Biyoaktif Küçük Moleküllerin, Peptidlerin Doğal Kaynaklardan ve Proteinlerden Preparatif İzoelektrik Odaklama (IEF) Yöntemi ile Mikroplardan Ayrılması

Protokolümüz, aktif moleküllerin bir bitki ekstresinden ayrılması ve saflaştırılması ile ilgili yeni bulguları açıklamaktadır. Bilim adamları terapötik kullanıcılar için doğal ürün kaynaklarından küçük moleküller ve peptidler izole etmek için bu yöntemleri kullanabilirsiniz. Alet bileşenlerive bunların montaj yöntemleri hakkında bilgi edinin.

Ayrılacak numunenin önerilen yönergeler tarafından hazırlandığından emin olmak önemlidir. Bu yöntem, enstrümanın birden çok montaj işlemi içerir. Ve görsel gösteri kullanıcıların takip etmek ve başarıyla araştırma için bunları uygulamak için yardımcı olacaktır.

Sıvı fazı biraraya getirdikten sonra, kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi IEF ünitesi, anyon değişim membranlarını 0,1 molar sodyum hidroksit ve katyon değişim membranlarını 0,1 molar fosforik asit ile dengeler. Kauçuk contaları üç büyük dikdörtgen deliğin kauçuk tarafından engellenmemiş olarak kalması için hizala. Bu elektroforez sırasında membran üzerinden elektrot ve örnek bölmeleri arasında iyonalışverişi yardımcı olacaktır.

İyon değişimi contalarında üç dikdörtgen delik hizalayarak elektrotun iç ve dış kısmını birleştirin. Daha sonra membranlarının kurumasını önlemek için elektrotları kendi elektrolitleriyle doldurun. Daha sonra, sızdırmaz bir montaj sağlamak için plastik vida tutucusıkın.

Numune toplama panolarını sızdırmazlık bandıyla kapatın. Daha sonra aşağıdaki sırayla seramik soğutma parmağı üzerinde odaklama odası parçaları monte: anot elektrot, naylon membran çekirdek, odaklama odası ve katot elektrot. 50 mililitrelik şırınga kullanarak, odaklama odasını önceden soğutulmuş distile suyla doldurun.

Standart bir IEF hücresi için 60 mililitre su ekleyin. IEF ünitesini dört santigrat derecede sirkülasyon soğutma suyuna bağlayın. Voltaj dengelenir kadar 15 watt ve 3000 volt, yaklaşık 3-5 dakika birim çalıştırın.

Sonra güç kaynağını kapatın. Kesir toplayıcısını kullanarak, hücreden suyu çıkarın. Toplama panolarını sızdırmazlık bandıyla yeniden mühürleyin.

60 mililitre distile suya Gymnema sylvestre bitki ekstresi 0,6 gram ekleyin. Beş dakika boyunca bir rulo tüp içinde karıştırarak bitki ekstresi çözün. Çözünmez parçacıkları çıkarmak için, bu çözeltiyi 10.000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.

Supernatant'ı 150 mililitrelik cam kabına aktarın ve hacim olarak %1'lik bir çözüm oluşturmak için yaklaşık 0,6 mililitre lik bir çözelti ekleyin. 1,5 inç 19 gauge blunt uç iğnesi ile 50 mililitrelik şırınga kullanarak, bu çözümü örnek toplama panoları aracılığıyla IEF hücresine yükleyin. Sonra standdan hücre kaldırmak ve elektrot odası dokunun, yerinden ve herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için.

Üniteyi soğutma suyuna bağlayın. Sabit güç kaynağı ile 15 Watt fraksiyonu başlar. IEF ünitesini gerilim yaklaşık üç saat olan sabit bir değere ulaşana kadar çalıştırın.

Hasat düğmesine bastıktan sonra kesir toplayıcı pimlerini toplama panolarıile hizala. Gymnema sylvestre fraksiyonları toplamaya başlamak için sızdırmazlık bandı ile pimleri itin. C.albicans ve maya pepitone dekstroz suyu tek bir koloni gece boyunca 30 derece santigrat sallayarak büyümek.

Kültürü bir santrifüj tüpüne aktarın ve maya hücrelerini santrifüj le 10,000 kez G'de beş dakika toplayın. Supernatant çıkardıktan sonra, tampon maya hücreleri askıya almak ve beş santigrat derece bir saat için bir silindir tüpü süspansiyon döndürmek. Maya hücrelerini çıkarmak için süspansiyonu 10,000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.

