Name: EGFR Somatik Mutasyonları Moleküler Dinamik Simülasyonu ile Aktive Etmenin Yapısal Etkilerinin Deşifre Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Keşfedin EGFR somatik mutasyonlarının moleküler dinamik simülasyonları ile yapısal etkilerini. Amber yazılımı kullanarak kanser tedavileri için ilaç tasarımına yönelik önemli bilgiler elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Finlandiya Akademisi 'nden (308317, 320005), Sigrid Juselius Vakfı ve Tor, Joe ve Pentti Borg anma fonundan Ve Finlandiya Akademisi'nden (274728, 316796), Finlandiya Kanser Vakfı'ndan ve Turku Üniversitesi Merkez Hastanesi'nden M.S.J.'e yapılan bağışlarla finanse edilmektedir. M.Z.T. Åbo Akademi Bilgi ve Yapısal Biyoloji Doktora Ağı tarafından finanse edilmektedir. Bilgi işlem kaynakları için CSC IT Center for Science'a ve Biocenter Finland biyoinformatik ağı altındaki BT desteği için Dr. Jukka Lehtonen'e teşekkür ederiz; ve Biocenter Finlandiya yapısal biyoloji altyapı ağı.

NOT: ΔELREA ve A702V mutasyonunun MD simülasyonları kullanılarak EGFR yapısı üzerindeki etkilerini incelemek için atılan ayrıntılı adımlar aşağıdaki gibi tartışılmıştır:
1. Yapı hazırlığı
NOT: ΔELREA mutasyonunun yapısal etkilerini incelemek amacıyla, apo aktif, ATP'ye bağlı aktif ve apo inaktif EGFR monomer yapıların yabani tipi ve mutant formları aşağıdaki gibi hazırlanır.
<ol><li>Yabani tip apo aktif EGFR kigaz yapısını hazırlamak için Chimera23 görselleştirme programını<a href="https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/" target="_blank">(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)</a>açın. Dosya menüsünde ID'ye göre Getir seçeneğini tıklayın ve Protein Veri Bankası (PDB24)veritabanını seçin ve PDB kodu 2GS225 (2,8 şçözünürlük) belirtin. PDB, X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi, kriyo-elektron mikroskobu ve nötron kırınımı gibi farklı deneysel tekniklerle çözülen 3Boyutlu yapılar için bir depodur.</li>
	<li>EGFR PDB yapıları 1M1426 (2.6 Å) ve 3W2S27 (1.9 Å) bu segmentleri alarak 2GS2 eksik yapısal elemanları oluşturun. Bunu yapmak için, 1M14 ve 3W2S'yi açın ve Araçlar → Yapısı karşılaştırma menüsündeki ÇöpÇatan seçeneğini kullanarak 2GS2'ye ekleyin.<ol>
<li>1M14 ve 3W2S'den eklenecek segmentleri kırpın. 2GS2'deki boşluklardan önce kalıntının terminal atomlarını ve 1M14 ve 3W2S'den eklenecek atomları seçin (eklenen segmentler hakkında ayrıntılı bilgi için Tablo 1'ebakın). Komut satırında tip bağ sel ve vurmak girin. Bu yapı şablon yapısıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EGFR kigaz etki alanının ΔELREA silme mutant formunu oluşturmak için adım 1.2'deki şablon yapısını kullanın. ΔELREA EGFR'nin FASTA format dizisini şablon yapısının sırasını kaydederek(Favori → Dizisi → Dosyası → kaydedin)ve ardından ELREA dizisini 746-750 kalıntı numaralarıyla silerek üretin.<ol>
<li>ΔELREA EGFR sırasını Chimera'da açın ve Sıra menüsünü kullanarak 2GS2 şablon yapısının dizilimi ile hizala. Hizalama penceresinde Model Yapısı (homoloji)28 seçeneğini →.</li>
		<li>Açılan pencerede 2GS2 bileşik yapısını şablon olarak ve mutant sırasını modellenecek sorgu olarak belirtin. Sonra Tamam tuşunabasın. ZDOPE skoru (genellikle en düşük puan) ve görsel denetimdayalı, ortaya çıkan modeller arasında bir mutant modeli seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATP'ye bağlı yabani tip EGFR kizaz yapısını hazırlamak için pdb yapısını 2ITX29 (2,98 Å) ana yapı olarak kullanın. Adım 1.2'deki yordamı izleyen 2GS625 (2.6 Å) ve 3W2S yapılarını kullanarak eksik segmentler oluşturun (bkz. Tablo 1). PDB dosyasını bir metin düzenleyicisinde açarak ve ANP'nin N3B azot atomuna oksijen atomuna dönüştürerek, elde edilen yapıdaki ligand ANP'yi ATP'ye dönüştürün.</li>
	<li>1.1.'de belirtildiği gibi Chimera'da 1.4. Mg 2+ iyonu için benzer bir konumlandırma elde etmek için PDB yapısı 2ITN29 (2.47 Å) bu yapıya magnezyum iyonu ekleyin.</li>
	<li>1.5 adımdan kaynaklanan yapı ile ΔELREA mutant formunu 1.3 adımdan takip ederek modellendirin.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Apo aktif EGFR</td>
			<td>Apo inaktif EGFR</td>
			<td>ATP'ye bağlı aktif EGFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temel yapı</td>
			<td>2GS2</td>
			<td>2GS7</td>
			<td>2ITX</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Eksik döngüler oluşturmak için kullanılan yapılar</td>
			<td>1M14 (723-725)</td>
			<td>3W2S (958-984)</td>
			<td>2GS6 (862-865)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3W2S (967-981)</td>
			<td>4HJO (848-850)</td>
			<td>3W2S (990-1001)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Apo aktif, apo etkin olmayan ve ATP'ye bağlı aktif yapıların kompozit modellerini oluşturmak için kullanılan yapılar. Ana yapıdaki eksik bölgeler (parantez içinde amino asit aralığı) listelenen yapılardan inşa edilmiştir.
<ol start="7"><li>Yabani tip apo inaktif EGFR kizaz yapısını hazırlamak için, 1.1 adımda olduğu gibi PDB yapısını 2GS725 (2.6 Å) açın ve bağlı ligandları ve kristalografik suları silin. Adım 1.2'deki yordamı kullanarak 3W2S ve 4HJO30 (2,75 Å) yapılarından 2GS7'deki eksik segmentleri (bkz. Tablo 1'ebakınız) ekleyin. Son inaktif EGFR yapısına dayanarak, adım 1.3 prosedürü kullanarak mutant modeli hazırlamak. NOT: A702V mutasyon çalışması için, mutasyon dimer arabiriminin büyük bir bölümünü oluşturan kizaz etki alanının yan yana b segmentinde yer alması nedeniyle EGFR asimetrik dimer yapısı incelenmiştir. Yabani tip ve A702V mutant EGFR yapıları aşağıdaki gibi hazırlanır:</li>
	<li>Yabani tip asimetrik dimer yapısı PDB yapısı 2GS2,başlangıçta monomerik formda görüntülenir inşa edilmiştir. Asimetrik düzenlemede aktivatör ve alıcı kinazlarını içeren biyolojik montaja dönüştürmek için Chimera'da (1.1) olduğu gibi 2GS2'yi açın ve Üst Düzey Yapı → Birim Hücre menüsünden araçlar→tıklayarak simetri hesaplamaları yapın. 2GS2 yapısını seçin ve kopya yap'ıgirin. Son olarak, simetri işlemlerinden kaynaklanan dimer'ın birden çok kopyasından tek bir asimetrik dimer seçin ve kaydedin.</li>
	<li>1.8 adımdan itibaren vahşi tip asimetrik EGFR yapısını kullanarak, Chimera'daki Rotamers seçeneği→ Araçlar → Yapısı düzenlemesini kullanarak alanin 702'yi valine değiştirerek A702V mutantını oluşturun. NOT: ΔELREA ve A702V mutasyon çalışmaları için toplu olarak altı monomerik ve iki dimerik EGFR yapısı hazırlanmıştır. Her yapı daha sonra Maestro programı31 protein hazırlama sihirbazı kullanılarak simülasyon için işlenir ve MD simülasyonları Amber programı32ile yapılır.</li>
	<li>Dosya → alma yapısı seçeneğini kullanarak Maestro'daki yapıyı açın. Daha sonra protein hazırlama sihirbazı düğmesine tıklayın ve aşağıdakileri seçin: hidrojen atomları ekleyin, eksik yan zincir atomları oluşturmak, PROPKA kullanarak pH 7.0 iyonizable kalıntıların protonasyon durumlarını belirlemek, hidrojen yapıştırma için asparagin, glutamin ve histidin kalıntıları yönünü optimize, ve nihayet yapıyı en aza indirmek.</li>
</ol>2. Sistem kurulumu
<ol><li>Amber yazılım paketinde yer alan artık programını açın. İthalat ff14SB kuvvet alanı33 (kaynak leaprc.protein.ff14SB) ve TIP3P su molekülleri34 (kaynak leaprc.water.tip3p). ATP'ye bağlı sistemler için de ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep)için parametreler imal edilir. Daha sonra, yapıyı yükleyin (mol = loadpdb structure.pdb).</li>
	<li>Proteinin yüzey atomlarından 10 Å'ı her yöne uzanan açık TIP3P su molekülleriyle bir sekizahedral kutudaki yapıyı çözündürün(solvateoct mol TIP3PBOX 10.0).</li>
	<li>Yapılı sistemi kontrol edin (Mol'u kontrol edin)ve gerekli iyonlar ekleyerek nötralizeedin (mol Na+ 0 addions). Biyomoleküler sistemleri yeterince modellemek için, sistem tuz konsantrasyonunu 0,15 M'e(addions mol Na+ X, addions mol Cl- X)getirmek için simülasyon kutusuna ek Na+/Cl- atomları ekleyin, x'in yerini x'in aldığı yer: istenilen tuz konsantrasyonu * su molekülü başına hacim * Avogadro'nun sayısı.</li>
	<li>Oluşturmak ve sonraki üretim simülasyonu için girdi olarak hizmet sistemin topoloji ve koordinat dosyaları kaydetmek(saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).</li>
</ol>3. Moleküler dinamik simülasyonu
<ol><li>Amber kullanarak, başlangıçta en dik iniş 5000 döngüleri için simülasyon sistemi tabi ve olumsuz yapılandırmaları atlatmak için gradyan enerji en aza indirilmesi eşleşin. Solute atomlara uygulanan kısıtlamayı 25 kcal mol-1 ş-2 ila 0 kcal mol-1 ş-2'denkademeli olarak indirerek birden fazla adımda en aza indirin.<ol>
<li>En küçük leştirme giriş dosyasında, min.in,toplam en küçükleştirme döngüsü (maxcyc = 5000) ve ncyc için en dik iniş algoritması için döngü sayısını belirtmek için maxcyc değişkenini ayarlayın. Restraint_wt değişkenini kullanarak emniyet maskesi parametresi tarafından belirtilen solute atomlara bağlama kuvveti uygulayın. Sonra aşağıdaki gibi en aza iner: $AMBERHOME/bin/zımpara -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd NOT: Kullanılan strateji ve gerçek parametreler kişinin kendi tercihlerine göre değişiklik gösterebilir. Ayrıntılar ve rehberlik Amber kılavuzu ve web sitesinden bulunabilir (<a href="https://ambermd.org/index.php" target="_blank">https://ambermd.org/index.php</a>)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sistemi 0 K'dan 300 K'ye kadar 10 0 0 0 0 000 ps'lik bir ısı ile 10 kcal mol-1 ş-2 solute atomlar üzerinde dizginleme ayar. Bunu yapmak için tempi = 0,0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 ps, nstlim = 50000 ve restraint_wt = 10 heat.in giriş dosyasında ayarlayın. Isıtma'yı aşağıdaki komutla gerçekleştirin: $AMBERHOME/bin/zımpara -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
</li>
