Name: EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Öğrenin EYFP-CENP-A proteininin ubikuitinasyonunu kütle spektrometresi analiziyle belirlemeyi. Bu yöntem, sentromer fonksiyonu ve hücre canlılığı için kritik olan lizin 306 gibi siteleri tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Model Hayvan Araştırma Merkezi' nde Chao-Jun Li teşekkür, Nanjing Üniversitesi kütle spektrometresi analizi için. Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa ve Model Hayvan Araştırma Merkezi, Nanjing Üniversitesi ve Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü'ndeki mevcut araştırmacılara yararlı tartışmaları, deneysel rehberlikleri ve reaktifleri için teşekkür ederiz. Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago ve Dawn S. Chandler'a cömert reaktif hediyeleri için teşekkür ederiz. Y.N., Jiangsu Eyaleti ''Double- First-Class'' İnşaat Fonu tarafından desteklendi. Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Fonu (SBK2019021248), Jiangsu Eyaleti 16Altı Büyük Yetenek Peaks Fonu (TD-SWYY-001), Jiangsu Eyaleti "Yabancı Uzman Yüz Yetenekler Programı" Fonu (SBK2019010048) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31970665). Bu çalışma kısmen NCI hibe R21 CA205659 tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Burada EYFP-CENP-A K124R mutant ın ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi yöntemleri açıklanan EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Sonuçlarımızda, EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) üzerinde, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lisin 56 (K56) ile karşılık gelen her yerde başarılı bir şekilde saptandı. Burada açıklanan kütle spektrometresi analizi, daha önce CENP-A WT-Flag12'ninli...

Ökaryotların çoğunda, iğ mikrotübülleri sentromer olarak adlandırılan her kromozomun tek bir bölgesine bağlanmalıdır. Kinetochore sentromere bulunan proteinlerin bir komplekstir. Sentromer ve kinetokore proteininin hareketlerinin zamanlaması ile kinetokore ve sentromerlerin yapısının incelenmesi kromozom instabilitesi (CIN) ve kanser ilerlemesini anlamak için önemlidir. Önemli sorular, bir sentromerin kromozom konumunun ve işlevinin (yani sentromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldıklarıdır. Çoğu türde, CENP-A adı verilen özel histon benzeri protein içeren özel bir nükleozomun varlığı sentromer kimliğini tanımlar. Bu nedenle CENP-A'nın sentromer kimliğin DNA olmayan göstergesi (epigenetik işareti) olduğu öne sürüldü. CENP-A'nın insanlardaki centromer kimliğini nasıl tanımladığımekanizmasını açıklamak önemlidir.
Holliday kavşak tanıma proteini (HJURP) CENP-A-spesifik şaperon hangi mevduat CENP-A centromeric nükleozomlar1,2,3. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase lisenin üzerinde CENP-A ubiquitylation için gerekli olduğunu bildirdik 124 (K124) ve centromere lokalizasyon4. Ayrıca, sonuçlarımız yeni sentezlenen CENP-A centromere işe önceden varolan her yerde CENP-A5gerektirdiğini gösterdi. Böylece, CENP-A ubiquitylation hücre bölünmeleri arasında dimerization yoluyla kalıtsal olduğunu düşündüren bir model sağlanmıştır.
