Name: Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, zaman atlamalı floresan mikroskopi ile Bdellovibrio bacteriovorus'un yaşam döngüsünü canlı hücre görüntüleme yöntemiyle izlemeyi. Bu protokol, mikrobiyal avcılık mekanizmalarını anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi hibe Opus tarafından desteklenmiştir 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.

1. Mikroskobik analiz için B. bakteriovorus lysate hazırlanması
<ol><li>250 mL'lik bir şişede, 1 mL taze 24 h B. bacteriovorus kültürünü birleştirerek ortak kültürü kurmak (örn. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) ve 3 mL gecelik av kültürü (örneğin, E. coli S17-1 pZMR100) 50 mL Ca-HEPES tampon (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) gerektiğinde antibiyotik ile takviye (burada, 50 g/mLkanac).</li>
	<li>30 °C'de 24 saat boyunca 200 rpm'de sallayarak birlikteliği kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Av hücrelerinin sıvı monte faz kontrastlı mikroskopi ile tamamen lysed olup olmadığını kontrol edin. Bu noktada çok sayıda hareketli atak fazı B. bakteriovorus hücresi bulunmalı ve E. coli hücresi veya bdelloplast görünmemelidir.</li>
	<li>Kalan ana bilgisayar hücrelerini çıkarmak için B. bakteriovorus kültürünü 0,45 m'lik gözenek boyutu filtresinden filtreleyin. Yırtıcı hücreler (0.3-0.5 μm x 0.5-1.4 μm) serbestçe 0.45 m gözenekleri nüfuz ederken, ana bilgisayar hücreleri filtre yüzeyinde tutulur.</li>
	<li>Yırtıcı hücreleri toplamak için 20 dk 2469 x g ve 30°C'de 50 mL konik bir tüpte filtratı aşağı doğru çevirin. B. bakteriovorus peletini 3 mL Ca-HEPES tamponunda yeniden askıya alın (yaklaşık 0,2'nin son OD600'üne) ve 30 dakika boyunca 30 °C ve 200 rpm'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. B. bakteriovorus invazyonu için konak hücrelerin hazırlanması
<ol><li>10 mL YT ortasını (%0.8 Bacto tripton) aşılamak için ev sahibi suşların tek bir kolonisini kullanın(E. coli S17-1 pZMR100, eşit olmayan büyüklükteki bdelloplastların oluşumuyla sonuçlanan çeşitli hücre boyutları nedeniyle tavsiye edilir. %0.5 maya ekstresi, %0.5 NaCl [pH = 7.5]) gerekirse antibiyotiklerle desteklenmiştir (burada 50 g/mL kanamisin). Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve 180 rpm.</li>
	<li>Geceleme 2 mL E. coli kültürü (OD600 ~ 3.0) oda sıcaklığında 2 mL test tüpü ve santrifüj ve 5 dakika için 2469 x g aktarın. Ca-HEPES tamponunun 200 μL'lik kısmını yeniden askıya alın.</li>
</ol>3. Mikroskobun kurulumu (bkz. Malzeme Tablosu)
<ol><li>Kullanmadan önce en az 1 saat boyunca 100x yağ daldırma hedefi ile 30 °C'ye kadar mikroskobik bir hazneönceden ısıtın. Bu adım, deneme sırasında odağı koruma hatalarını önlemek için gereklidir.</li>
	<li>Hem mikroskop hem de mikroskopi otomasyonu açın. Kontrol yazılımını başlangıç olarak ve brightfield/DIC/faz kontrastı ve floresan görüntüleri elde etmek için uygun filtreleri seçin , gerektiği gibi (burada: BF görüntüleri, GFP/mCherry polikromik filtre ve mCherry ve GFP için emisyon/uyarma).</li>
</ol>4. Hızlandırılmış floresan mikroskobu için düzenlerin montajı
<ol><li>Ca-HEPES tampon 20 mL ile düşük floresan moleküler sınıf agarose 200 mg karıştırın (1% son agarose konsantrasyonu) ve bir mikrodalga içinde agarose çözünür. Toplu iş katılaşmadan sonra birkaç kez yeniden kullanılabilir, bu nedenle ısıtma adımını tekrarlayın.</li>
