi takiben protein-protein etkileşimi (ÜFE) kullanarak analiz edin.</li>
	<li>Dize etkileşimom veritabanını 900'lük bir güven puanı kesintisi ile kullanarak tohum genlerinin yüklenen genleri çapraz bağlattığını gösterin. Daha bireysel genlerle ilişki kuranan tohum genleri, HT29 kaynaklı tümör kürelerinin oluşumunu sürdürmede rol oynayan sürücü genleri olarak seçilmiştir. NOT: Kullanım için üç etkileşimli veri kümesi vardır: IMEx, STRING ve Rolland. STRING daha yüksek güven deneysel kanıt içerir. Yüklenen gen numaralarının daha düşük olmasıyla, IMEx etkileşimağlarındaki sürücü genlerini tahmin etmek ve almak için seçilebilir.</li>
	<li>Haritalama genel bakışta Devam et'i seçin.</li>
	<li>Arka Planda Beyaz'ı ve Düzen tonundaki Atlası Zor'u seçin.</li>
	<li>Regülasyon gen grubunu analiz etmek için PANTHER BP'yi seçin. NOT: Bu çalışmada HT29 türetilmiş tümörkürelerde Anti-apoptozdan HSPA5 sorumlu olduğunu göstermektedir(Şekil 3A). Belirli fonksiyonel alanı daraltmak için, KEGG, GO veya PANTHER sınıflandırması alternatif olarak belirli sürücü genlerini seçmek için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+colorectal+cancer%3A+incidence%2C+mortality%2C+survival%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Przegl%C4%85d+Gastroenterologiczny%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li>
<li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+colorectal+cancer+in+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Intestinal+Research%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia.</a> Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+expression+of+basic+transcription+factor+3+predicts+poor+survival+of+colorectal+cancer+patients%3A+possible+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved.</a> Cell Death & Disease. 10 (7), 509(2019).</li>
<li>Slattery, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li>
<li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERBB+receptors%3A+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li>
<li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERBB+network%3A+at+last%2C+cancer+therapy+meets+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149(2017).</li>
<li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41(2017).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer%2C+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li>
<li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma%3A+Clinicopathological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cell-targeted+treatment%3A+elimination+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li>
<li>Dallas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).</li>
<li>Chang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+induces+G9a+to+exacerbate+HER3+expression+for+the+survival+of+epidermal+growth+factor+receptor-tyrosine+kinase+inhibitors+in+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers.</a> BMC Cancer. 19 (1), 959(2019).</li>
<li>Catalano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+stem+cells+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer stem cells and cell death.</a> Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).</li>
<li>Piggott, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+inhibitor+c-FLIP+selectively+eliminates+breast+cancer+stem+cell+activity+in+response+to+the+anti-cancer+agent%2C+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL.</a> Breast Cancer Research. 13 (5), 88(2011).</li>
<li>Chung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+novel+SHP-1+agonists%2C+SC-43+and+SC-78%2C+are+more+potent+than+regorafenib+in+suppressing+the+in+vitro+stemness+of+human+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells.</a> Cell Death Discovery. 4, 25(2018).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers%3A+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60(2018).</li>
<li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li>
<li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li>
<li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133%2C+CD44%2C+CD24%3A+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621(2014).</li>
<li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+for+statistical%2C+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome Medicine. 7 (1), 80(2015).</li>
<li>Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+as+a+Tool+to+Study+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).</li>
<li>Kanehisa, M., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+Mapper+for+inferring+cellular+functions+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences.</a> Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li>
<li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gene+Ontology+Resource%3A+20+years+and+still+GOing+strong%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+in+2013%3A+modeling+the+evolution+of+gene+function%2C+and+other+gene+attributes%2C+in+the+context+of+phylogenetic+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).</li>
<li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li>
<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetworkAnalyst+3.0%3A+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li>
<li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li>
<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
</ol>

Yazarların konuyla ilgili herhangi bir mali açıklamaları yoktur.