Bulgularımız ve Yu ve ark.'nın bulgularının aksine, CENP-A ve merkezsel lokalizasyonu ile ilgili olumsuz sonuçlar son zamanlarda6yayınlanmıştır. Makalede, Lizin 124 (K124) üzerinde CENP-A modifikasyonları kurulması için vazgeçilebilir olduğunu iddia etti, bakım, ve insan centromeres uzun vadeli fonksiyonu, K124R mutasyonu CENP-A centromere lokalizasyonu etkilemediğini gösteren olumsuz sonuçlara dayanarak ne hücre canlılığı6. Ancak, onların sonuçları ve sonuçları tartışma için yeterli oda var, ve biz zaten ne sorun var onların önceki yayın7olabilir açıklanmıştır . Endojen CENP-A boyutundan çok daha büyük molekül ağırlıklarına sahip olan CENP-A ile proteinleri eritmiş olmaları dikkat edilmelidir: örneğin, ~30 kDa geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile ~16 kDa CENP-A'ya eritmiş ve RPE-1CENP-A-Fout sisteminde EYFP-CENP-A K124R füzyon proteinini analiz ettiler. K124 ubiquitin yapısaltahminleredayalı hjurp doğrudan bağlamak için beklenmez 4 , Ancak, mono-ubikitin eklenmesi CENP-A protein konformasyonu üzerinde bir etkisi olduğu tahmin edilmektedir. CENP-A konformasyonunun proteini büyük bir füzyon proteininin varlığı ile değiştirilebilir ve bu konformasyonel değişim ubikilasyon kaybının neden olduğu yapısal değişiklikleri maskeleyebilir. Büyük boyutlu proteinfüzyonunun EYFP-CENP-A K124R mutantında K124 dışındaki bir lizinde ubiquitylation'ı indüklemesini ve başka bir sitedeki bu ubiquitylation'ın orijinal K124R tek mutant fenotipini inhibe ettiğini/maskelediğini öneriyoruz. Cenp-A K124R mutant proteininde büyük etiketli protein (EYFP) ile farklı lizinde ubiquitylation'ın meydana geldiğine dair kanıtlar 8. EYFP etiketlemenin EYFP-CENP-A K124R'ın başka bir lizin bölgesinin her yerde bulunmasına neden olduğu ve EYFP-CENP-A K124R mutantının HJURP'ye bağladığı saptandı. Sonuç olarak, başka bir sitede bu ubiquitylation inhibe / maskeler orijinal K124R tek mutant fenotip, ve hem EYFP-CENP-A WT ve K124R mutantlar centromere lokalizasyon gösterdi (biz kullanılan ve pBabe-EYFP-CENP-A WT ve K124R mutant karşılaştırıldı, birlikte pBabe-EY controlFP.). Sonuçlar, Bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A K124R mutantlarının ölümcül olduğunu ancak monoubiquitin füzyonu ile kurtarılabilen leri gösterdi, bu da CENP-A ubiquitylation'ın hücre canlılığı için vazgeçilmez olduğunu düşündürüyor.
Son yıllarda, birçok çalışma da in vivo ve in vitro9,,10,,11HEM CENP-A protein ve diğer centromere-kinetochore proteinlerin posttranslational değişiklikler (PTMs) tanımlamak için farklı tahliller geliştirdik. Kromatin fonksiyonlarını düzenleyen önemli bir mekanizma olan histon proteinlerinin PTM'lerine benzer olarak, sentromerik kromatin bileşenlerinin PTM'leri de sentromerlerin genel yapısını ve işlevini düzenleyen önemli bir mekanizmada yer almaktadır. CENP-A PTM bölgelerinin çoğu CENP-A içeren nükleozomlara özgüdür, ancak bunlardan birkaçı histon H3'te korunmuştur, bu kalıntıların modifikasyonunun sentromere özgü fonksiyona katkıda bulunduğu ileri sürülmektedir. Fosforilasyon, asetilasyon, metilasyon ve ubikitlasyon da dahil olmak üzere CENP-A PTMs daha önce bildirilmiştir9, CENP-A ptms çeşitli tabi olduğunu düşündüren ve amino terminus ve C-terminus histon-fold etki alanında onların kombinatoryal dizileri. Birden fazla fonksiyonda CENP-A modifikasyonlarının önemi bizimki de dahil olmak üzere birçok grup tarafından ortaya kondu. Bu fonksiyonlar centromerlerde CENP-A birikimini, protein stabilitesini ve CCAN'ın (kurucu sentromer ilişkili ağ) işe alınmasını içerir9. Ancak, cenp-A PtM'lerin sınırlı çalışmaları ve bulguları, işlevlerini doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyen kanonik histones biri ile karşılaştırmalar yapıldığı nda önceden oluşturulmuştur. Bu CENP-A PTM'lerini tanımlamak için metodolojiye odaklanan teknik raporlar da sınırlıdır.