	<li>Bir NPT topluluğu altında 900 ps için sistem dengeleyin; sabit sayıda atom, sıcaklık (temp0 = 300.0) ve basınç (ntp = 1), Berendsen yöntemi ile kontrol (ntt = 1). Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için 9 şmesafe kesme(kesme = 9,0)ayarlayın. Solute atom kısıtlamasını kademeli olarak 0,1 kcal mol-1 ş-2 (restraint_wt = 0,1'edüşürün). Yukarıdaki parametreleri aşağıdaki gibi açıklayan equil.in denklik giriş dosyasını çalıştırın: $AMBERHOME/bin/zımpara -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c heat.rst -r equil.rst -x equil.mdcrd -ref heat.rst
</li>
	<li>Sınırsız 5 ns simülasyonu ile dengeyi kesinleştirin (dt = 0.002 ps, ntslim = 2500000). $AMBERHOME/bin/zımpara -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
</li>
	<li>Sistemin sıcaklık, basınç, yoğunluk ve enerji değerlerini inceleyerek dengede olup olmadığını kontrol edin. $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl ısı.dışarı equil.out equil_final.out xmgrace özeti. TEMP/YOĞUNLUK/ETOT/EPTOT/EKTOT
</li>
	<li>100 ns (set dt = 0.002 ps, ntslim = 50000000 prod.in)için üretim simülasyonu yürütmek ve her 10 ps(ntwx = 5000)konforkaydetmek. $AMBERHOME/bin/zımpara -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst
</li>
</ol>4. Analiz
<ol><li>Görsel denetim<ol>
<li>X.prmtop amber topoloji dosyalarını ve VMD36'dakiilgili prod.mdcrd yörünge dosyalarını açarak vahşi tip ve mutant EGFR kigaz simülasyonları sırasında örnekalınan konformasyonları görselleştirin. Uygun ikincil yapı gösterimlerini kullanarak, proteinlerin genel yapısal dinamiklerini kaydedilen yörüngeden analiz edin. Katalitik olarak gerekli olan K745 - E762 tuz köprüsü gibi atomlar/ilgi artıkları arasındaki belirli etkileşimleri görüntüleyin.</li>
		<li>Alternatif olarak, simülasyon sırasında alınan birden çok konformasyonu PDB formatında kaydedin ve Chimera programını kullanarak açın. MatchMaker seçeneğini kullanarak yapıları ilk veya ortanca yapıya üst üste bindirin. İlk/ortanca yapıyı katı, geri kalanını ise soluk beyaz olarak görüntüleyin. Bu yaklaşım, kaydedilen yapısal hareketleri daha net bir şekilde görselleştirmenizi sağlar. NOT: MDS'den konformasyonel toplulukların etkin temsilleri ve işlenmesi için öneriler Melvin ve ark.37'debulunabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>RMSD ve RMSF analizi<ol>
<li>Proteinlerin küresel kararlılığını analiz etmek ve farklı yapısal birimlerin esnekliğini incelemek için Cpptraj programı38 ile kök ortalamakare sapma (RMSD) ve kök-ortalama kare dalgalanma (RMSF) hesaplamalarını hesaplat. rmsd.in ve rmsf.in giriş dosyalarında, rms montajı için referans olarak ilk yapının omurga atomlarını (RMSD için) ve Cα atomlarını (RMSF için) belirtin. rmsd/rmsf.in dosyaları kehribar topoloji dosyaları(parm X.promtop)ve ilgili yörünge dosyaları(trajin prod.mdcrd)almak. Sonra Cpptraj -i rmsd/rmsf.inkomutunu çalıştırın. Çıktı verilerini çözümleme için çizin.</li>
		<li>Alternatif olarak, konformasyonel toplulukları hizalayın ve her kalıntıyı Cα atomu RMSD'ye göre renklendirin. Bunu yapmak için Chimera'daki konformasyonları açın ve Çöpçatan seçeneğiyle hizalayın.<ol>
<li>Araçlara gidin → Tasvir → Render'a öznitelik. Öznitelikleri olarak konformasyonel topluluk ve Cα RMSD kalıntıları seçin ve Tamam'ıtıklatın. Konformasyonların zincir izi daha sonra mavi → beyaz → kırmızıdan renklendirilecek ve sırasıyla yüksek, orta ve düşük yapısal stabilite bölgelerini yansıtacaktır.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hidrojen bağı analizi<ol>
<li>ATP ile yabani tip/ΔELREA EGFR'ler arasındaki hidrojen bağı etkileşimini analiz edin. Bu görevi yerine getirmek için bir Cpptraj komut dosyası hazırlayın, hbond.in. 3,5 Å'tan daha az veya eşit donör kabul mesafesi ve 135°'den büyük veya eşit bir bağ açısına sahip bir hidrojen bağı tanımlayın. Sadece atp ve EGFR arasındaki nointramol değişkeni yani hidrojen bağları ile moleküler hidrojen bağları için analiz belirtin (hbond Tüm nointramol dist 3.5 dışarı nhb.agr avgout avghb.dat). Komut dosyasını Cpptraj -i hbond.inolarak çalıştırın.</li>
		<li>Örneğin EGFR kinaz aktivitesi için önemli kalıntılar olan K745 ve E762 artıkları arasındaki moleküler etkileşimleri değerlendirmek için bu komut dosyasını kullanın. Bunu yapmak için, hidrojen bağı donör ve E762 hidrojen bağı kabul olarak k745 belirtin hbond.in ve buna göre komut çalıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Atomlar arasındaki mesafenin izlenmesi<ol>
<li>VMD'deyabani tip ve ΔELREA apo EGFR yörüngelerini açarak K745 ve E762 arasındaki mesafeyi ölçün. Mouse → etiketinetıklayarak Glu762'nin Cδ'sini ve Lys745'in Nz'sini →. Grafik → etiketleri → bağ → grafiğiile bir grafik çizerek simülasyon sırasında mesafeyi izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ücretsiz enerji hesaplamaları<ol>
<li>ATP ve yabani tip/ΔELREA EGFR'ler arasında ve yabani tip/A702V EGFR'lerin aktivatör ve alıcı kinazları arasında tahmini bağlayıcı serbest enerjileri hesaplamak için AMBER paketinde bulunan moleküler mekanik jeneralize edilmiş Doğal yüzey alanı (MM-GBSA) modül39'u kullanın. ΔELREA çalışmasında ATP'yi ligand ve EGFR reseptör olarak ayarlayın. A702V çalışmasında alıcı kiazını ligand, aktivatör kiazise reseptör olarak belirtiniz.</li>
		<li>İlk olarak, pbradii değerini mbondi2'yeayarlayan artık programında ligand, reseptör ve ligand-reseptör kompleksi PDB dosyalarını ayrı ayrı hazırlayın. PDB dosyaları için gaz fazı kehribar topolojisini (.prmtop) kaydedin ve (.inpcrd) dosyalarını koordine edin.</li>
		<li>Sonra, mmgbsa giriş dosyasında, mmgbsa.in, igb = 2 = 2 , saltcon = 0.1ayarlayın. Simülasyonların yörüngelerini, hazırlanan reseptör/ligand kehribar dosyalarını ve mmgbsa.in'daki parametreleri kullanarak bağlayıcı enerji hesaplamalarını Amber'da bulunan MMPBSA.py komut dosyası ile aşağıdaki şekilde gerçekleştirin: $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
</li>
		<li>Grafik çizerek çıktı verilerini, output.csv'yianaliz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+ErbB+signalling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Untangling the ErbB signalling network.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EGFR+family%3A+not+so+prototypical+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768(2014).</li>
<li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERBB+receptors%3A+From+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).</li>
<li>Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+of+ERBB+receptors+in+cancer%3A+Clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications.</a> Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).</li>
<li>Cerami, E., et al. cBioPortal for Cancer Genomics. , https://www.cbioportal.org (2020).</li>
<li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li>
<li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+mutations+in+lung+cancer%3A+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li>
<li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+%22never+smokers%22+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li>
<li>Chakroborty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+in+vitro+screen+for+activating+EGFR+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).</li>
<li>Leahy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+the+Epidermal+Growth+Factor+%28EGF%2FErbB%29+Family+of+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors.</a> Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).</li>
<li>Roskoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB%2FHER+protein-tyrosine+kinases%3A+Structures+and+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors.</a> Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).</li>
<li>Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+EGFR+exon+19+deletion+mutation+using+molecular+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation.</a> PLoS ONE. 14 (9), e0222814(2019).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+affect+key+pathways+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 455, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+somatic+ERBB4+mutations+in+non+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).</li>
<li>Soung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+the+ERBB4+kinase+domain+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers.</a> International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).</li>
<li>Tvorogov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+ERBB4%3A+selective+loss-of-function+phenotype+affecting+signal+transduction+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).</li>
<li>Hubbard, S. R., Till, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+kinase+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine kinase structure and function.</a> Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).</li>
<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+plasticity+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109 (3), 275-282 (2002).</li>
<li>Jura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+control+in+the+EGF+receptor+and+its+connection+to+general+kinase+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms.</a> Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).</li>
<li>Karplus, M., Kuriyan, M., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics and protein function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).</li>
<li>Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+catalytically+inactive+conformations+in+EGFR+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).</li>
<li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+to+determine+the+optimal+biological+dose+of+celecoxib+when+combined+with+erlotinib+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Allosteric+Mechanism+for+Activation+of+the+Kinase+Domain+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor.</a> Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).</li>