Daha sonra protein ekstresini 0,45 mikrometrelik bir filtreden süzün. Protein ekstresini diyaliz tüpüne aktarın ve 4 santigrat derecede 15 saat boyunca suya karşı diyalize alın. Protein konsantrasyonu tahmin ettikten sonra, toplam protein 500 miligram içeren protein ekstresi bir hacim toplamak.

Hacmine göre% 1 amper içeren su 60 mililitre protein 500 miligram seyreltin. Bir şırınga kullanarak, seyreltilmiş protein ekstresini IEF hücresine yükleyin ve üniteyi sabit 15 Watt'ta dört saat çalıştırın. Bu cihaz yüksek voltajlı elektrik kaynağı kullandığından, kullanıcı canlı elektrotlarla doğrudan temastan kaçınmak için her türlü önlemi almalıdır.

Fraksiyon toplayıcı, her biri 12 milimetreye 75 milimetre lik 20 plastik tüp içerir. Ve vakum pompasına bağlı. Düğmeye hasat basarak kesirleri toplamak için hazırlayın.

Daha sonra kesir toplayıcısındaki 20 toplama iğnesini 20 toplama panosuyla hizalayın, böylece mühürlü odaklama hücresi. Toplama pimlerini sızdırmazlık bandına itin ve aynı anda vakum pompasını açın. Her tüp yaklaşık üç mililitre bir protein fraksiyonu toplayacak.

Protein fraksiyonlarını azaltıp kaynattma sonra % 12.5 SDS sayfa jeli ile analiz edin. Coomassie Mavi boya ile jel leke ve oda sıcaklığında bir rocker üzerine yerleştirin. 2-3 saat sonra jelde lekeyi bozun.

Sonra jel görüntüleyici kullanarak jel görüntü kaydedin. 50 milimolar glikoz ile desteklenen RPMI hücre kültürü orta 1:1000 oranında C.albicans bir gecede kültür seyrelterek bir maya hücre süspansiyon hazırlayın. 96 kuyu plakasının her kuyuya 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Daha sonra, kuyuları ayırmak için her G.sylvestre fraksiyonundan 10 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol olarak, ayrı kuyulara %1 amper atmis 10 mikrolitre su ekleyin. 96 kuyu plakasını 12 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, plakayı mikroskop altında gözlemleyin.

Filamentöz büyüme eksikliği C.albicans maya-hypha dönüşüm inhibisyonu gösterir. G.sylvestre ekstresinin yirmi fraksiyonu sıvı faz IEF ile elde edildi. Koyu renkli moleküller, jimnastik asitler, göç ve ünitenin anod ucunda zenginleştirilmiş.

Katot ucunda yarı saydam açık sarı fraksiyonlar gözlendi. Her G.sylvestre kırılmasından elde edilen aliquotlar SDS sayfası ile azaltıldı, kaynatıldı ve çözüldü. Bir Coomassie Mavi leke kesirler 16 ile 19 arasında zenginleştirilmiş, yaklaşık beş kilodaltonfarklı bir polipeptid bandı gösterdi.

Birinci kesirdeki Gymnemic asitler idiler ve sonraki birkaç fraksiyon proteinamı olmadığı için tespit edilmedi. Ancak, bu moleküller TLC ile ayrılabilir ve UV ışığı altında tespit edilebilir. Fraksiyon 10 bu küçük moleküllerin tespit edilebilir bir miktar organik küçük moleküllerin çoğu kesirler bir ile üç zenginleştirilmiş olduğunu düşündürmektedir içermekti.

Tüm 20 G.sylvestre fraksiyonları maya-to-hypha dönüşüm ve C.albicans hyphal büyüme inhibisyonu için kabul edildi. En büyük inhibisyon 10 ve üzeri kesirlerde gözlendi ve çok az inhibitör gözlendi. C.albicans hücre yüzey proteinleri sıvı faz IEF kullanılarak fraksiyone edildi.

Ve 18 kesirden aliquots SDS sayfası tarafından analiz edildi. Zenginleştirilmiş proteinler çeşitli kesirlerde görülebilir. Başlangıç, küçük moleküller non-ambulatuar olduğuna inanılıyor çünkü izoelektrik odaklama ile ayrılmış olamazdı.

Çalışmalarımız en az haftada bir ambulatuar olduklarını ve bu yöntemin diğer küçük moleküller için daha fazla araştırılabildiği gösterilmiştir.