CENP-A ubiquitylation centromere12de CENP-A birikimi için gerekli olduğundan , hücre bölünmesi arasında dimerization yoluyla kalıtsal5, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez8, CENP-A ubikirlasyon belirlemek için yöntem fonksiyonel aktivite, konumlandırma ve centromere yapısını incelemek için gelecekte gerekli olacaktır. Bu nedenle, burada EYFP-CENP-A K124R mutant ubiquitylation tanımlamak için kütle spektrometresi analizi açıklar EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Diğer kontrol tahlil ve analizlerinin protokolleri (immünofloresan analizi, koloni büyüme dışı tahlil ve in vivo ubiquitition tahlil) ayrıca büyük kütle spektrometresi analizinin sonuçlarını doğru bir şekilde tartışmak için sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Ekipmanlar / Aletler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml protein düşük bağlayıcı tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>Kütle spektrometresi analizi için</td></tr><tr><td>10 cm hücre kültürü kabı</td><td>BIOFIL/JET, Çin</td><td>700224</td><td>10 cm doku kültürü kabı (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>6 Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6 oyuklu kültür plaka</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO-Kütle</td><td></td> <td>spektrometresi analizi için vakumlu kuru peptitler için tezgah üstü vakum yoğunlaştırıcı</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 & mu; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>Kütle spektrometresi analizi için sıvı kromatografisi (RPLC) kolonu</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x yağa daldırma lensi</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PHE</td><td>100X Yağa daldırma lensi</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x yağa daldırma lensi</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PH 3 CS</td><td>63X Yağa daldırma lensi</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membranı</td><td>EMD Kırlangıç</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>için Leica DM IRE2 motorlu floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td> <td>motorlu floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Leica EL6000 kompakt ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td></td><td>Floresan uyarma için harici ışık kaynağı</td></tr><tr><td>Mikro Kapak camı (22 mm x 22 mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Kapak camı (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Model V16-2 poliakrilamid jel elektroforez aparatı</td><td>Apogee Elektroforezi/CORE Yaşam Bilimleri</td><td>31071010</td><td>Daha büyük SDS-PAGE jel nanoLC.2D uygulamak için Jel elektroforez aparatı I</td></tr><tr><td></td><td>Eksigent</td> <td>Technologies-kütle</td> <td>spektrometresi analizi için sıvı kromatografi sistemi</td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>NP0335BOX Kütle spektrometresi analizi için ticari olarak temin edilebilen %4-12 Bis-Tris protein jelleri</td></tr><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 konfokal lazer tarama mikroskobu</td> <td>Olympus-Konfokal lazer tarama mikroskobu (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ indirme/#!dlOpen=%23detail847250519)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Degital CCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>CCD kamera</td></tr><tr><td>PAP Kalem</td><td>Bağlama Yeri</td><td>AD100.1</td><td>İmmünofloresan boyamada su itici bariyer</td></tr><tr><td>için DOKU KÜLTÜR KAPLARI 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>10 cm doku kültürü kabı</td></tr><tr><td>Jel çalışması için dikey elektroforez (büyük boy)</td><td>Junyi, Çin</td><td>JY-SCZ6</td>+<td>Jel elektroforez aparatı II, daha büyük SDS-PAGE jeli uygulamak için (Yohei laboratuvarı, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Mikro Slaytlar, Buzlu</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Mikro slaytlar</td></tr><tr><td><güçlü>Birincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CENP-A antikoru</td><td>Stressgen/Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>KAM-CC006</td><td>Fare monoklonal antikoru</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Fare monoklonal antikoru</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Tavşan poliklonal antikoru anti-GAPDH</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Tavşan