Bu çalışmada, mevcut biyoinformatik ile RNAseq verilerinin analizinde kültürkanser sapbenzeri tümörküreler model olarak kullanılmıştır. Bir hastalık modeli için HT29 türetilmiş tümör küreler kullanıldı. Tümör küreleri tümör tedavilerine karşı ilaç direncine sahip olduğundan, gen ekspresyonundaki farklılıkları araştırarak direnç lerinin ayrıntılı mekanizmalarını araştırmak için kurulan model kullanılabilir. Ayrıca, mevcut biyoinformatik ile RNAseq kullanarak genomik teknoloji potansiyel olarak ilgili genler daha yüksek gü...

Kolorektal kanser (CRC) yüksek yaygınlık ve mortalite dünya çapında 1 ile önde gelen ölüm nedenidir1,2. Gen mutasyonları ve amplifikasyonlar nedeniyle, kanser hücreleri proliferatif kontrol olmadan büyümek, hangi hücre sağkalım katkıda3, anti-apoptosis4, ve kanser sapı5,6,7. Tümör dokusu içinde tümör heterojenitesi tümör hücrelerinin terapötik tedaviler sırasında uyum sağlamasını ve hayatta kalmalarını sağlar8. Kanser kök hücreleri (CSCs), diferansiyel kanser türlerine göre kendini yenileme ve pluripotency daha yüksek bir oranda, esas olarak tümör nüks sorumludur9,10 ve metastatik CRC11. CSCs daha fazla ilaç direnci mevcut12,13,14 ve anti-apoptoz özellikleri15,16, böylece tümör kemoterapi hayatta.
Burada, seçilen CRC kök hücrelerinde köklük için potansiyel mekanizmayı araştırmak amacıyla, Tümör sferoidlerinde farklı olarak ifade edilen genleri taramak için RNAseq uygulandı. Kanser hücreleri, düşük yapışma koşullarında büyüdüğünde ve EGF, bFGF, HGF ve IL6 gibi kültürlü ortama eklenen büyüme faktörleri tarafından uyarıldığında küresel (tümör küreleri olarak da adlandırılır) oluşturabilir. Bu nedenle oksaliplatin ve irinoteon17ile tedavi edildiğinde fosforilasyonLU STAT3 artışı ile kemoterapiye direnen CRC HT29 tümör hücrelerini seçtik. Buna ek olarak, HT29 açıklanan kültür koşullarında kültürlü zaman yüksek kök belirteçleri ifade etti. HT29 türetilmiş CSC modeli lösin açısından zengin tekrar içeren G-protein-çiftreseptör 5 (LGR5)18,CRC kök hücrelerinin belirli bir belirteç19,,20yüksek miktarlarda ifade . Ayrıca, CD133, kanser kök hücreleri için genel bir biyomarker olarak kabul, ayrıca yüksek HT29 hücre hattı21ifade edilir. Bu protokolün amacı, bireysel onkogenlerin araştırılması yerine biyoinformatik veri setlerine dayalı kanser sapı benzeri tümör kürelerinde sürücü genlerinin gruplarını keşfetmektir22. Mevcut biyoinformatik analizleri takip eden RNAseq analizi ile potansiyel moleküler mekanizmaları inceler.
Yeni nesil sıralama, tümör tedavileri23rehberlik için kapsamlı ekran sürücü genleri için kullanılan hesaplamalı yardıma dayalı, yüksek iş gücü, kolayca kullanılabilir ve güvenilir DNA sıralama yöntemidir. Bu teknoloji aynı zamanda gen ekspresyonunu izole edilmiş bir RNA örneğinin ters transkripsiyonundan tespit etmek için de kullanılır24. Ancak RNAseq ile tarama yapılırken, tedavi ile hedeflenene en önemli genler deneysel ve kontrol örnekleri arasında en yüksek ekspresyon farkı olmayabilir. Bu nedenle, bazı biyoinformatik sınıflandırmak ve KEGG25, GO26,27, veya PANTHER28gibi mevcut veri setleri dayalı genlerin sınıflandırılması ve tanımlanması için geliştirilmiştir , Marifet Pathway Analizi dahil (IPA)29 ve NetworkAnalyst30. Bu protokol, seçilen HT29 türetilmiş küresel hücrelerdeki bir grup geni ebeveyn HT29 hücrelerine kıyasla hızlı bir şekilde keşfetmek için RNAseq ve NetworkAnalyst'in entegrasyonunu göstermektedir. Bu yöntemin diğer hastalık modellerine uygulanması da önemli genlerdeki farklılıkların keşfedilmesi için önerilmektedir.
Bireysel gen ekspresyonunun araştırılmasıile karşılaştırıldığında, yüksek iş gücü tekniği tümör hassas tıbbı için potansiyel sürücü genlerini kolayca bulma nın avantajlarını sağlar. KEGG, GO veya PANTHER gibi yararlı veri kümeleri ile, belirli genler hastalık modelleri, sinyal yolları veya belirli fonksiyonlara göre tanımlanabilir ve bu hızlı bir şekilde belirli, önemli genlere odaklanmanızı, zaman ve araştırma maliyetlerinden tasarruf etmenizi sağlar. Benzer bir uygulama önceki çalışmalarda14,18,31kullanılır. Özellikle, tümörlerin farklı türleri hayatta kalma ve çoğalma için ayırt edici genler ve yollar ifade çünkü bir tümör daha karmaşıktır. Bu nedenle, bu protokol farklı koşullar altında farklı tümör tiplerini ayıran genleri toplayabilir. Spesifik gen ekspresyonunun mekanizmasını anlayarak kanserlere karşı etkili stratejiler bulma potansiyeli vardır.