<li>Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+kinase+domain+alone+and+in+complex+with+a+4-anilinoquinazoline+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).</li>
<li>Sogabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Based+Approach+for+the+Discovery+of+Pyrrolo%5B3%2C2-d%5Dpyrimidine-Based+EGFR+T790M%2FL858R+Mutant+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).</li>
<li>Sali, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+protein+modelling+by+satisfaction+of+spatial+restraints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.</a> Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).</li>
<li>Yun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+lung+cancer-derived+EGFR+mutants+and+inhibitor+complexes%3A+mechanism+of+activation+and+insights+into+differential+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.</a> Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).</li>
<li>Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+binds+both+inactive+and+active+conformations+of+the+EGFR+tyrosine+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain.</a> Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).</li>
<li>Schrödinger LLC. Release 2018-3: Maestro. , https://www.schrodinger.com/maestro (2018).</li>
<li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCase%2C+DA+%22AMBER+2018%22">AMBER 2018</a>. , University of California. San Francisco. (2018).</li>
<li>Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ff14SB%3A+Improving+the+Accuracy+of+Protein+Side+Chain+and+Backbone+Parameters+from+ff99SB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Theory+and+Computation%22%5BJournal%5D)">ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li>
<li>Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simple+potential+functions+for+simulating+liquid+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Comparison of simple potential functions for simulating liquid water.</a> Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).</li>
<li>Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+polyphosphate+parameters+for+use+with+the+AMBER+force+field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field.</a> Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).</li>
<li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VMD%3A+Visual+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">VMD: Visual molecular dynamics.</a> Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).</li>
<li>Melvin, R. L., Salsbury, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ensembles+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Graphics+and+Modelling%22%5BJournal%5D)">Visualizing ensembles in structural biology.</a> Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).</li>
<li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTRAJ+and+CPPTRAJ%3A+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Theory+and+Computation%22%5BJournal%5D)">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li>
<li>Miller, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMPBSA.py%3A+An+Efficient+Program+for+End-State+Free+Energy+Calculations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Theory+and+Computation%22%5BJournal%5D)">MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).</li>
<li>Guha, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+tyrosine+phosphorylated+proteins+in+cells+expressing+lung+cancer-specific+alleles+of+EGFR+and+KRAS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).</li>
<li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+kinase+activity+of+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+exon+19+and+others+to+EGFR-tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).</li>
<li>Qiu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Activation+and+Inhibition+of+the+HER4%2FErbB4+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase.</a> Structure. 6 (3), 460-467 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada açıklanan protokol, EGFR kinazon alanının somatik mutasyonlarının aktive edilen lokal ve küresel yapısal değişiklikleri araştırmak için moleküler dinamik simülasyonlarının kullanılmasına odaklanmaktadır. Yabani tip ve mutant EGFR'lerin X-ışını kristal yapıları paha biçilmez yapısal bir kavrayış sağlasa da, bir veya birkaç statik temsili betimlener. Ancak, ErbBs biyolojik işlevinin doğasında enzimatik inaktif ve aktif tirozin kinaz arasında gerekli geçişler, hem yapı ve kinaz monomerler arasındaki intramoleküler etkileşimleri dinamik değişiklikler çağıran. Md simülasyonları böylece Vahşi tip yapısı, tanıtılan ΔELREA silme mutasyonu ve A702V mutasyonu da dahil olmak üzere EGFR tirozin kinaz etki alanının dinamik doğasını araştırmak için yapılmıştır. Bu simülasyonlar, bu mutasyonların yapılardaki olası rolünü ve tirozin kinaz alanının konformasyonu üzerindeki etkilerinin EGFR kinaz aktivitesinde deneysel olarak gözlenen artışlara nasıl yol açacağını açıklığa kavuşturmada başarılı oldu.
Bu protokoldeki önemli bir adım mutasyonun etkisini değerlendirmek için ilgili bir yapının kullanılmasıdır. İlgili bir simülasyon girdi yapısı seçmenin bir yolu, mutasyonun statik 3B yapısındaki yerini görselleştirmek ve komşu amino asitler ve yapısal birimler açısından olası etkisini incelemektir. Bu çalışmada, örneğin, A702V EGFR mutasyonu asimetrik dimer arayüzünü oluşturan yan yana B segmentinde bulunduğundan, monmeryerine simülasyon için dimer yapısının kullanılması önemlidir. Monomerik bir yapının kullanılması alıcı kilazın yan yana B segmentini çözücüye maruz bırakarak, mutasyonla daha büyük bir hidrofobik kalıntıya ve aktivatör kisenin C-lobe kalıntılarından izolösin 941 ile etkileşimlere karşı güçlendirilerek dengeleyici etkileşimlerden mahrum bırakacaktı. Ayrıca, bir PDB dosyasındaki koordinatlarla temsil edilen 3B yapının, çalışma için kullanılması gereken biyolojik olarak ilgili yapıyla örtüşmemesi de dikkat çekicidir. Örneğin, ErbB4, PDB kodu 3BCE yapısı ile, PDB koordinatları bir düzeltici karşılık gelir, ancak bu kristal kişiler nedeniyle (bu yapıgörselleştirirken monomerler arasında birkaç kişi görülür). PDB dosyasındaki matrisler ( örneğin, Chimera içinde) kristalografik olarak ilgili yapıları yeniden oluşturmak için kullanılabilir, orijinal yayında bildirildiği gibi biyolojik olarak ilgili 3D yapıya karşılık gelen zincirleri tanımlamak için görselleştirilebilir42. Protokolün bir diğer önemli adımı da, farklı döngü bölgelerinde ve özellikle mutasyonun çevresinde bulunan yerlerde eksik amino asitlerin oluşturulması gibi simülasyon giriş yapısını düzgün bir şekilde hazırlamaktır. PDB'de çok sayıda yabani tip EGFR yapısı bulunmasına rağmen, sadece sınırlı sayıda mutant EGFR yapısı mevcuttur. Sonuç olarak, mutant yapıların da modelalınması gerekir; A702V gibi tek bir kalıntı mutasyonu için, Chimera kalıntımutasyonetmek için kullanılmıştır; oysa ΔELREA silme mutasyonu için Model kullanılmıştır.
Simülasyon giriş dosyalarında kullanılan çeşitli parametreler - örneğin, en aza itimasyon döngülerinin sayısı, sistemi tek seferde istenilen sıcaklığa ısıtmak veya bunun yerine birkaç ara sıcaklıkta yavaş yavaş ısıtmak, denge ve üretim simülasyonları için zaman dilimi - çalışmanın molekülü, çalışmanın amacı ve kişinin kendi tercihleri temel alınarak değiştirilebilir. MD simülasyonları gerçekleştirirken, giriş dosyalarından, kullanılan simülasyon yazılımıyla ilgili sorunlardan ve hatta bir kullanıcı hatasından kaynaklanabilecek hatalarla karşılaşmak da yaygındır. Bu nedenle, herhangi bir hata iletileri dikkatle inceleyerek hataların kaynağını anlamak için çok önemlidir. Simülasyon programlarının çoğunda, kullanıcıların yazılım geliştiricilere ve diğer kullanıcılara çoğu sorunun çözülebileceği sorular sorabilecekleri bir posta listesi bulunur. Ayrıca, kullanım kılavuzları varsayımlar ve sınırlamalar da dahil olmak üzere simülasyon protokolünün ayrıntılarını anlamak için önemli yardım sağlar. MD simülasyonu moleküllerin dinamik özelliklerini keşfetmek için önemli bir araç olsa da, hesaplama sonuçlarının geçerliliklerini değerlendirmek için diğer bilgi kaynaklarıyla birlikte dikkatle değerlendirilmesi gerektiğini unutmayın. Mümkün olduğunda, özellikle ilgili ıslak laboratuvar deneysel çalışmaların yapıldığı yerlerde, yapısal yorumlama için sonuçlar sağlamanın yanı sıra hipotezleri test etmek için yapısal gözlemlere dayalı deneyler öneren, üzerinde uzman araştırmacılarla birlikte çalışın.
Bu çalışmada protokol, ΔELREA ve A702V mutasyonlarının EGFR kineler yapıları üzerindeki dinamik yapısal etkilerinin incelenmesinde etkili olmuştur. Simülasyonlar, ΔELREA'nın işlevsel olarak gerekli αC sarliğini dizginlediğini ve inaktif kinden stabilize aktif kinazaya konformasyonel bir değişimi desteklediğini ortaya çıkardı. Simülasyon sonuçları, tirozin kinaz inhibitörlerinin ΔELREA deletion mutasyonu ve yabani tip EGFR'ye sahip akciğer kanseri hücre hatları üzerindeki etkilerini gösteren ilaç yanıt verileri ile bağımsız olarak desteklenir ve burada aktif kinaz konformasyonu12tanıyan ilaçların daha fazla inhibisyonu rapor edilmiştir. A702V mutasyonu ile, MD simülasyonları, vahşi tipe kıyasla, aktivatör alıcısı kinase arabiriminin artan stabilizasyonunun yanı sıra aktivatör ve alıcı kigazının birbirleri için daha yüksek afinitesinin arttığını ve EGFR kisinin aktif konformasyonunun sürdürülmesini desteklediğini göstermektedir. Alıcı kininin yan yana b segmentinde bulunan A702V mutasyonu, aktivatör kinaz ile hidrofobik etkileşimleri artıracak ve aktive halsüresini uzatmak için çalışacaktır. A702V mutasyonu büyüme faktörü yokluğunda hücre sağkalımını destekler ve EGFRmutasyonlarıiçin in vitro taramada tanımlanmış9.

EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 ve ErbB4/HER4 olmak üzere dört üyeden oluşan tirozin kinazlarının (RTK) insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi (ErbB) dört üyeden imal edin. ErbB reseptörleri hücre büyümesi ve çoğalması, farklılaşma, göç ve sağkalım1,,2gibi temel hücresel süreçleri düzenler ve böylece güçlü proto-onkogenlerdir. ErbB reseptörlerinin anormal aktivitesi, özellikle EGFR ve ErbB2, sık sık kanser terapötikleri için ErbB reseptörleri anahtar hedefleri yapma insan kanserleri ile ilişkili olmuştur2,3.
ERBB genlerinin çeşitli somatik değişiklikler insan maligniteleribildirilmiştir 3,4,5. En iyi karakterize örnekler arasında küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (NSCLC) EGFR kigaz etki alanında tekrarlayan, aktive nokta mutasyonları ve kısa kare deletions sayılabilir. Bu EGFR mutasyonları kanser büyümesinin temel itici lerini temsil eder ve kanserilaçlarınıhedefleyen EGFR'ye duyarlılığı tahmin eder 6,7,8. Ancak, çoğu kanserde, EGFR'deki somatik mutasyonlar bu tekrarlayan "sıcak noktalar" dışında meydana gelir ve reseptörün 1210 kalıntı süresinin tamamına dağılır. Nitekim, EGFR primer dizi boyunca kalıntılar çoğu insan kanserimutasyonauğramış olduğu bulunmuştur 9 . Bununla birlikte, birkaç sıcak nokta dışında, kanserle ilişkili EGFR mutasyonlarının büyük çoğunluğunun işlevsel önemi bilinmemektedir.
ErbB'lerin monomerik yapısı büyük bir amino terminal hücre dışı etki alanından oluşur ve ardından hücre içi tirozin kinaz etki alanına ve hücre içi sinyal proteinleri için yerleştirme alanları içeren C-terminal kuyruk bölgesine giden tek bir transmembran sarlis takip eder. Ligand bağlama, hücre dışı etki alanında dramatik bir konformasyonel değişimi tetikler, bu da simetrik olarak birbirinin üzerinde çapraz olan ve aromatik/hidrofobik yüzeyleri ile etkileşime giren dimerizasyon kollarını açığa çıkararak reseptör dimerlerinin oluşumunu kolaylaştırır. Reseptör dimer oluşumu üzerine tirozin kinaz etki alanları asimetrik temas(Şekil 1),reseptör monomerlerin C-terminal kuyrukları fosforilat kinazların aktivasyonu ile sonuçlanan, ve daha sonra downstream sinyal aktivasyonu10,11.
<img alt="EGFR sinyalizasyon şeması; reseptör yapısı, hücre dışı kinaz alanına, membran yerleşimi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: EGFR dimer yapısı. EGFR, hücre dışı etki alanları büyüme faktörlerini (EGF, epidermal büyüme faktörü) bağladığında dimerizeeder. Alıcı kinaz etki alanı daha sonra aktivatör kinaz etki alanı ile asimetrik etkileşim yoluyla aktive edilir ve C-terminal kuyrukları tirozin artıklarında otofosforile edilir (Tamirat ve ark.12'dendeğiştirilmiştir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Monomer dimer geçişleri sırasında meydana gelen dinamik yapısal yeniden düzenlemeler <img align="center" src="/files/ftp_upload/61125/61125eq1.jpg" alt="Statik denge diyagramı, ΣFx=0, kuvvet dengesi yöntemi, eğitim fiziği kavramı." data-altupdatedat="1754922859000"> nedeniyle, asimetrik dimer oluşumu ile ilişkili kinizas aktivasyonu ile birlikte, reseptör yapısının tam uzunluğu boyunca mutasyonlar potansiyel reseptör fonksiyonu üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Burada mutasyon ve görüntülemenin modellenmesinin işlevin sonuçlarını açıklamak için yeterli olduğu önceki çalışmalarımızdan birkaç örnek açıklıyoruz.
Örnek 1: Bildirilen mutasyonlardan biri, ErbB413'teD595V , ErbB4 dimerizasyon ve fosforilasyonun artmasına yol açmıştır14. Mutasyonun yerinin görüntülenmesi gözlenen fonksiyonel etkileri anlamada kritik bir faktördü: D595V ektoetkimin dimerik kollarının simetrik kesişmesinde meydana gelmiştir(Şekil 2A). Kollar büyük ölçüde aromatik ve hidrofobik, ve valine tarafından kutup aspartik asit yerine "yapışkan" hidrofobik etkileşimleri artırmak için beklenebilir, dimer stabilize ve dolayısıyla fosforilasyon yer aldığında zaman süresini artırmak14. İlk başta her kolda aspartat bulmak için bir sürpriz oldu, ama geriye bakıldığında bir aktivite için bir zamanlama mekanizması olarak düşünebilirsiniz, polar asit yan zincirleri bozulmamış dimer yakınlık ve yaşam süresini azaltmak ve dolayısıyla kizim aracılı fosforilasyon ve sinyalizasyon sınırlamak nerede. Valine tarafından değiştirilmesi daha sonra daha erbB4 dimer stabilize ederek bu koruma kaldıracağını.
<img alt="Protein-ligand etkileşimi, moleküler diyagram, amino asit kalıntılarının gösterilmesi, yapısal analiz." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: Kiaz-ölü ErbB4 üreten mutasyon ve mutasyonları aktive eden bir ErbB4'ün yeri. (A) D595 (D595V mutasyonu aktive) ErbB4 ektodomain modelinin aromatik / hidrofobik dimerik kollarında yer alır; büyüme faktörü bağlama silah ilişkilendirmek; (yakındaki kalıntılar çubuk olarak gösterilir). (B) ErbB4'te, G802 (G802dup mutasyonunu devre dışı katarak) ATP'nin adenin halkası ve katalitik D861 (d861Y mutasyonunu devre dışı) etrafında ki bağlama cebinin oluşmasına yardımcı olur ve hem Mg2+ (gösterilmez) hem de γ fosfat grubunu bağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Örnek 2: Kiaz etki alanının ATP bağlayıcı bölgesini hedef alan somatik mutasyonların sinyalizasyonu ndan aciz bir bozulmuş veya kiyer-ölü reseptöre yol açan enzimatik aktiviteyi değiştireceği veya ortadan kaldıracağı tahmin edilebilir. Meme, gastrik, kolorektal veya NSCLC15hastalarından bildirilen dokuz mutasyondan ikisi, test edildiğinde yüksek oranda azalmış fosforilasyon aktivitesi16: G802dup (G → GG) ve D861Y. Tirozin kinaz etki alanı yapısının ATP bağlama bölgesinde(Şekil 2B):esnek glisin, çoğaltılmış, adenin halka bölgesini değiştirir ve terminal fosfatların yakınındaki hantal tirozin ile değiştirilen küçük aspartik asit mg2+-ATP'nin bağlanmasını fiziksel olarak önler. Ancak, ErbB4 ErbB2 ile heterodimer oluşturabilirsiniz beri - ErbB2 bir büyüme faktörü bağlamaz ve heterodimerize için yapar bir ErbB ile ilişkibağlıdır - ErbB2(aktif)-ErbB4 (kinaaz-ölü) heterodimer Erk / Akt sinyal yolu ile hücre çoğalmasını teşvik edecek henüz hücreler kiaz-ölü ErbB4 ve STAT5 yol aktivasyon eksikliği nedeniyle ayırt olmaz16.
Daha yakın tarihli çalışmalarda, ErbB'lerin dinamik hareketlerinin bazı mutantların ErbB fonksiyonu, özellikle tirozin kinaz etki alanı içinde meydana gelen mutasyonlar üzerindeki etkilerini anlamak için önemli olduğu ortaya çıkmıştır. Tirozin kinaz etki alanı bir N-lob oluşur (özellikle β-levhalar) ve C-lob (büyük ölçüde alfa sarmal), ATP bağlanır katalitik site ile ayrılır. N-lobe αC helis ve P-loop içerir, aktivasyon ise (A-loop) ve katalitik döngüler C-lobmevcuttur 17,18,19. Tirozin kinaz etki alanının kristal yapıları iki inaktif konformasyon ortaya, yapıların çoğunluğu Src benzeri inaktif duruma sahip. Aktif konformasyonda A-loop noktalarının ATP bağlama bölgesine doğru katalitik aspartat ve αC sarlis ATP bağlama cebine ("αC-in" konformasyonu) doğru yönlendirilir ve güçlü bir glutamat-lizin-ion çifti etkileşimi oluşturur.
ErbB'ler ve bileşen kiazaz etki alanı son derece dinamik varlıklar olduğundan ve özellikle mutasyonların fonksiyon ve biyolojik aktivite üzerindeki etkilerinin ErbB'lerin konformasyonel durumlarıyla sıkı bir şekilde bağlantılı olduğu durumlarda, mutasyonların yaşayacakları dinamik değişikliklerin aralığına göre değerlendirilmesi önemlidir. ErbB'lerin X-ışını kristal yapıları, mutasyonun dinamik sonuçlarını anlamakla ilgili olabilecek veya olmayan 3B yapısının statik anlık görüntülerini sağlar. Üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip "enerji manzarasına" karşılık gelen dinamik değişikliklerin aralığını araştırmak için moleküler dinamikler (MD) simülasyonları yaygın olarak20olarak kullanılmaktadır. Tirozin kinaz etki alanı içinde lokal konformasyonel değişikliklere yol açacak mutasyonlar veya bir kompleksin stabilizasyonu durumunda, 100 ns sırasına göre simülasyonlar yeterli olabilir. Ancak, daha büyük ölçekli konformasyonel değişiklikler (örneğin, kizaz etki alanının aktif ve etkin olmayan konformasyonları arasındaki geçişler) daha uzun bir simülasyon süresi gerektirir - mikrosaniye sırasına göre21.
Aşağıda açıklanan protokole göre tirozin kinaz etki alanı içinde iki aktive mutasyonu göz önünde bulundururuz(Şekil 3). Her iki mutasyon da kizazın aktif olup olmadığını belirleyen lokal konformasyonel değişiklikler yaşayan konumlarda kizaz etki alanı içinde yer alır ve bu nedenle her iki durumda da MD simülasyonları uygulanır. İlk durumda, doğrudan ATP bağlama sitesi ve EGFR alıcı kiyaz etki alanının katalitik makine etkileyen değişiklikleri düşünün, özellikle yaygın NSCLC4karıştığı bir exon 19 silme mutasyonunun sonuçlarını inceleyerek,7. Δ746ELREA750 mutasyonu, αC sarikten önceki β3-αC döngünün uzunluğunu azaltır - kinaz aktivasyonundaki bağlayıcı/aktif bölgeye doğru hareket eden ve ATP ile etkileşim için lizini konumlandırarak helis ile K745 arasındaki kritik elektrostatik etkileşimin oluşturulmasına katılan sarilik - aktivasyon için etki alanını12. İkinci olguda, egfr A702V mutasyonu düşünün, yeni bir kazanç-fonksiyon aktive mutasyon iScream platformutarafından ortaya 9 ve bir NSCLC hasta da tanımlanan22. Alanine-702 alıcı kizaz etki alanı üzerinde alıcı ve aktivatör kinaz etki arayüzünde yan yana segment B yer almaktadır, hangi bu asimetrik kiaz azmin kompleksi ve kiyaz konformasyonel değişiklikler aktivasyon için gereklidir9.
<img alt="Protein etkileşim diyagramı; Aktivatör ve alıcı kinazlar, etiketli sarmallara sahip yapıdır." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: EGFR asimetrik kinaz etki dimer. A702V mutasyonu aktivatör ve alıcı kinasan etki alanlarının kritik arayüzünde, αC sarlisine bitişik ve aktivatör kisenini izolucine 941'e yakın bir yerde yer alır. Asimetrik dimer oluşumu ile indüklenen konformasyonel değişiklikler kinaz aktivasyonuna yol açar. ELREA dizisini içeren β3-αC döngüsü αC sariktan hemen önce gelir; aktivasyon sırasında αC sarlis ivediye doğru ATP bağlama bölgesine doğru ilerler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>Amber yazılımı</td><td>Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco</td><td>Sürüm 2018</td><td>Yürütülebilir</td></tr><tr><td>Chimera programı</td><td>Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco'da Biyohesaplama, Görselleştirme ve Bilişim Kaynağı</td><td>Sürüm 1.13.1</td><td>Yürütülebilir</td></tr><tr><td>EGFR yapı dosyaları</td><td>Protein Veri Bankası</td><td></td><td>EGFR yapılarının 3D koordinatları</td></tr><tr><td>Maestro</td><td>Schr&ouml; dinger LLC</td><td>Sürüm 2018-3</td><td>Yürütülebilir</td></tr><tr><td>Modeller programı</td><td>Andrej & Scaron; ali Lab, Biyofarmasötik Bilimler ve Farmasötik Kimya Bölümleri, California San Francisco</td><td></td><td>Chimera programına dahil VMD</td></tr><tr><td>yazılımı Teorik</td><td>ve Hesaplamalı Biyofizik Grubu, Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi</td><td>Sürüm 1.9.3</td><td>Yürütülebilir</td></tr></tbody></table>