poliklonal antikoru</td></tr><tr><td>anti-GFP antikoru</td><td>ANTI # 76 (Ev yapımı antikor)</td><td></td> <td>Tavşan poliklonal antikoru</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td> <td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Sıçan monoklonal antikoru</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Grubu</td><td>15283 ve ndash; 1-AP</td><td>Tavşan poliklonal antikoru</td></tr><tr><td>anti-Ubiquitin</td><td>Bethyl Laboratuvarları</td><td>A300-317A-1</td><td>Tavşan poliklonal antikoru</td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Protein konsantrasyonunun ölçümü için ticari protein tahlili reaktifi I (%0.1 SDS ile uyumlu)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonikatör</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonik sonikatör Microtip Adım, Katı, Dişli 9.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Sonikasyon için bozucu korna</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonik sonikatör Microtip Konik 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Sonikasyon için Mikrouç</td></tr><tr><td>Tampon A1</td> <td>-</td><td></td> <td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; % 0.5 Nonidet P-40; % 0.5 deoksikolat; % 0.5 SDS; 1 mM EDTA; tam EDTA içermeyen proteaz inhibitör reaktifi</td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>Tampon A1 için komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörü reaktifi</td></tr><tr><td>Coomassie parlak mavi R-250</td><td>BBI Yaşam Bilimleri</td><td>Kütle spektrometresi analizi için CAS 6104-59-2</td><td>Coomassie mavisi çözeltisi</td></tr><tr><td>Kristal viyole çözeltisi (%2.3 kristal viyole, %0.1 amonyum oksilat, %20 etanol)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Koloni boyama için</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Nükleer boyama için</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Orta</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 Orta Fetal</td></tr><tr><td>Sığır Serumu, sertifikalı, ısı inaktive edilmiş, ABD menşeili</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (fetal sığır serumu)</td></tr><tr><td>Yüksek glukozlu DMEM (Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s medium)</td> <td>Life Technologies / BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>yüksek glikozlu DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Kimyasal transfeksiyon için transfeksiyon reaktifi I</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, P3000 çözeltisi</td> Kimyasal transfeksiyon için <td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfeksiyon reaktifi II</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fiksasyonu reagant</td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu (karanfil süt tozu için onaylanmış ikame)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Yeniden Sipariş No. 190915; Lot # 90629)</td> <td>Yağsız yağsız süt</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>31985</td><td>Azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>p-fenilendiamin</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Orta</td></tr><tr><td>Penisilin, Streptomisin montajı için; Sıvı</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penisilin-streptomisin</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin ÇÖZELTİSİ</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-Lizin, %0.1 w/v, suda</td></tr><tr><td>Polietilenimin [PEI]; 1.0 mg / ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash; 2</td><td>Kimyasal transfeksiyon için transfeksiyon reaktifi III</td></tr><tr><td>Protein A sefaroz CL-4B boncukları</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>pQCXIP-EYFP-CENP-A kullanarak in vivo ubikitilasyon deneyleri için Protein A sefaroz CL-4B boncukları</td></tr> Western <tr><td>Blot Sıyırma Tamponunu Geri Yükle</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>Western Blot Sıyırma Tamponu I</td></tr><tr><td>Sıralama sınıfı tripsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Kütle spektrometresi analizi için</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyetli Yüzey</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Ultra hassas geliştirilmiş kemilüminesan (ECL) substrat</td></tr><tr><td>UltraPure Damıtılmış Su</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Steril doku kültürü dereceli su</td></tr><tr><td>Western Blot Sıyırma