	<li>35 mm cam dipli bir tabağa 3 mL eritilmiş agarose dökün(Malzeme Tablosu). Agarose'un katılamasını bekleyin.</li>
	<li>Bir laboratuvar mikro-spatula kullanarak, agarose pedin orta direğini bozmadan 35 mm'lik çanaktan agarose pedi dikkatlice çıkarın. Pedalt tarafını yukarı bakacak şekilde çevirin ve petri kabı nın kapağına yerleştirin(Şekil 2).</li>
	<li>5 μL konsantre E. coli süspansiyonu döndürülen pedin üzerine koyun ve bir aşılama döngüsü kullanarak merkezi direğe yayılmış hücreleri. E. colikaplı yüzeye 5 μL konsantre B. bakteriovorus süspansiyonu (OD600~ 0.2) ekleyin. Hücreleri yaymayın.</li>
	<li>Agarose jeli hızlı bir şekilde 35 mm cam alt tabağa geri döndürün (üst tarafı aşağı bakacak şekilde), sonra bir kapakla kaplayın. Gerekirse, yavaşça plaka karşı agar bastırarak herhangi bir hava kabarcıkları kaldırın.</li>
</ol><img alt="Bakteri deney düzenek şeması; Petri kabı, E. coli, B. bacteriovorus, ters mikroskop." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: Deneysel iş akışının şematik tasviri. Agarose ped 35 mm çanak kaldırılır ve alt tarafı yukarı dönük şekilde çevrilmiş. Yırtıcı hücrelerin taze süspansiyonlar ve av hücrelerinin gece kültürü "alt" tarafı kaplamak için çevrilmiş ped yerleştirilir. Agarose ped daha sonra orijinal yönünü döndürülür ve mikroskop odasında ters mikroskop aşamasıüzerine monte edilir 35 mm çanak, geri yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Hızlandırılmış floresan mikroskopinin iletimi
<ol><li>35 mm'lik kabı Petri kabının tutucuya, deney sırasında hareket etmeyecek şekilde yerleştirin. 35 mm'lik yemeğin dibine ve hedefe bir damla daldırma yağı (1,518 kırılma indisi) yerleştirin.</li>
	<li>Tutucuyu mikroskop odasındaki ters mikroskop sahnesine monte edin.</li>
	<li>Zaman içinde birden çok aşama pozisyonunda birden çok görüntü toplamak için mikroskop kontrol yazılımındaki seçenekleri ayarlayın.<ol>
<li>Büyütme (100x) ve polikromik lens (GFP/mCherry) ayarlayın. Bir göz parçası ve brightfield (BF) kullanarak, odak düzlemi bulmak ve nokta listesi yöneticisi açın.</li>
		<li>Sahneyi hareket ettirerek ve mikroskop yazılımındaki her pozisyonun koordinatlarını işaretle düğmesine tıklayarak depolayarak en az 10 ilgi çekici pozisyon seçin. Fotobeyaztma ve fototoksisiteyi önlemek için birbirine yakın konumlardan kaçının. Kamera valfini göz parçasından monitöre çevirin ve odak düzlemini ayarlayarak ve nokta listesi yöneticisindeki Nokta Yı değiştir düğmesini tıklatarak her noktayı kalibre edin.</li>
		<li>Deneme tasarımcısını açın ve her sekmedeki tüm deneysel parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:<ol>
<li>Z-istifleme kutusunun işaretini aç.</li>
			<li>Floresan kanalları seçin ve en iyi aydınlatma ayarlarını ayarlayın. Burada aşağıdaki ayarlar kullanılmıştır: mCherry kanalı için, mCherry filtre setleri (EX575/25; EM625/45), P yoğunluk ve 200 ms maruz kalma süresi; GFP kanalı için, GFP filtre seti (EX475/28; EM525/48), P yoğunluk ve 80 ms; ve BF görüntüler için, POL kanal, 5% yoğunluk ve 50 ms.</li>
			<li>Görüntüleri edinme ile denemenin toplam süresi arasındaki aralıkları seçin. Burada deneyin 10 saat boyunca 5 dk aralıklarla gerçekleştirildi.</li>
			<li>Seçilen konumlar için odak bakımını etkinleştirin (burada kullanılan sistem için, UltimateFocus onay kutusuyla Koru odağı işaretleyerek).</li>