egfr somatik mutasyonları moleküler dinamik simülasyonu ile aktive etmenin yapısal etkilerinin deşifre edilmesi

Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Reseptör tirozin kinazlarının (RTK) epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesinde (ErbB) meydana gelen çok sayıda somatik mutasyon kanser hastalarından bildirilmiştir, ancak nispeten az sayıda test edilmiş ve ErbBs fonksiyonel değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir. ErbB reseptörleri ligand bağlanması üzerine küçültülür ve aktive edilir ve reseptörlerin dinamik konformasyonel değişiklikleri aşağı sinyalin indüksiyonu için doğaldır. EGFR fonksiyonunu değiştirmek için deneysel olarak gösterilen iki mutasyon için, A702V ve Δ746ELREA750 silme mutasyonu, moleküler dinamiklerin (MD) simülasyonlarının (1) mutant tirozin kinaz yapısının konformasyonel stabilitesini vahşi tip EGFR ile karşılaştırıldığında nasıl inceleyebildiğini aşağıdaki protokolde gösteriyoruz; (2) yapısal sonuçları ve konformasyonel geçişler ve gözlenen fonksiyonel değişikliklere ilişkileri; (3) mutasyonların bağlayıcı ATP'nin gücü ve aktif asimetrik dimer'deki kizaz etki alanları arasındaki bağlanma üzerindeki etkileri; ve (4) mutasyonların aktive enzimle ilişkili EGFR bağlama bölgesi içindeki anahtar etkileşimler üzerindeki etkileri. Protokol, yapısal dinamikleri ve biyolojik fonksiyonla ilişkiyi araştırmak için MD simülasyonları kullanarak protein yapılarının araştırılmasında daha genel olarak yararlı olabilecek ayrıntılı bir adım adım prosedürün yanı sıra kılavuzluk da sağlar.