Tamponu II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; %2 SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Merkaptoetanol)</td><td>-</td><td>-</td><td>Western Blot Sıyırma Tamponu II</td></tr><<tr><td>güçlü>İkincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>florofor konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>florofor konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW yazılımı</td><td></td> <td>Olympus-Sofware</td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ indirme/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>Analiz FV31S-DT yazılımı</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Yazılım C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ indirme/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension yazılımı Sürüm 1. 18</td><td></td> <td>Olympus-Sofware</td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ yazılımı/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analiz Yazılımı Sürüm 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Yazılım</td><td></td> <td>D</td></tr><tr><td>Moleküler Görüntüleyici Versadoc MP4000 Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>İmmünoblot tespiti için kemilüminesans görüntüleyici</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Kızılötesi görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR</td> Biosciences-İmmünoblot <td></td><td>tespiti için kızılötesi görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>OpenCFU güvenlik yazılımı</td> <td>-</td><td></td> <td>Koloni sayımı için (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab sürüm 5.5.2. Bilimsel Görüntüleme Yazılımı</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A ProteinPilot Yazılımı sürüm 4.5</td><td>AB SCIEX-Kütle</td><td></td> <td>spektrometresi analizi için Yazılım F</td></tr><tr><td>Miktar Bir 1-D analiz yazılımı</td><td>Bio-Rad-Yazılım</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ Sistem</td><td>AB SCIEX-Kütle</td><td></td> <td>spektrometresi cihazı</td></tr><tr><td>Volocity sürüm 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity versiyon 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

eyfp etiketli cenp-a (eyfp-cenp-a) ubiquitylation tanımlamak için kütle spektrometresi analizi

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Kinetokoreve sentromerlerin yapısı ve dinamiklerinin incelenmesi kromozomal instabilite (CIN) ve kanser ilerlemesini n anlaşılmasında önemlidir. Bir sentromerin kromozom yerinin ve işlevinin (yani centromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldığı temel bir sorudur. CENP-A sentromer kimliğinin DNA olmayan indikatörü (epigenetik işareti) olarak önerilmektedir ve cenp-A ubiquitition centromere de CENP-A birikimi için gereklidir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez.
Burada, EYFP-CENP-A K124R mutantının ubiquitylation'ını tanımlamak için kütle spektrometresi analizini açıklıyoruz ve cenp-A K124R mutant proteinindeki EYFP etiketlemesi nedeniyle farklı bir lizinde ubiquitylation indüklenmiş olduğunu öne sürüyoruz. EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) ubiquitylation başarıyla tanımlanmış, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lizin 56 (K56) ile karşılık gelmektedir. Bir uyarı GFP / EYFP kullanımı veya bir proteinin işlevini analiz etmek için bir araç olarak yüksek molekül ağırlıklı protein etiketleme tartışılır. Mevcut teknik sınır da her yerde bantların tespiti, siteye özgü ubiquitylation(lar) belirlenmesi ve canlı hücrelerde veya belirli bir hücrede tüm hücre döngüsü boyunca ubikitlasyon görselleştirme için tartışılmıştır.
Burada sunulan kütle spektrometresi analizi yöntemi farklı etiketleri ve diğer sentromer-kinetokore proteinleri ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Çeşitli tahliller/analizlerden oluşan bu kombinatory yöntemler, her yerde bulunan işlevsel rollerini belirlemek isteyen araştırmacılar için önerilebilir.

EYFP-CENP-A K124 mutant her yerde gösterir, HJURP ile etkileşim, ve centromere lokalizasyonunda hiçbir kusur ne hücre öldürücü. Burada Fachinetti et al. (2017)6 tarafından bildirilen sistem yeniden oluşturuldu: diploid insan (RPE-1) hücrelerinde bir bozulmuş ve bir ''floxed'' CENP-A alel(CENP-A-/F),EYFP-CENP-A pBabe-EYFP retrovirus vektörü ifade edildi. Bu sistemde, CENP-A-/F alel endojen CENP-A ifadesi Cre rekombinaz<sup class="xre...