			<li>Görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi gereken veri klasörünü seçin.</li>
			<li>Mikroskop yazılım denetimindeki tüm ayarları yeniden denetleyin ve hızlandırılmış denemeyi başlatın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Denemenin ilk saatinden sonra, tüm sahne pozisyonlarının hala odakta olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, görüntü edinme arasındaki zaman aralıkları sırasında odak ayarlayın.</li>
	<li>Zaman atlamalı deney tamamlandığında, Petri kabını çıkarın ve biyogüvenlik protokolüne göre 35 mm'lik kabı agarose pedle birlikte kullanın. NOT: Adım 5.2'den sonra atılan tüm adımlar DeltaVision Elite kullanıcıları için özeldir. Diğer sistemleri kullanan araştırmacıların ayarları tek tek sistemlere göre ayarlamaları gerekir.</li>
</ol>6. Fiji yazılımı kullanarak hızlandırılmış görüntülerin işlenmesi ve film üretimi
<ol><li>Deneysel verileri Fiji yazılımıyla yüklü bir bilgisayara aktarın. Fiji programını başlatın ve Dosya'yı kullanarak bir resim açın | Resim dosyasını sürükleyip Fiji'ye bırakarak veya açarak açın.</li>
	<li>Bio-Formats Alma Seçenekleri,yığın görüntüleme seçenekleri Hyperstack ile görünüm yığını nı seçin, renk seçenekleri bileşik renk moduna tıklayın ve Otomatik Ölçekişaretleyin.</li>
	<li>Görüntü yığınları arasında kaydırarak, hücrelerin ve bdelloplastların deney boyunca odakta kalıp kalmadığı konusunda değerlendirin. DnaN-mNeonGreen gelen yeşil floresan lekeler büyüme aşaması boyunca bdelloplasts içinde B. bakteriovorus hücreleri içinde mevcut olup olmadığını kontrol edin, ve yırtıcı yaşam döngüsünün tüm aşamalarında görselleştirilmiş olabilir emin olun.</li>
	<li>Belirli bir B. bacteriovorus hücre /bdelloplast analiz etmek için, Fiji menüsünde seçim araçları kullanarak işaretlemek(Dikdörtgen, Oval, Çokgen, veya Freehand). Resim kullanarak seçilen bölgeyi çoğaltma | Yinelenen veya Ctrl + Shift + Dkullanarak .</li>
	<li>Her floresan kanalının parlaklığını ve kontrastını aşağıdaki gibi ayarlayın:<ol>
<li>Tek bir kanal seçmek Channel tools için Resim | Renk | Kanal araçları veya Ctrl + Shift + Z ve ilgi kanalı seçin(Kanal 1: mCherry, Kanal 2: mNeonGreen, Kanal 3: brightfield).</li>
		<li>Resim'de B&amp;C menüsünü açarak floresan kanaldaki görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlama | Ayarla | Parlaklık/Kontrast veya Ctrl + Shift + C'yetıklayarak .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyze kullanarak ölçek çubuğu ekleme | Araçlar | Ölçek çubuğu. Resimler 'e tıklayarak resimlere zaman damgası ekleyin | Yığınlar | Zaman Damgası.</li>
	<li>Değiştirilmiş görüntüleri kaydetmek için Dosya | As'ı kaydedin ve görüntü dizisi olarak kaydetmek için TIFF'i, film üretmek için AVI'yi veya geçerli çerçevenin tek bir görüntüsünü kaydetmek için PNG'yi seçin.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yaşayan bir antibiyotik olarak B. bakteriovorus kullanarak artan ilgi nedeniyle, yırtıcı yaşam döngüsü gözlemlemek için yeni araçlar, özellikle yırtıcı-patojen etkileşimleri, ihtiyaç vardır. Sunulan protokol, özellikle ev sahibi nin içinde büyümesi sırasında, tüm B. bakteriovorus yaşam döngüsünü gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Ayrıca, DNA polimeraz III holoenzimfloresan etiketli beta kıskacı üreten bir suş uygulaması B. bakteriovorusüreme aşaması boyunca kromozom replikasyon prog...