<table><tbody><tr><td>iRiS Dijital Hücre Görüntüleme Sistemi</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>tümör kürelerinin oluşumunu gözlemlemek için Akış</td></tr><tr><td>sitometrisi</td><td>BD biyobilimleri</td><td>FACSCalibur</td> tümör <td>kürelerinde LGR5 ve CD133'ü tespit etmek için</td></tr><tr><td>anti-LGR5-PE</td><td>Biyoefsane</td><td>373803</td><td>LGR5 algılama reaktifi</td></tr><tr><td>anti-CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>CD133 tespiti tümör</td></tr><tr><td>kültürü için</td><td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td> reaktifi</tr><tr>tümör <td>kültürü için</td><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td></tr> tümör <tr><td>kültürü için</td><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td></tr><tr><td>Tümör kültürü için</td><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td></tr><tr><td>PureLink RNA ekstraksiyon kiti</td><td>Invitrogen</td><td>12183025</td><td>izolat RNAseq analizi için toplam RNA</td></tr><tr><td>RNAseq performansı</td><td>Biotools, Tayvan</td><td></td><td>RNAseq analizi ticari olarak Biotools, Ttaiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, McGill Üniversitesi, Montreal, Quebec, Kanada</td><td></td> <td>tarafından yapılmıştırhttp://www.networkanalyst.ca/</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>bir istatistiksel analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

kolorektal ht29 türetilmiş kanser kök benzeri tümörkürelerde sürücü genlerinin keşfi

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Kanser kök hücreleri klinik tedavilere karşı hayati bir rol oynar, tümör nüks katkıda. Tümörigenez ve kanser sapı özelliklerinin başlatılması nda birçok onkogen vardır. Kolorektal kanser kaynaklı tümör kürelerinin oluşumunda gen ekspresyonu belirsiz olduğundan, bir seferde bir gen üzerinde çalışan mekanizmaları keşfetmek zaman alır. Bu çalışma, kolorektal kanser kök benzeri hücrelerin in vitro hayatta kalma dahil sürücü genleri hızlı bir şekilde keşfetmek için bir yöntem göstermektedir. Kolorektal HT29 kanser hücreleri, küresel olarak kültürlendiğinde LGR5'i ifade eden ve bu çalışmada CD133 kök belirteçlerinin artmasına eşlik eden kanser hücreleri seçilmiş ve kullanılmıştır. Sunulan protokol, kolorektal HT29 kaynaklı kök benzeri tümör kürelerinin oluşumunda aşırı ifade edilen sürücü genlerini hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak için mevcut biyoinformatik ile RNAseq'yi gerçekleştirmek için kullanılır. Metodoloji hızlı bir şekilde tarama ve diğer hastalık modellerinde potansiyel sürücü genleri keşfetmek.

Kanser kök hücrelerinde mekanizmayı araştırmak için modeli oluşturmak için, kolorektal HT29 hücreleri B27, EGF, bFGF, HGF ve IL6 içeren düşük ekli plaka içinde kanser kök benzeri tümörküreler in vitro kültür için kullanılmıştır. Tümör küreleri &gt;100 μm çapında 7 gün içinde oluşmuştur (Şekil 1A). Tümör küreler tek hücrelere triptik edilmiştir ve LGR5 ve CD133 ekspresyonu saptanması için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. HT29 güdülü tümörkürelerde LGR5 %1.1'den .4'e yükselmişt...