Açıklanan protokol, ΔELREA ve A702V mutasyonlarının EGFR kigaz yapısı üzerindeki yapısal etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Protokolün bir uygulaması, MUTASYONların MD simülasyonlarından RMSD ve RMSF değerlerini hesaplayarak lokal yapısal/konformasyonel stabilite üzerindeki etkisini araştırmaktı. A702V mutasyonu juxtamemembran B segmentinde yer alması nedeniyle, başlangıç yapısına göre alıcı kimyonun bu segmentinin RMSD'si hem yabani tip hem de A702V EGFR'ler için hesaplanmıştır. Sonuç (Şekil 4A)<img alt="Protein dinamiği analizi; EGFR simülasyon grafikleri A/B, konformasyonel değişiklikler C; moleküler çalışma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig4v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="EGFR protein bağlanma analizi; çubuk grafik, moleküler yapı diyagramı, hidrojen bağı grafiği." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig5v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Bağlayıcı serbest enerji grafiği; EGFR, A702V, ΔELREA varyantları için ΔG (kcal/mol) ve zaman (ns)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig6v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="EGFR protein yapı diyagramları, vahşi tip ve ΔELREA, αC sarmal ve A-döngü değişikliklerini gösterir." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61125/61125fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61125/61125fig7v2large.jpg" target="_blank"></a>

Bu protokolün amacı, EGFR kinazproteininin aktive mutasyonları nedeniyle meydana gelen dinamik yapısal değişiklikleri incelemek için moleküler dinamik simülasyonları kullanmaktır.

