İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol için diferansiyel santrifüj kullanmanın avantajı, litreye kadar kolayca ölçeklendirilebilir olması ve bu nedenle eksozomları birincil fibroblastlardan izole etmek için ideal olmasıdır. Saflaştırılmış eksozomlar, çeşitli hastalık modellerinden izole edilen farklı hücre tiplerinden ve dokulardan elde edilebilir. Eksozomlar tanısal biyobelirteçler olarak kullanılabilir.

Bu prosedürü göstermek, d'Azzo Laboratuvarı'ndan bir bilim adamı olan Diantha van de Vlekkert olacak Başlamak için, fare kaslarını tartın ve ardından bunları 10 santimetrelik bir tabağa aktarın. Biyogüvenlik başlığı altında çalışarak, ince bir macun elde etmek için kasları neşterlerle kıyın. İnce kıyılmış kas macununu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve miligram doku başına hacmin 3,5 katı kullanarak sindirim solüsyonu ekleyin.

37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Tam ayrışmaya yardımcı olmak için, süspansiyonu her 10 dakikada bir 5 mililitrelik bir pipetle iyice karıştırın. Sindirim çözeltisini etkisiz hale getirmek için, hücre süspansiyonuna 20 mililitre DMEM Complete ekleyin.

50 mililitrelik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecinden pipetleyin ve ardından hücre süzgecini ilave 5 mililitre DMEM Complete ile yıkayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 10 mililitre DMEM Complete içinde yeniden süspanse edin.

Hücreleri 10 santimetrelik bir tabağa tohumlayın, ardından tabağı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %3 oksijen olacak şekilde inkübatöre yerleştirin. Fizyolojik ışık koşullarını sağlamak için iskelet kası fibroblast kültürlerinin düşük oksijen seviyesinde tutulması gerekir. İskelet kasındaki oksijen seviyesi yaklaşık% 2.5'tir.% 100 birleştikten sonra, onları bir gün daha kültürleyin, daha sonra PBS ile durulayın ve bir mililitre tripsinizasyon çözeltisi ekleyin.

Hücreleri 10 dakika inkübe ettikten sonra, 10 mililitre DMEM Complete ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Daha sonra peleti 20 mililitre DMEM içinde tekrar süspanse edin ve hücreleri 15 santimetrelik bir tabağa tohumlayın.

Şartlandırılmış ortamı, 15 mililitrelik bir tüpte kültürlenmiş fibroblastlardan toplayın. Canlı hücreleri peletlemek için şartlandırılmış ortamı 300 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve tüpü 10 dakika boyunca 2.000 g'da santrifüjleyerek ölü hücreleri peletleyin.

Daha sonra, süpernatanı 38.5 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın ve organelleri, apoptotik cisimleri ve zar parçalarını çıkarmak için tüpü 30 dakika boyunca 10.000 g'da santrifüjleyin. Eksozomları peletlemek için, süpernatanı 38.5 mililitrelik ultra berrak bir tüpe aktarın ve 1.5 saat boyunca 100.000 g'da ultrasantrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve yaklaşık bir mililitre şartlandırılmış ortam bırakın.

Eksozom peletini yıkayın ve 30 mililitreye kadar buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. Eksozomları 1.5 saat boyunca 100.000 g'da tekrar santrifüjleyin. Saflaştırmayı tamamlamak için, ekzozomal peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı pipetleyerek çıkarın.

Eksozom pelet adımı gevşek olabilir ve kolayca çıkarılabilir. Bu nedenle, PBS süpernatantının çıkarılması 200 mikrolitrelik bir pipet yardımıyla çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. 15 santimetrelik fibroblast tabağı başına 25 mikrolitre kullanarak peleti buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın.

Son olarak, BCA Protein Test Kiti ve 562 nanometrede bir mikroplaka okuyucu kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. Bu protokol, eksozomları saflaştırmak için oldukça tekrarlanabilir ve tutarlı bir yöntemdir. Transmisyon elektron mikroskobu, bu eksozomların nispeten tekdüze boyutlarını gösterir.

Eksozom lizatlarının immünoblotu, kanonik bir protein ekspresyonu modelini ve LDH ve kalneksin protein kontaminantlarının yokluğunu gösterir. Eksozomlar bir sükroz yoğunluk gradyanı ile ayrıldı ve bireysel fraksiyonlar, Alix, CD9 ve CD81'e karşı antikorlarla bir batı lekesi üzerinde incelendi. Eksozomlar sürekli olarak üç ila altı arasındaki fraksiyonlarda çökelmiştir.

İzole edilmiş ve konsantre biyoaktif eksozomlar, elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi analizlerinin yanı sıra fonksiyonel çalışmalar için in vitro ve in vivo alım deneyleri için kullanılabilir. Bu protokol, eksozomların düşük salgı hücrelerinden izolasyonu için uygundur ve eksozomların insan fibrotik hastalıklarına katılımını araştırmak için uygulanabilir.