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Bu yöntem, EYFP etiketli CENP-A proteininin ubiquitylation'ını belirlemeyi mümkün kAlmaktadır. Ayrıca farklı testler ve diğer proteinler ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Bunun en büyük avantajı, çok önemli biyolojik önemi olan EYFP CENP-A K124R her yerde bulunan siteleri tanımlamak için kullanılabilmedir.Çok çeşitli fonksiyonel proteinlerin çeviri sonrası modifikasyonlarını araştırmak için genişletilebilir. Protein hazırlayarak başlayın Anti-GFP antikor ile bağlı boncuklar. Yıkama 25 protein Etanol kaldırmak için tampon A1 ile immünopremasyon reaksiyonu başına boncuk lar.Sonra tampon A1 ile% 50 boncuk çözüm yapmak. Boncuklara iki mikrolitre anti-GFP antikor ekleyin. Ardından arabellek A1'i net boncuk hacminin 20 katına ekleyin. Dört ila 18 saat boyunca dört santigrat derecede uç-uç döndürme gerçekleştirin.Rotasyon için en uygun süre immünopresipitasyonun etkinliğine göre ampirik olarak belirlenmelidir. Döndükten sonra boncukları 100 kez g'de bir dakika santrifüj edin ve bağlanmamış süpernatantı çıkarın. Boncuk% 50 çözüm yapmak için tampon A1 ekleyin ve her immünopresidreaksiyonu için bu çözeltinin 25 mikrolitre kullanın.İmmünenenan,liyada hücrelerinin sonication ve freeze/hawai ile tampon A1'de yer alan hücreleri gerçekleştirmesi. Protein konsantrasyonlarını ölçün ve farklı IP örnekleri arasındaki protein miktarlarını normalleştirin. Ardından, SDS sayfasında çalıştırmak için her tüpten numunenin %5'ini çıkarın.Lysat'ın geri kalanını 25 mikrolitre proteinle karıştırın Anti-GFP antikora bağlı boncuklar ve dört ila 18 saat boyunca dört santigrat derecede uçtan uca dönüş yapın. Tampon A'daki hücreleri lysing ve daha önce açıklandığı gibi immünopresipitasyon yaptıktan sonra, TOPLAM immünopprepititantların %10'unu saklayarak EYFP CENP-A ubiquitylation'ı doğrulayın ve ubikitileted EYFP CENP-A'nın konumunu tam olarak belirleyin. Kütle spektrometresi analizi için diğer %90'ı kullanın.Kütle spektrometresi örneğini ticari olarak mevcut olan %4-12 Bis-Tris protein jelinde çalıştırın. Sonra Coomassie mavi boyama gerçekleştirmek ve kütle spektrometresi analizi için 50-70 kilodalton jel bölge çıkarmak. Küçük parçalar halinde her jel dilim zar ve 0,5 mililitre düşük protein bağlayıcı tüp yerleştirin.Jel parçalarını 25 milimolar amonyum bikarbonatta %50 asetonitit 100 mikrolitre ile yıkayın. 10-15 dakika girdap onları. Sonra onları aşağı spin ve supernatant atın.Son yıkamadan sonra, 30 dakika boyunca bir tezgah üst vakum konsantratörü ile jel parçaları kuru. Mikrolitre sıralama sınıf trippsin başına 10 nanogram 10 mikrolitre ekleyin ve jel parçaları beş dakika için rehydrate sağlar. Sonra 25 milimolar amonyum bikarbonat ekleyin, jel parçaları kapsayacak kadar ve bir gecede 37 derece santigrat onları sindirmek için yeterli.Ertesi gün, temiz bir 0.65 mililitre silikonlu tüp içine sindirilmiş supernatant aktarın ve% 50 asetonitril ve% 5 formik asit çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca örnek girdap. Sonra aşağı spin ve bir ekstraksiyon tüpü içine supernatant aktarın.Numuneyi tekrar iki mikrolitreye yoğunlaştırın. Daha sonra %3 asetonitril ve %2 formik asit çözeltisi sekiz mikrolitre ekleyin. 