Burada sunulan kolorektal HT29 hücrelerinden elde edilen kurulan kanser kök benzeri hücreleri koruyan aşırı ifade sürücü genleri keşfetmek için bir protokoldür. RNAseq mevcut biyoinformatik ile araştırılmış ve hedeflenen tümör hücrelerinin hayatta kalma dahil potansiyel bir mekanizma açıklığa kavuşturmak için gen ekspresyonu ağları ekran.

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Protokolümüz, kök benzeri kolorektal tümör kürelerin oluşumuna katkıda bulunan aşırı ifade edilmiş sürücü genlerini hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak için RNA-Seq ve biyoinformatik araçlar dan yararlandı. Bu protokol, seçici kolorektal kanserlerde kanser sapı için moleküler bir mekanizmayı araştırmak için farklı olarak ifade edilmiş gen ve sinyal yollarını taramak için kullanılır. Kültürün yedinci gününde, tümör kürelerinin çapını gözlemlemek ve ölçmek için dijital hücre görüntüleme sistemine sahip ters bir mikroskop kullanın.Tümör küreleri 100 mikrometreden büyük çapa ulaştığında kültürü %0.25 tripsin ile tedavi edin. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, büyüme ortamının iki katı hacmi ile tripsin nötralize ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Santrifüj ile hücreleri toplayın.Ve peleti beş kez 10'da dört hücreye kadar 100 mikrolitre orta konsantrasyonda yeniden askıya alın. Her tüp ilgi birincil antikor iki mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika ve dakikada 200 devrimleri için hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, her tüpü 900 mikrolitre PBS ile yıkayın ve standart protokollere göre akış sitometrisi ile ilgi proteininin ekspresyonu için hücreleri analiz edin.Az önce gösterildiği gibi tripsin toplama dan sonra RNA izolasyonu için, pbs konsantrasyonunun 50 mikrolitresi başına iki kez 10 ila beşinci hücrelerde hücreleri yeniden askıya alın ve her numuneyi tüp başına iki mikrolitre beta merkaptoethanol ile takviye edilmiş 200 mikrolitre lisis tamponu ile eşitlayın. Kısa girdap ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka sonra, santrifüj ile lysates toplamak ve her tüp% 70 etanol 200 mikrolitre ekleyin. Numuneleri hızlı kolonlar halinde aktarın ve santrifüj ile çözücünün çıkarın.400 mikrolitre yıkama çözeltisi 1 ve 600 mikrolitre yıkama çözeltisi ile yıkayın iki tamamen santrifüj ile herhangi bir RNA olmayan kaldırmak için, herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak için aynı santrifüj koşulları altında ek bir iki dakika santrifüj takip. Daha sonra tüp başına 50 mikrolitre distile su peletleri yeniden askıya alın ve süpernatants içeren RNA toplamadan önce bir dakika için örnek santrifüj. RNA dizianalizi sonrası ebeveyn tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında tümör küre hücreleri arasındaki diferansiyel gen ekspresyonunu araştırmak.Tümörsfer ve ebeveyn gruplarında 100'den büyük okuma sayıları ile eksi bir log2 kat değişim birden büyük olan genleri seçin. Ve belirtildiği gibi komutları kullanın. Diferansiyel gen ekspresyonunu belirlemek için verilerin bir yanardağ arsa elde etmek için.Ağ analisti sürücü gen seçimi için, tek gen girişi seçin ve kopyalayın ve insan ile kopyala ve kimlik türü olarak organizma ve resmi gen sembolü olarak belirtilen yapıştırın. Yükle'yi tıklatın ve devam edin. Genetik protein-protein etkileşimini takiben protein-protein etkileşimini kullanarak verileri yerleştirmek ve analiz etmek için, seri genleri göstermek için 900'lük bir güven puanı yla STRING etkileşimom veritabanını kullanın.Yüklenen genleri birbirine bağlayacak. Daha bireysel genlerle ilişki içinde olan tohum genleri, tümör kürenin oluşumunu sürdürmede rol oynayan sürücü genleri olarak seçilebilir. Arka Plan'daki haritagenel bakış beyaz'ında Devam et'i ve Düzen tonundaki Atlası Zor'u seçin.Ardından, regülasyon gen grubunu analiz etmek için PANTHER baz çiftini seçin. 100 mikrometreden daha büyük tümör küreler kültürden sonraki yedi gün içinde oluşur. Akış sitometrik analizi, HT29 türetilmiş tümörkürelerde ebeveyn HT29 hücrelerine göre LGR5 ve CD133 ekspresyonunda artış olduğunu ortaya koymaktadır.RNA diziliminden sonra, birden fazla log2 kat olan genler, ısı haritasıile belirlenen 0,05'ten daha az P değeri ile yukarı veya aşağı regülasyonlarında değişiklik yaparak HT29 kaynaklı tümör küreleri ile ebeveyn HT29 hücreleri arasındaki önemli genleri ayırt etmek için çizilebilir. Bu temsili deneyde, birden fazla log2 kat ile upregulated genlerin analizi 10 tohum genleri sonuçlandı, gen ağları çapraz bağlantı. PANTHER baz çifti analizi iki genin apoptozun negatif regülasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir.Ayrıca seçilen genler ht29 türetilmiş tümörkürelerde artan ekspresyonlarını doğrulayan kantitatif PCR ile doğrulandı. Diferansiyel gen seçimi prosedürlerin en önemli adımıdır. Bir log2 kat değişiklik ölçüt olarak 100'den büyük recounts ile birden büyük kullanmayı unutmayın.Bu protokol kullanılarak kolorektal kaynaklı tümör kürelerinden seçilen genler, tümörküre oluşumundaki potansiyel rollerini ortaya çıkarmak için yıkılabilir veya aşırı ifade edilebilir.