Bdellovibrio bakteriovorus klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Shigella flexneri1,,2,3gibi zararlı patojenler de dahil olmak üzere diğer gram-negatif bakteriler, avlar gram-negatif bakteri küçük (0.3-0.5 μm 0.5-1.4 μm) gram-negatif bakteri olduğunu . B. bakteriovorus patojenleri öldürdüğünden, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele de uygulanabilecek potansiyel bir canlı antibiyotik olarak kabul edilir, özellikle de çoklu ilaca dirençli suşların neden olduğu antibiyotikler.
B. bakteriovorus iki aşamadan oluşan kendine özgü bir yaşam döngüsü sergiler: serbest yaşayan non-replicative saldırı fazı ve hücre içi üreme evresi(Şekil 1). Serbest yaşam evresinde, 160 m/s'ye varan hızlarda hareket eden bu son derece hareketli bakteri avını arar. Avın dış zarına bağlandıktan sonra periplazmaya4,5girer. İnperiplazmik üreme evresi sırasında, B. bacteriovorus konağın makromoleküllerini alçaltmak ve kendi büyümesi için yeniden kullanmak için hidrolitik enzimlerin bir bolluk kullanır. Periplazmayı istila ettikten kısa bir süre sonra, konak hücre ölür ve bdelloplast adı verilen küresel bir yapıya dönüşür ve içinde yırtıcı hücre kromozomlarını uzatır ve çoğaltır. Çoğaltma işlemi çoğaltma kökenli başlar (oriC)6 ve kromozom un birkaç kopya tamamen sentezlenene kadar devameder 7. İlginçtir, her kromozomun replikasyonu hücre bölünmesi tarafından takip edilmez. Bunun yerine, yırtıcı uzun, multinükleoid ve ipliksi bir hücre oluşturmak için uzatır. Besin tükenmesi üzerine, filament senkron septasyon uğrar ve döl hücreleri bdelloplast serbest bırakılır8.
B. bakteriovorus bakteriyel enfeksiyonlara karşı yaşayan bir antibiyotik olarak kullanılabilir önce, onun yaşam döngüsünün önemli aşamalarını anlamak için çok önemlidir, özellikle av içinde çoğalması ile ilgili olanlar. B. bakteriovorus'un canlı hücre görüntülemesi, karmaşık yaşam döngüsü sırasında yırtıcının ve avının çeşitli morfolojik formları nedeniyle zor olmuştur. Şimdiye kadar, B. bakteriovorus ve konak hücre arasındaki etkileşimler ağırlıklı olarak elektron mikroskobu ve snap-shot analizi 2 tarafından incelenmiştir,,9,10, her ikisi de sınırlamalar var, özellikle de yırtıcı yaşam döngüsünün ardışık aşamalarını izlemek için kullanılır. Bu yöntemler B. bakteriovorus hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlar ve saldırı veya büyüme aşamasında küçük bir yırtıcının gözlemini sağlar. Ancak, her iki yaşam döngüsü aşamalarında tek B. bakteriovorus hücrelerinin izlenmesine izin vermezler.
Burada sunulan b. bakteriovorustam yaşam döngüsünü izlemek için zaman atlamalı floresan mikroskop (TLFM) kullanmak için kapsamlı bir protokoldür. Agarose pedden oluşan bir sistem, hücre görüntüleme çanaklarıyla birlikte kullanılır, bu da yırtıcı hücrelerin agarose pedin altında serbestçe hareket edebilmesi ve hareketsiz av hücrelerinin bdelloplastlar oluşturabildiği bir yerdir(Şekil 2). Bu kurulum hem E. coli hem de B. bacteriovorus'unspesifik suşlarına göre hazırlanır, ancak protokol kullanıcının bireysel suşlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir (örn. farklı seçim işaretleri taşıyan proteinler, farklı floroforlarla kaynaşmış proteinler, vb.).
Bu durumda, saldırı aşamasında B. bakteriovorus görselleştirmek için, belirli bir gerginlik (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) sitoplazmaik protein, PilZ (istek üzerine laboratuvarda mevcut) bir floresan etiketli sürümünü ifade inşa edilmiştir7. Bu suşu ayrıca DNA polimeraz III holoenziminin bir alt birimi olan ve floresan proteinle kaynaşmış DnaN (β-sürgülü kıskaç) üretir. Bu, bdelloplastlar içinde büyüdükçe yırtıcı hücrelerin içinde devam eden DNA replikasyonunun izlenmesini sağlar.
Görüntü edinimi için kullanılan açıklanan protokol ve yazılım, belirli bir üretici tarafından sağlanan ters bir mikroskopa atıfta bulunsa da (bkz. Malzemeler Tablosu),bu teknik, çevre odası veya diğer harici ısıtma tutucusu yla donatılmış ve hızlandırılmış görüntüleme yeteneğine sahip ters mikroskop için ayarlanabilir. Veri analizi için, kullanıcılar tek tek çıktı biçimleriyle uyumlu herhangi bir kullanılabilir yazılım seçebilir.
<img alt="Bdellovibrio yaşam döngüsü diyagramı; atak ve üreme evreleri; bakteri istilası süreci." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: E. coli'de ana hücre olarak B. bakteriovorus yaşam döngüsü. Saldırı evresinde, serbest yüzen bir B. bakteriovorus hücresi konakçı E. coli hücreyi arar ve ona bağlanır. İstiladan sonra yırtıcı hücre avın periplazmasında lokalize olur, konak hücrenin şeklini değiştirir ve bir bdelloplast oluşturur. Üreme evresi bdelloplast oluşumu ile başlar. Yırtıcı hücre av hücresini sindirir ve kendi yapılarını oluşturmak için basit bileşikleri yeniden kullanır. B. bakteriovorus konak periplazmı içinde uzun bir tek filament olarak büyür. Av hücresinin kaynakları tükendiğinde, B. bakteriovorus filamenti senkronize olarak septates ve singeny hücreleri oluşturur. Döl hücreleri kamçılarını geliştirdikten sonra bdelloplastı lyse olarak verirler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>Rotor ref. 12183</td></tr><tr><td>SertifikalıMoleküler Biyoloji agaroz</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>agaroz pedi için düşük floresan agaroz</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>Açık kaynaklı görüntü işleme paketi</td></tr><tr><td>Cam Alt Çanak 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>kaplamasız cam</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite Mikrotitre</td><td>Aşaması, nihai odak lazer modülü, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI montajı FP DV, kit obj. Oly 100x yağ 1.4 NA, prizma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>Minisart Filtre 0.45 & mikro; m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>Selüloz Asetat, Steril, Luer Lock Outlet</td></tr><tr><td>Start SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı</td></tr></tbody></table>

