Hedeflenen İlaç Teslimatı için Doxorubicin Yüklü Aptamer-PEI-g-PEG Modifiye Altın Nanopartiküllerinin Sentezi

İlaç direnci ve toksisitesi nedeniyle klinikte doksorubisin kullanımı sınırlıdır. Bu protokol, bu terapötik ajanın salınımını sürdürmek için parçalanabilir bir taşıyıcı sağlar. Bu yöntemin avantajı, sentezlenen taşıyıcının ilacı doğrudan kanser hücrelerine vermek için kullanılabilmesi ve sadece kanser hücrelerinde hücre ölümüne neden olmasıdır.

CT-PEG sentezi için önce 100 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye 1.46 gram süksinik anhidrit ve 209 miligram 4-dimetilaminopiridin ekleyin. Daha sonra, şişeye 15 mililitre susuz tetrahidrofuran ekleyin ve reaksiyonu sıfır santigrat derecede 30 dakika inkübe etmeden önce şişeye bir cam tıpa yerleştirin. İnkübasyon sırasında, yeni bir şişeye 4.208 gram PEG, 1.8 mililitre trietilamin ve 15 mililitre susuz tetrahidrofuran ekleyin ve şişeyi bir cam tıpa ile kapatın.

İnkübasyonun sonunda, ikinci çözeltiyi yavaşça birinci şişeye aktarmak için nitrojen atmosferi altında bir şırınga kullanın. Reaksiyona gece boyunca oda sıcaklığında devam etmeden önce yeni çözeltiyi sıfır santigrat derecede iki saat karıştırın. Ertesi sabah, reaksiyon çözeltisini konsantre etmek ve tetrahidrofuran çözücüyü çıkarmak için 40 santigrat derece ve 0.1 megapaskal'da bir döner buharlaştırıcı kullanın.

Bir saat sonra, PEG diasit çökeltme ürününü elde etmek için 15 mililitre soğuk dietil eter eklemeden önce, reaksiyon çözeltisini oda sıcaklığında mililitre diklorometan başına 15 mililitre 1.325 gram içinde çözün. Daha sonra çözücüyü filtre kağıdı ile çıkarın ve çökeltiyi oda sıcaklığında 48 saat boyunca vakum altında kurutun. PEI-g-PEG kopolimer sentezi için, yeni bir şişeye 305.47 miligram CT-PEG çökeltisi ve beş mililitre DMSO ekleyin ve CT-PEG tamamen çözünene kadar reaksiyonu oda sıcaklığında karıştırın.

Daha sonra, 49.46 miligram EDC'yi beş mililitre DMSO'da çözün ve çözeltiyi şişeye ekleyin. 29.69 miligram N-Hidroksisüksinimit ve beş mililitre DMSO'yu çözmeden ve elde edilen çözeltiyi şişeye eklemeden önce reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın. Reaksiyonu oda sıcaklığında üç saat boyunca karıştırmaya devam edin.

İnkübasyonun sonuna doğru, 28.6 mikrolitre PEI'yi 10 mililitre DMSO'ya çözün ve çözeltiyi şişeye damla damla ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında en az üç gün karıştırın. İnkübasyonun sonunda, reaksiyona giren çözeltiyi 1000 moleküler ağırlıklı bir kesme ile bir diyaliz torbasına aktarın ve torbayı diyalizat olarak 500 mililitre ultra saf su içeren bir litrelik bir behere yerleştirin.

Diyalizin sonunda, çözeltiyi 10.000 moleküler ağırlıklı bir diyaliz torbasına aktarın ve torbayı diyalizat olarak 500 mililitre ultra saf su içeren bir litrelik bir behere yerleştirin. İkinci diyalizin sonunda, çözeltiyi konsantre etmek için 40 santigrat derece ve 0.1 megapaskal'da bir döner buharlaştırıcı kullanın ve PEI-g-PEG tozunu elde etmek için numuneyi dondurarak kurutun. Altın nanopartiküllerin PEI-g-PEG ürünü ile kaplanması için, hazırlanan PEI-g-PEG'in beş miligramını yeni bir şişede beş mililitre ultra saf suda çözün ve şişeyi bir cam tıpa ile yerleştirin.