15 dakika girdap ve 30 dakika boyunca 16,000 kez g aşağı spin.Kütle spektrometresi aleti ile birleşen sıvı kromatografi sistemi kullanarak LC-MS/MS ile MS veri toplama gerçekleştirin. Numunenin sekiz mikrolitresini ters faz sıvı kromatografi sütununa enjekte edin ve yazı mevzisi yönergelerini takip eden 60 dakika içinde peptidleri %2-80 degradeli B çözücü ile ayırın. Veriye bağımlı edinme modunu kullanarak kütle spektrometresi verilerini toplayın.Masaüstünde kütle spektrometresi verilerini analiz etmek için ticari yazılımı açın. Yeni bir arama başlatmak için üst menüdeki LC düğmesini tıklatın. Ardından orijinal MS ham veri dosyalarını yüklemek için ekle düğmesini tıklatın.Paragon yönteminde veritabanı arama yöntemi olarak insan protein kimliğini seçin ve orijinal MS ham veri dosyalarını UniProt homo sapiens veritabanına karşı arayın. Sindirim enzimi olarak tripsin'i seçin ve geri kalan parametreleri el yazması talimatlara göre ayarlayın. Sonuç dosya adını girin ve menünün sağındaki kaydet düğmesine tıklayın.Ardından arama sonuçlarını depolamak için bir klasör seçin ve kaydet düğmesini tıklatın. Aramayı başlatmak için işlem düğmesini tıklatın. Arama sona erdikten sonra, girilen arama adı içeren veriler otomatik olarak seçili klasörde depolanır.Herhangi bir spesifik peptidIN MS/MS spektrumlarını elde etmek için, arama sonuçlarını f.Then üst menüdeki protein listesindeki proteine tıklayın ve orta menüdeki peptid'e tıklayın. Bu peptidin MS/MS'si menünün alt kısmında görünür. MS/MS spektrumunu dışa aktarmak ve kaydetmek için, spektrumları kopyalayın ve uygun bir dosya biçimine yapıştırın.Endojen CENP-A kaybını kurtaran EYFP CENP-A yabani tipi veya K124R mutantının gen yapıları retroviral entegrasyon yapıldığında stably ifade edildi. Endojen CENP-A ekspresyonu Cre rekombinazin indüksiyonundan yedi gün sonra saptanmadı. Hem EYFP CENP-A yabani tip hem de K124R protein ekspresyonu ilk endojen CENP-A proteinine benzer düzeyde bulunmuştur.Hem EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutantlar endojen CENP-A kalan ifade bozulmasından sonra yedi gün centromere lokalizasyon gösterdi. EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutant bayraklı etiketli veya etiketsiz CENP-A vahşi türü ve K124R mutant için durumda aksine HJURP ile ubiquitylation ve etkileşim gösterdi. Hücre canlılığı, kalan endojen CENP-A alelinin bozulmasından 14 gün sonra koloni büyüme çıktısı gerçekleştirerek değerlendirildi.Hem EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutantlar kurtarılan koloniler benzer sayıda gösterdi 14 gün kalan endojen CENP-A alel bozulmasından sonra. IP kütle spektrometresi, CENP-A eksi F hücrelerinde EYFP CENP-A K124R'da lizin 306'da ubiquitylation saptandı. Bu sonuçlar birlikte, büyük boyutlu protein füzyon orijinal K124R tek mutant fenotip inhibe CENP-A K124R dışında bir lizin de ubiquitylation indükler önerdi.Bu protokolü denerken, kütle spektrometresi örneklerini çalıştırmak için ticari olarak mevcut olan %4%12 Bis-Tris protein jellerini kullanın. Jel parçaları için yeterli tripsin ekleyin ve tüm enzimler emilir kadar onları rehydrate. Daha düşük molekül ağırlığı etiketleme veya sondalama tekniği aslında ubiquitylation görselleştirmek ve uzaysal zamansal protein ubiquitylation sinyal araştırmak için gereklidir ve tüm organizma düzeylerinde.

mass-spectrometry-analysis-to-identify-ubiquitylation-eyfp-tagged

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

FRET kantitatif analizi (Förster rezonans enerji transferi) sinyalleri içeren bir roman yöntemini enzim kinetiği çalışmaları için tanımlanmıştır.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin EYFP-CENP-A proteininin ubikuitinasyonunu kütle spektrometresi analiziyle belirlemeyi. Bu yöntem, sentromer fonksiyonu ve hücre canlılığı için kritik olan lizin 306 gibi siteleri tanımlamaya yardımcı olur.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Daha fazla video keşfet