discovery-driver-genes-colorectal-ht29-derived-cancer-stem-like

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif...

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

İn vitro küre testleri, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Burada tek ve çok hücreli küre tahlillerini karşılaştırıyoruz. Daha zahmetli tek hücre bazlı tahliller veya metilselüloz takviyesi daha doğru sonuçlar verirken, sıvı ortamda gerçekleştirilen çok hücreli bazlı tahliller hücre yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilir.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Kanser kök benzeri hücrelerin tümör nüksü ve tedavilere dirençteki rolünü anlamak son on yılda büyük ilgi gören bir konu haline gelmiştir. Bu makale, baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından (HNSCC) kanser kök benzeri hücrelerin alt popülasyonunun izolasyonunu ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

deri altı klinik öncesi modelde hasta kaynaklı tümörler kullanarak yeni tedavilerin, öngörü biyomarker keşif ve ilaca dirençli yolların etkinliğini incelemek için mükemmel bir yoldur. Bu model, ilaç geliştirme sürecinde, klinik araştırma önce birçok yeni anti-kanser terapisi kaderini belirlemede önemlidir.

Bir Klinik öncesi Hasta Türetilmiş Tümör Roman Anti-Kanser Tedaviler Soruşturma Xenograftlarında Modeli Geliştirilmesi ve Bakımı

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Segmental adeno-cre enfeksiyonu ile genetik olarak tasarlanmış kolorektal kanserli fare modeli kurulması ve yüksek çözünürlüklü kolonoskopi ile gözlemlenmesi için bir protokol sunulmuştur.

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Tümör Başlatan hücrelerin insan sarkomu hasta türevi xenograflarından floresan-aktif hücre sıralama ile yalıtılması için ayrıntılı bir protokol tanımlayarak, insan lökosit antijen-1 (HLA-1) ' i negatif bir işaret olarak kullanarak ve daha fazla doğrulama ve Bu HLA-1-negatif tümör başlatma hücrelerinin karakterizasyonu.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.

Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Bu protokolde, clusterin'in hasta kaynaklı GCSC'lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Keşfedin, RNA-Seq ve biyoinformatik kullanarak HT29 türetilmiş kolorektal kanser kök benzeri tümörkürelerde aşırı ifade edilen sürücü genleri. Bu yöntem, kanser köklülüğünün moleküler mekanizmalarını anlamak için hedefli tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Daha fazla video keşfet