zaman atlamalı floresan mikroskopi kullanarak bakteriyel predator bdellovibrio bakteriovorus yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bakteriovorus, zararlı patojenler de dahil olmak üzere diğer gram-negatif bakterileri öldüren küçük bir gram-negatif, zorunlu yırtıcı bakteridir. Bu nedenle, yaşayan bir antibiyotik olarak kabul edilir. Yaşayan bir antibiyotik olarak B. bakteriovorus uygulamak için, öncelikle karmaşık yaşam döngüsünün önemli aşamalarını anlamak için gereklidir, av içinde özellikle çoğalması. Şimdiye kadar, yırtıcı yaşam döngüsünün birbirini izleyen aşamalarını gerçek zamanlı olarak izlemek zor olmuştur. Burada sunulan B. bakteriovorustam yaşam döngüsünün gerçek zamanlı görüntüleme için kapsamlı bir protokol , özellikle ev sahibi içinde büyüme sırasında. Bu amaçla, bir agarose ped oluşan bir sistem hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte kullanılır, hangi yırtıcı hücreler agarose ped altında serbestçe hareket edebilir ise hareketsiz av hücreleri bdelloplastlar oluşturmak edebiliyoruz. DNA polimeraz III'ün floresan etiketli β-subunit'ini üreten bir suş uygulaması, B. bakteriovorus yaşam döngüsünün üreme aşamasında kromozom replikasyonunun izlenmesini sağlar.