EGFR Somatik Mutasyonları Moleküler Dinamik Simülasyonu ile Aktive Etmenin Yapısal Etkilerinin Deşifre Edilmesi

Numerous somatic mutations occurring in the epidermal growth factor receptor (EGFR) family (ErbB) of receptor tyrosine kinases (RTK) have been reported ...

Moleküler dinamik simülasyon moleküler hareketleri keşfetmek için kullanılabilecek ve biyokimyasal ve hücresel fonksiyonu anlamak için çok önemli konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkarabilir bir hesaplama tekniğidir. Makromolekülün erişebildiği dinamik hareket aralığını araştırmak zordur. Moleküler dinamik simülasyonların sonuçlarının deneysel verilerle birlikte kullanılması, bunların işlevsel öneminin değerlendirilmesine olanak sağlar.Kanser hastalarında gözlenen mutasyonların EGFR hedefleme onaylarını ve ligand bağlanmasını nasıl etkilediğini moleküler dinamik simülasyonlar kullanarak göstereceğiz. Yabani tip apo aktif EGFR'yi hazırlamak, kinaz yapımızı açmak, Kymera görselleştirme programını açın ve dosya menüsünün altında ID.Select Protein Veri Bankası veritabanını seçin ve Protein Veri Bankası 2GS2 kodunu belirtin. Eksik yapısal 2GS2 elemanları oluşturmak için, diğer EGFR yapılarından bu segmentleri elde.EGFR'de alanin 750 ELREA silme için beş kalıntı glutamat 746 oluşturmak için, vahşi tip 2GS2 sırasını açmak için sık kullanılan, sıralı ve gösteri sırasını tıklatın. Ve ortaya çıkan sıra penceresinde, tıklayın ve silme mutant FASTA biçim sırasını seçmek için sıra ekleyin. Hizalama penceresinde, yapı ve model veya homoloji seçin.Açılır pencerede, 2GS2 bileşik yapısını şablon olarak ve mutant sırasını modellenecek sorgu olarak belirtin, ardından zDOPE puanına ve görsel incelemeye dayalı olarak ortaya çıkan modellerden bir mutant modeli seçin. Yabani tip apo inaktif EGFR kinaz yapısını hazırlamak için Protein Veri Bankası yapısını 2GS7 açın ve diğer EGFR yapılarından eksik segmentleri ekleyerek silme mutant formunu nmodela edin. ATP'ye bağlı yabani tip aktif EGFR kinaz yapısını hazırlamak için, protein veri bankası yapısını temel yapı olarak kullanın, diğer EGFR yapıları kullanılarak eksik segmentleri oluşturmak ve modelleyiciyi kullanarak silme mutant formunu modellemek.Yabani tip EGFR asimetrik dimer yapısını oluşturmak için, Kymera'da 2GS2'yi açın ve araçları, yüksek sıralı yapıyı ve birim hücreyi asimetrik düzenlemede aktivatör ve alıcı kinazlarını içeren biyolojik montaja dönüştürün. 2GS2 yapısını seçin ve kopyaları girin, ardından simetri işlemlerinden kaynaklanan dimer'ın birden fazla kopyasından tek bir asimetrik dimer seçin ve kaydedin. Alanine 702 valine mutant oluşturmak için, valine alanine 702 yerine araçları seçin, yapı düzenleme ve rotamers.Maestro'daki yapıları açın ve protein hazırlama sihirbazı düğmesini tıklayın, sonra hidrojen atomları ekleyin ve eksik yan zincir atomlarını doldurun ve ön işlem tıklayın. pH 7.0'daki iyonizebilir kalıntıların protonasyon durumlarını belirlemek için, asparagin, glutamin ve histamin kalıntılarının hidrojen bağlanması için yönünü optimize etmek için PROPKA'yı hassaslaştır'ı tıklatın ve sonra yapıyı en aza indirin. Simülasyon sistemini kurmak için LEAP programını açın ve Amber FF14SB kuvvet alanını ve TIP3P su moleküllerini ithal edin.ATP'ye bağlı sistemler için, ATP için alma parametreleri ve yapıyı yükleyin. Proteinin yüzey atomlarından her yöne 10 angstrom uzanan açık TIP3P su molekülleri ile bir sekizahedral kutu içinde yapısı solvate. Kemer sistemini kontrol edin ve nötralize etmek için gerekli iyonları ekleyin.Biyomoleküler sistemleri yeterince modellemek için, sistem tuz konsantrasyonu 0,15 molar getirmek için simülasyon kutusuna ek sodyum ve klorür atomları ekleyin, sonra oluşturmak ve sonraki üretim simülasyonu için girdi olarak hizmet vermek için sistemin topoloji ve koordinat dosyaları kaydetmek. Amber kullanarak, başlangıçta enerji herhangi bir olumsuz yapılandırmaları atlatmak için simülasyon sistemi en aza indirmek. En küçük leştirme girişi dosyasında, en dik iniş algoritmasının döngü sayısını belirtmek için toplam en küçük leştirme döngüsü ve döngü sayısı için maksimum döngü değişkenini ayarlayın.Emniyet maskesi parametresi tarafından belirtilen solute atomlara kısıtlama kuvveti uygulamak için kısıtlama ağırlığı değişkenini kullanın. Mol angstrom kare başına 25 ila 0 kilokalori solute atomlar uygulanan kısıtlama yavaş yavaş düşürerek, birden fazla adımda en aza indirme yürütmek, sonra en aza indirme çalıştırmak için komutu kullanın. Sistemi 0'dan 300 Kelvin'e kadar 100 pikosaniye ısıtın ve solute atomlar üzerinde kare angstrom kısıtlaması başına 10 kilokalorilik azı mili ayarlamak için komutları kullanın.Sonra ısıtma yürütmek için komutu kullanın. Sistemi izobarik bir topluluk altında 900 pikosaniye için dengeleyin ve uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için dokuz angstrom mesafesi kesiği ayarlayın, solute atom kısıtlamasını yavaş yavaş mol angstrom kare başına 0,1 kilokaloriye düşürün ve dizginsiz beş nanosaniyelik bir simülasyonla dengeyi kesinleştirin. Belirtilen komutla eşitleme çalıştırın.Her 10 pikosaniyede bir kaydedilen konformasyonlarla üretim simülasyonuna 100 nanosaniye boyunca yapılmasına izin verecek şekilde metni ayarlayın ve simülasyonu belirtildiği gibi komutla çalıştırın. Vahşi tip ve mutant EGFR kinaz simülasyonları sırasında konformasyon örneğini görselleştirmek için Amber topoloji dosyalarını ve Visual Molecular Dynamics'teki ilgili yörünge dosyalarını açın. Ve uygun ikincil yapı gösterimleri kullanarak, kaydedilen yörüngeden proteinlerin genel yapısal dinamiklerini analiz edin.Daha sonra atomlar ve ilgi artıkları arasındaki belirli etkileşimleri görüntüleyin, katali esansiyel lisin 745-glutamat 762 tuz köprüsü gibi. Alternatif olarak, Simülasyon sırasında alınan birden fazla konformasyonu Protein Veri Bankası formatında kaydedin ve Kymera'daki konformasyonları açın. İlk veya ortanca yapıdaki yapıları üst üste beklemek ve kaydedilen yapısal hareketlerin daha net bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlamak için, ortayapıyı katı ve hizalanmış yapıların geri kalanını soluk beyaz olarak görüntülemek için çöpçatan seçeneğini kullanın.Vahşi tip ve mutant EGF'lerin küresel kararlılığını analiz etmek ve farklı yapısal birimlerin esnekliğini incelemek için Amber tipolojisini ve buna karşılık gelen yörünge dosyalarını ithal edin. Kök ortalama kare sapma giriş dosyasında, kök ortalama kare uydurma için referans olarak ilk yapının omurga atomları gösterir. Kök ortalama kare dalgalanma giriş dosyasında, kök ortalama kare uydurma için referans olarak ilk yapının C-alfa atomları gösterir.Ardından CPPTRAJ programı yla analizi çalıştırın ve çıktı verilerini çizin. Alternatif olarak, konformasyonel toplulukları hizalamak ve C-alfa atom kökü ortalama kare sapmadayalı her kalıntı renklendirmek için, Kymera konformasyonları açın ve çöpçatanlık seçeneği ile hizalamak. Araçları, tasviri ve öznitelik ile işlemeyi seçin.Konformasyonel toplulukların artıklarını seçin ve C-alfa kökü ortalama kare sapması öznitelikleri olarak ayarlayın, sonra Tamam'ı tıklatın. Konformasyonların zincir izi sırasıyla yüksek, orta ve düşük yapısal kararlılık bölgelerini yansıtan mavi, beyaz veya kırmızı renkte olacaktır. ATP ile hem vahşi tip hem de silme EGF'leri arasındaki hidrojen bağı etkileşimlerini analiz etmek için, bu görevi yerine getirmek için bir CPPTRAJ komut dosyası hazırlayın. Moleküler hidrojen bağlarının analizini sadece nointramol değişkeni ile belirtin ve donör kabul mesafesi 3,5 angstrom'dan daha az veya eşit ve 135 dereceden daha büyük veya eşit bir bağ açısına sahip bir hidrojen bağı tanımlayın.Örneğin katalitik olarak önemli lizin ve glutamat artıkları arasındaki moleküler etkileşimleri değerlendirmek için, lizini hidrojen donör ve glutamat olarak kabul edici kalıntılar olarak belirtin ve sonucun analizini sağlayacak şekilde komut dosyasını çalıştırın. ATP ile hem yabani tip hem de silme EGFR'leri arasındaki bağlayıcı serbest enerjileri hesaplamak için, LEAP programında gaz fazı ligand reseptörü ve ligand reseptör kompleksi Protein Veri Bankası dosyalarını hazırlayın ve ATP'yi ligand ve EGFR reseptör olarak ayarlayın. Genelleştirilmiş radyo değerini M Bond I2 olarak ayarlayın. Sonra Amber topolojisi oluşturmak ve gaz faz Protein Veri Bankası dosyaları için dosyaları koordine.Benzer şekilde, yabani tip ve alanin 702 valine EGFR aktivatör ve alıcı kinazları arasında bağlayıcı serbest enerjileri hesaplamak için, alıcı kinaz'ı reseptör olarak ligand ve aktivatör kinaz olarak belirtin ve ilgili topolojiyi ve koordinat dosyalarını kaydedin. Moleküler mekaniği genelleştirilmiş bir yüzey alanı giriş dosyası hazırlayın ve IGB değerini ikiye, saltcon'u ise 0,1'e ayarlayın. Sonra mmpbsa kullanarak.py script Amber mevcuttur, bağlayıcı enerji hesaplamaları yürütmek ve çıkış verilerini analiz etmek için gösterildiği gibi komutu girin. Bu temsili sırasında 100 nanosaniye simülasyon, alanine 702 valine mutant yabani tip EGFR ile karşılaştırıldığında sıkı hidrofobik etkileşimler nedeniyle büyük olasılıkla yan yana B segmentinin artmış konformasyonel stabilite gösterdi. Alanine 702 valine mutant da aktivatör ve alıcı kinases vahşi tip EGFR göre arasında bağlayıcı daha düşük bir serbest enerji sergiledi, aktif EGFR kinaz konformasyon korumak daha olumlu dimer etkileşimleri temsil eden.Silme mutasyonunun simülasyonu, işlevsel olarak anahtar alfa C-sarmalının vahşi tip EGFR'ye göre daha düşük C-alfa atom dalgalanmalarına yol açarak EGFR aktif durumunun süresini uzattı. Silme mutasyonu ayrıca, egfr enzimatik aktivitesi için yabani tip EGFR'ye kıyasla önemli bir etkileşim olan lizin 745 ve glutamat 762 yan zincir polar atomları arasında sık hidrojen bağları oluşmasına neden oldu. Ayrıca, ATP ve EGFR arasındaki hidrojen bağlarının sayısı silme mutantı için vahşi tip EGFR'ye göre daha fazlaydı.Silme mutasyonu aynı zamanda EGFR inaktif durum alfa C-helis, aktif duruma geçiş sırasında beklenen yapısal bir değişiklik içe doğru hareket sonuçlandı. Buna karşılık, vahşi tip inaktif EGFR alfa C-sarmal ilk konformasyon korudu. Mutasyonların etkisini değerlendirmek için yapıların uygun konformasyonel durumlarını seçmek ve bu yapıları düzgün bir şekilde hazırlamak ve denedirmek önemlidir.Bu teknikler arasındaki sinerji sonuçların yorumlanmasına fayda sağladığından ve ek ıslak laboratuvar deneylerini bilgilendirebildiği için moleküler dinamik simülasyonları deneysel çalışmalarla birleştirmek önemlidir.