Şişeye 100 mililitre 0.3 milimolar aurik klorür çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında üç saat karıştırın. Renkler hemen açık sarıdan koyu sarıya değişmelidir. Kuluçka işleminin sonunda, şişeye mililitre sodyum borhidrür çözeltisi başına bir mililitre bir miligram ekleyin.

Renk hemen koyu sarıdan altın sarısına değişmeli ve çözeltiyi oda sıcaklığında üç saat daha karıştırmalıdır. Daha sonra reaksiyon ürününü, PEI-g-PEG kaplı altın nanopartikül çözeltisini elde etmek için gösterildiği gibi üç gün boyunca 1000 moleküler ağırlıklı bir kesme diyaliz torbası ile diyalize edin. Doksorubisin'in PEI-g-PEG kaplı altın nanopartiküllere aşılanması için.

Yeni bir şişeye mililitre doksorubisin çözeltisi başına bir mililitre 2.2 miligram ve 20 mililitre PEI-g-PEG kaplı altın nanopartikül çözeltisi ekleyin ve şişeyi bir cam tıpa ile yerleştirin. Daha sonra, 0.727 miligram EDC'yi bir mililitre ultra saf suda çözün ve EDC çözeltisini şişeye ekleyin. 0.437 miligram N-Hidroksisüksinimidi bir mililitre ultra saf suda çözün ve N-Hidroksisüksinimit çözeltisini oda sıcaklığında karıştırarak bir saatlik bir inkübasyon için şişeye ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, reaksiyon ürününü, doksorubisin g-PEI-g-PEG kaplı altın nanopartikül çözeltisini elde etmek için gösterildiği gibi üç gün boyunca 1000 moleküler ağırlıklı bir kesme diyaliz torbasında diyalize edin. AS1411 aptamerinin DOX-g-PEI-g-PEG'e aşılanması için. AS1411'in yaklaşık dört optik yoğunluk konsantrasyonuna 20 mililitre doksorubisin DOX-g-PEI-g-PEG kaplı altın nanopartikül çözeltisi ekleyin.

28.76 miligram EDC'yi bir mililitre ultra saf suda çözün ve EDC çözeltisini şişeye ekleyin. 17.27 miligram N-Hidroksisüksinimidi bir mililitre ultra saf suda çözün ve N-Hidroksisüksinimit çözeltisini oda sıcaklığında karıştırarak bir saatlik bir inkübasyon için şişeye ekleyin. Daha sonra reaksiyon ürününü, AS1411-g-Doksorubisin-g-PEI-g-PEG kaplı altın nanopartikülleri elde etmek için gösterildiği gibi üç gün boyunca 1000 moleküler ağırlıklı bir kesme diyaliz torbasında diyalize edin.

Proton NMR spektroskopisi, CT-PEG polimeri ve PIE-g-PEG kopolimerlerinin başarılı sentezini doğrulamak için kullanılabilir. Ultraviyole spektroskopisi, hazırlanan kopolimerin altın nanopartiküller üzerine başarılı bir şekilde işlevselleştirilmesini ve kademeli olarak yüklenmesini belirlemek için yapılabilir. X-ışını foto elektron spektroskopisi, kopolimerin altın nanopartiküller üzerindeki kimyasal bağını araştırmak için kullanılabilir.

Hazırlanan nanopartiküllerin boyut dağılımını belirlemek için dinamik ışık saçılımı yapılabilir. Bu analizde, transmisyon elektron mikroskobu, düzgün bir morfolojiye sahip kümelenmemiş nanoparçacıkları ortaya çıkardı. Hücre canlılığı analizi, zaman içinde ve artan nanopartikül konsantrasyonlarına yanıt olarak A549 hücre sayılarında bir azalma olduğunu ortaya koydu.

Bununla birlikte, serbest doksorubisin grubuyla karşılaştırıldığında, hücre sayıları artmıştır, bu da toksisitenin azaldığını gösterir. Ayrıca, doksorubisin salım profilinin analizi, işlevselleştirilmiş nanopartiküllerden doksorubisin sürekli salınımının A549 hücrelerinde bir azalmaya neden olduğunu ortaya koymaktadır. İşlemin uygulanmasında PEI-g-PEG kopolimer preparasyonu ve AS1411 aşılama adımları başarı için önemlidir.

Aynı ilaç taşıyıcı, ilaçların aşılanmasından önce AS1411'in aşılanmasıyla elde edilebilir, ancak ilaç yükleme etkinliği azalacaktır.