Açıklanan TLFM tabanlı sistem, B. bacteriovorus hücrelerinin zaman içinde izlenmesini sağlar(Şekil 3, Film 1) ve karmaşık yırtıcı yaşam döngüsünün her aşaması hakkında değerli bilgiler sağlar. PilZ-mCherry füzyonu tüm yırtıcı hücrenin saldırı evresinde ve büyüme evresinin erken evresinde etiketlenmesini sağlar(Şekil 3). Saldırıdan replikorfaza geçiş sadece konak bdelloplast oluşumu tarafından değil, aynı zamanda DnaN-mNeonGreen floresan...

Burada sunulan bir agarose ped ve hücre görüntüleme yemekleri ile birlikte zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak yırtıcı bakteri Bdellovibrio bakteriovorus tam yaşam döngüsünün izlenmesi açıklayan bir protokoldür.

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Canlı Hücreli Bdellovibrio bakteriovorus görüntüleme bu yırtıcı bakterilerin karmaşık yaşam döngüsü nedeniyle zor olmuştur. Protokolümüz, tüm yaşam döngüsünün aşamalarının gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlar. Protokolümüz belirli bir eşitleme suşlarına dayanmasına rağmen, patojenik suşlar da dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel suşlara kolayca adapte edilebilir.Bir B.bacteriovorus kültürü kurmak için, bir mililitre taze 24 saatlik kültürbakterileri ile bir mililitre gecelik av kültürünün üç mililitresini içeren 250 mililitrelik bir şişede 50 mililitre kalsiyum hippi tamponu içeren bir araya getirin. Dakikada 30 derece ve dakikada 200 devirde 24 saatlik kuluçkadan sonra, av hücrelerinin sıvı monte edilmiş yüz kontrastlı mikroskopi ile tamamen lysed olup olmadığını kontrol edin. Çok sayıda çok atak fazlı B.bakteriovorus hücresi bulunmalı ve e.coli hücresi veya bdelloplast görünmemelidir.B.bacteriovorus kültürünü 0,45 mikrometrelik gözenek boyutufiltresinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün ve bir santrifüjdeki filtrasyonu askıya alın. Daha sonra b.bakteriovorus peletini üç mililitre kalsiyum hippitamponu yla yaklaşık 0,2'nin 600 nanometresinde son optik yoğunluğa kadar askıya alın ve bakterileri 30 dakika boyunca dakikada 30 derece ve dakikada 200 devrimle kuluçkaya yatırın. Konak hücreleri hazırlamak için, ilgi ana suş tek bir koloni seçin ve 37 santigrat derece ve dakikada 180 devrimleri bir gecede kuluçka için gerekli olarak antibiyotik ile takviye YT orta 10 mililitre bakteri nodülate.Ertesi sabah iki mililitrelik bir gece kültürünü iki mililitrelik bir test tüpüne aktarın ve hücreleri santrifüj le peletler. Sonra kalsiyum hippiler tampon 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Av hücresinin tek hücre düzeyinde ayrıldığından emin olmak için santrifüjden sonra tüm hücre peletinin tamamen askıya alınması çok önemlidir.Zaman atlamalı floresan mikroskopi için hücreleri hazırlamak için, ilk olarak, kalsiyum hippiler tampon 20 mililitre ile düşük floresan moleküler sınıf agarose 200 miligram karıştırın ve bir mikrodalga agarose eritin. 35 milimetrelik bir cam alt çanağa erimiş agarose üç mililitre dökün ve agarose katılaşmak için izin. Bir laboratuvar mikro spatula kullanarak, dikkatle ped merkezi kutup rahatsız etmeden çanak agarose ped çıkarın ve bir Petri çanak kapağı üzerinde ped alt tarafı yerleştirin.Odaklanmış ped üzerine konsantre konak hücre süspansiyon beş mikrolitre yerleştirin ve merkezi kutup hücreleri yaymak için bir aşılama döngü kullanın. Sonraki yayılmadan konak hücre kaplı yüzeye konsantre B.bacteriovorus süspansiyon beş mikrolitre ekleyin ve hızlı bir şekilde 35 mililitre cam alt çanak üst aşağı jel dönmek. Sonra bir kapak ile çanak kapağı.Eş kültürün Lapse Floresan mikroskobu için, kabı petri kabıtutucuya yerleştirin, öyle ki çanak deney boyunca hareket etmeyecek ve ters mikroskop hedefine bir damla daldırma yağı ve kabın dibine bir damla yerleştirin. Tutucuyu ters mikroskop odasındaki mikroskop aşamasına monte edin ve mikroskop yazılımında