deciphering-structural-effects-activating-egfr-somatic-mutations-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Bu protokol, COS7 fibroblast hücreleri üzerindeki epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) etiketlenmesini ve ardından hidratlı durumdaki tüm hücrelerin korelasyon ışık ve elektron mikroskobunu açıklar. Etiket, floresan kuantum noktaları içeriyordu. Protokol, EGFR'nin stokiyometrisini tek molekül seviyesinde incelemek için kullanılabilir.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

EGFR TKI ve MET-TKI kanser hücrelerinin içinde çift direnç kurmak için bir vitro yöntemi açıklanmıştır. MET-güçlendirme ile EGFR-TKI tedaviye rağmen hastalık ilerleme sergileyen EGFR mutasyon, hastalar için tedavi geliştirmek için yararlı bir yöntemdir. Ayrıca diğer molekülleri hedefleme inhibitörleri için değiştirilebilir.

2-adım doz-yükseltme yordamını akciğer adenokarsinom hücre Vitro EGFR-TKI ve bir araya geldi-TKI çift direnç kurulması

Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Mevcut protokol bir biyomoleküler simülasyon paketi kullanır ve vahşi tip kaspaz ve mutant formlarını modellemek için moleküler dinamik (MD) yaklaşımını açıklar. MD yöntemi, kaspaz yapısının dinamik evrimini ve mutasyonların veya post-translasyonel modifikasyonların potansiyel etkisini değerlendirmeye izin verir.

Kaspaz Mutasyonlarının ve Post-Translasyonel Modifikasyonun Moleküler Modelleme Yaklaşımlarıyla Araştırılması

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Keşfedin EGFR somatik mutasyonlarının moleküler dinamik simülasyonları ile yapısal etkilerini. Amber yazılımı kullanarak kanser tedavileri için ilaç tasarımına yönelik önemli bilgiler elde edin.

EGFR Somatik Mutasyonları Moleküler Dinamik Simülasyonu ile Aktive Etmenin Yapısal Etkilerinin Deşifre Edilmesi

Daha fazla video keşfet