büyütmeyi 100X'e, polikrom lensi de GFP ve Mcherry'ye ayarlayın. Brightfield'da bir iPS kullanarak odak düzlemini bulun ve anlamsız yöneticiyi açın.Sahneyi taşıyın ve en az 10 pozisyonun koordinatlarını depolamak için işaret noktaları düğmesini kullanın. Kamera valini iPS'den monitöre geçirin. Odak düzlemini ayarlayın ve her noktayı kalibre etmek için anlamsız daki nokta değiştir düğmesini tıklatın.Deney tasarımcısını açın ve hastalık istifleme kutusunu işaretleyin. Uygun floresan kanalları ve en uygun eleme ayarlarını seçin ve görüntü edinme ile denemenin toplam süresi arasındaki aralıkları ayarlayın. Seçilen konumlar için odak bakımını etkinleştirin ve görüntü dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi gereken veri klasörünü seçin.Mikroskop yazılım denetimindeki tüm ayarları yeniden kontrol edin ve hızlandırılmış denemeyi başlatın. Denemenin ilk saatinden sonra, tüm sahne konumlarının hala odakta olup olmadığını kontrol edin. Zaman atlamalı deney tamamlandığında, Petri kabını çıkarın ve uygun biyo-güvenlik protokollerine göre 35 milimetrelik kabı bir agarose pedle atın.Zaman atlamalı görüntü verilerinin işlenmesi için, deneysel verileri Fiji yazılımıyla yüklü bir bilgisayara aktarın ve Fiji'de bir görüntü açın. Biyo-formatalma seçeneklerinde, hyperstack'li görünüm yığınını seçin. Bileşik renk modunda otomatik ölçek seçin.Görüntü yığınları arasında kaydırma yaparak hücrelerin ve bdelloplastların deney boyunca odak noktası olarak kalıp kalmadığı değerlendirilir. BÜYÜME evresi boyunca bdelloplastların içindeki B.bacteriovorus hücrelerinde DNA ve mNeon yeşilinden gelen yeşil floresan lekelerin bulunup bulunmadığı ve yırtıcı yaşam döngüsünün tüm aşamalarının görselleştirilip görüntülenilemeyeceği. Belirli bir B.bacteriovorus hücre bdelloplast analiz etmek için, ilgi hücre işaretlemek için bir seçim aracı kullanın.Ardından seçilen bölgeyi çoğaltın. Yinelenen resimde, işlem ve pürüzsüz'e tıklayın ve her floresan kanal için görüntü, renk, kanal araçlarını tıklatın ve ilgi çekici kanalı seçin. Ardından, her kanaldaki görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için görüntü, ayarla ve parlaklık kontrastını tıklatın.Ölçek çubuğu eklemek için çözümle, araçları ve ölçek çubuğu'nı seçin. Resimlere zaman damgası eklemek için resimlere, yığınlara ve zaman damgasına tıklayın. Değiştirilen görüntüleri kaydetmek için TIF'i seçin.Verileri görüntü dizisi olarak kaydetmek için, bir film üretmek için AVI veya geçerli çerçevenin tek bir görüntüsünü kaydetmek için PNG. Bu Hızlandırılmış Floresan mikroskopisi tabanlı sistem, b.bacteriovorus hücrelerinin gerçek zamanlı takibini sağlar ve karmaşık yırtıcı yaşam döngüsünün her aşaması hakkında değerli bilgiler sağlar. Pillsy mCherry füzyon tüm yırtıcı hücre saldırı aşamasında yanı sıra büyüme aşamasının erken aşamasında etiketli olmasını sağlar.Saldırıdan çoğaltıcı faza geçiş sadece konak bdelloplast oluşumu ile değil, aynı zamanda replisome görünümü ile görüntülenebilir. Replisome istilacı hücre direğinde toplanır ve üreme evresi ilerledikçe büyüyen B.bacteriovorus filamenti içinde birden fazla replisome görülebilir. Kromozomun birkaç kopyası sentezedildikten sonra, çoğaltıcı sonlandırılır.Son olarak, multinükleli filament septasyon geçmesi ve döl hücreleri bdelloplast serbest bırakılır. B.bakteriovorus hücreleri avlarını aktif olarak arayacak kadar malzemeli olmalı ve tüm hücre yoğunluğu yırtıcı hücre bağlanmasına izin verecek kadar yüksek olmalıdır. Bu platform, çoklu ilaca dirençli patojenleri içeren deneylerde yararlı olabilir ve insan ve veterinerlikte canlı antibiyotik olarak B.bacteriovorus'un genetik mühendisliğindeki gelişmeleri kolaylaştırmak için yararlı olabilir.

live-cell-imaging-life-cycle-bacterial-predator-bdellovibrio

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü...

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

Kaynak: Heering, J., ve diğerleri., Hücresel Farklılaşmanın İndüksiyonu ve Vibrio parahaemolyticus Yüzücü ve Sürü Hücrelerinin Tek Hücre Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2017).Bu video, floresan görüntüleme için bir Vibrio parahaemolyticus kolonisinden sürü hücrelerinin hazırlanmasını göstermektedir. Bakteriler, yüzücü hücrelerde tek kutuplu ve uzun sürü hücrelerinde iki kutuplu olarak lokalize olan ve görsel farklılaşmalarına izin veren florofor etiketli bir proteini eksprese etmek için genetik...

Vibrio parahaemolyticus Swarmer Hücrelerinin Görüntüleme İçin Hazırlanması

Kaynak: Schumacher, D. ve Sogaard-Andersen, L. Yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus'un tam vejetatif hücre döngüsünün floresans canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, bakteriyel hücre bölünmesi sırasında floresan etiketli kromozom kökenlerini takip etmek için canlı hücre görüntüleme kullanımını göstermektedir. Kromozom ayrımcılığı dinamiklerini zaman geçişli faz kontrastı ve floresan mikroskopisi kullanarak yakalar.

Flüoresans Etiketli Bakterilerde Kromozom Ayrılmasının Zaman Kesmesi Görüntülemesi

Kaynak: Makowski, Ł. ve diğerleri. Bakteriyel Avcı Bdellovibrio bacteriovorus'un yaşam döngüsünün Zaman Geçişli Flüoresans Mikroskopisi kullanılarak canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Bdellovibrio bacteriovorus'un immobilize edilmiş E. coli'yi agaroz pedinin altında avladığı zaman geçişli floresan görüntülemeyi göstererek, bakteriyel predasyon ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için hücre içi çoğaltma ve soyut salınımının gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlıyor.

E. coli üzerinde Bdellovibrio bacteriovorus avlanmasının Canlı Hücre Zaman Geçişli Görüntülemesi

Kaynak: Brzozowski, R. S. ve diğerleri. Bakterilerde subhücre protein lokalizasyonunu ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri araştırmak için canlı hücre floresan mikroskobi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, bakterilerde gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için canlı hücre floresans mikroskopisini göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerçek zamanlı elde etmek için görüntüleme, zaman geçişi ve dekonvolüsyonda kullanılan adımları özetler.

Bakterilerde Morfolojik Değişikliklerin Canlı Hücre Floresan Mikroskopisi Kullanılarak Görüntülenmesi

Streptomyces, hücre biyolojik yollarla incelenmesi deneysel olarak zor olan karmaşık bir yaşam döngüsü ile karakterize edilir. Burada, Streptomyces venezuelae'yi mikroakışkan bir cihazda büyüterek tüm yaşam döngüsünün floresan hızlandırılmış mikroskobunu gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme<em&gt; S. venezuelae</emBir mikroakışkan Cihaz Kullanımı&gt; Yaşam Döngüsü

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Bakteri hücreleri son derece dağınık şekilde düzenlenir. Yavaş büyüyen Myxococcus xanthus hücreler zamanla bu organizasyonda takip etmek için bir tuzak birçok nesiller boyunca yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile floresan canlı hücre görüntüleme için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemli proteinlerin kronolojik zamanmekansal dynamics tespit edilemedi.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Öğrenin, zaman atlamalı floresan mikroskopi ile Bdellovibrio bacteriovorus'un yaşam döngüsünü canlı hücre görüntüleme yöntemiyle izlemeyi. Bu protokol, mikrobiyal avcılık mekanizmalarını anlamak için değerli bilgiler sunar.

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Zaman Atlamalı Floresan Mikroskopi kullanarak Bakteriyel Predator Bdellovibrio bakteriovorus Yaşam Döngüsünün Canlı Hücre Görüntüleme

Daha fazla video keşfet