Name: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Öğrenin, tek kullanımlık biyoreaktörler kullanarak iPSC'lerden ölçeklenebilir serebellar organoid üretimi ve immünboyama ile karakterizasyon yöntemlerini. Bu protokol nörobilim araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz (UIDB/04565/2020 programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 to T.P.S ve PD/BD/128376/2017 to D.E.S.N., FEDER tarafından ortaklaşa finanse edilen projeler (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTEKIZ 2020) ve FCT hibe PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ve CEREBEX Nesil Serebellar Organoidler AtaksiA Araştırma hibe LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 739572 sayılı Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı'ndan da fon alındı- Keşifler Rejeneratif ve Hassas Tıp Keşifler Merkezi H2020-GENİş-01-2016-2017.

1. Tek katmanlı kültürde insan iPSC'lerinin geçişi ve bakımı
<ol><li>Plakaların hazırlanması<ol>
<li>4 °C'de temel membran matrisini (Bkz. Malzeme Tablosu)eritin ve 60°L aliquots hazırlayın. -20 °C'de aliquotları dondurun.</li>
		<li>6 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için, bodrum membran matrisinin bir aliquot'unu buz üzerinde eritin. Çözüldükten sonra 6mL'den 6 mL'ye 60°L DMEM-F12 ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı borular tarafından askıya.</li>
		<li>6 kuyuplakasının her kuyusuna 1 mL seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklamadan önce RT'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EDTA ile iPSC kolonilerinin geçişi<ol>
<li> </li><li></li><li><li><li><li> </li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><li><li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61143/61143equ01.jpg"> </li></ol></li><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li>
<li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2F+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li>
<li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li>
<li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li>
<li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li>
<li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoids%2C+organoids+and+gastruloids%3A+new+approaches+to+understanding+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li>
<li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293(2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li>
<li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li>
<li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li>
<li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li>
<li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li>
<li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li>
<li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar YH ve SJ PBS Biotech çalışanlarıdır. Yazar BL, PBS Biotech, Inc.'in CEO'su ve kurucu ortağıdır. Bu işbirlikçi yazarlar el yazmasında kullanılan biyoreaktörlerin geliştirilmesine katıldılar. Bu, yazarların veri ve materyallerin paylaşılmasına ilişkin derginin tüm ilkelerine bağlılığını değiştirmez. Diğer tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmez.

Uyuşturucu taraması ve rejeneratif tıp uygulamaları için belirli hücre tipleri oluşturmak için büyük hücre numaralarının yanı sıra tanımlanmış kültür koşullarına duyulan ihtiyaç ölçeklenebilir kültür sistemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Son yıllarda, çeşitli gruplar nöral atalar ve fonksiyonel nöronların ölçeklenebilir nesil bildirdin32,33,34, nörodejeneratif bozukluklar için yeni modellerin geliştirilmesinde önemli gelişmele...

İnsan pluripotent kök hücrelerinin ortaya çıkması (PSCs) rejeneratif tıp ve hastalık modelleme için mükemmel bir araç temsil eder, Bu hücrelerin insan vücudunun en hücre soyları içine ayırt edilebilir çünkü1,2. Onların keşfinden bu yana, PSC farklılaşma farklı yaklaşımlar kullanarak farklı hastalıkların model bildirilmiştir, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere3,4,5,6.
Son zamanlarda, insan serebral yapıları andıran PSCs türetilen 3D kültürlerin raporlar olmuştur; bu beyin organoidlerdenir 3,7,8. Bu yapıların hem sağlıklı hem de hastaya özel SPK'lardan üretimi, insan gelişimi ve nörogelişimsel bozuklukları modellemek için değerli bir fırsat sağlamaktadır. Ancak, bu iyi organize serebral yapılar oluşturmak için kullanılan yöntemler onların büyük ölçekli üretim için uygulamak zordur. Organoidler içinde nekroz olmadan doku morfogenezini özetleyecek kadar büyük yapılar üretmek için protokoller statik koşullarda ilk nöral bağlılığa dayanır, ardından hidrojellerde kapsülleme ve dinamik sistemlerde sonraki kültür3. Ancak, bu tür yaklaşımlar organoid üretimin potansiyel ölçek-up sınırlayabilir. Kortikal, striatal, orta beyin ve omurilik nöronlar9,10,,11,,1012dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerine PSC farklılaşma doğrudan psc farklılaşma için yapılmış olsa da, dinamik koşullarda belirli beyin bölgelerinin üretimi hala bir sorundur. Özellikle, 3D yapılarda olgun serebellar nöronların nesil henüz tarif edilmemiştir. Muguruma ve ark. erken serebellar gelişim13 recapitulate kültür koşullarının nesil öncülük ve son zamanlarda insan embriyonik kök hücrelerin in ilk trimester serebellum anımsatan polarize bir yapı oluşturmak için izin veren bir protokol bildirdi7. Ancak, bildirilen çalışmalarda serebellar nöronların olgunlaşmaorganoidlerin ayrışması gerektirir, serebellar atalarının sıralama, ve tek katmanlı kültür sisteminde besleyici hücreleri ile coculture7,14,15,16. Bu nedenle, tanımlanmış koşullar altında hastalık modelleme için istenilen serebellar organoidlerin tekrarlanabilir nesil hala kültür ve besleyici kaynak değişkenliği ile ilişkili bir sorundur.
Bu protokol, tek kullanımlık dikey tekerlek biyoreaktörleri kullanarak 3D genişleme ve insan PsC'lerinin serebellar nöronlara etkin bir şekilde farklılaşması için en uygun kültür koşullarını sunar (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosuna bakınız), bundan böyle biyoreaktörler olarak adlandırılır. Biyoreaktörler büyük bir dikey çark ile donatılmıştır, Hangi U-şekilli alt ile birlikte, damar içinde daha homojen bir kesme dağılımı sağlamak, azaltılmış ajitasyon hızları ile nazik sağlayan, düzgün karıştırma ve parçacık süspansiyon17. Bu sistem le daha homojen ve verimli bir farklılaşma için önemli olan şekil ve boyut kontrollü hücre agregaları elde edilebilir. Ayrıca, daha az zahmetli bir şekilde iPSC kaynaklı organoidler daha fazla sayıda oluşturulabilir.
Genellikle kök hücrelerden oluşan 3D çok hücreli yapılar olan organoidlerin ana özelliği, insan morfogenezinde görülenlere benzer şekiller oluşturan farklı hücre tiplerinin kendi kendini organizasyonudur18,19,20. Bu nedenle organoid morfolojisi farklılaşma sürecinde değerlendirilmek üzere önemli bir kriterdir. Organoidlerin kriyoseksiyonu ve organoid dilimlerinin belirli bir antikor seti ile daha fazla immünboyizasyonu, hücre çoğalması, farklılaşma, hücre popülasyon uyruk kimliği ve apoptozu analiz etmek için moleküler belirteçlerin mekansal görselleştirmesine olanak sağlar. Bu protokol ile organoid kriyokesilerin immünboyboya ilefarklılaşmanın 7. Farklılaşma sırasında serebellar kimliğe sahip çeşitli hücre popülasyonları gözlenir. Bu dinamik sistemde 35 gün sonra, serebellar nöroepitel bir apikobazal eksen boyunca organize, çoğalan atalar bir apikal tabaka ve bazal bulunan postmitotik nöronlar. Olgunlaşma sürecinde, gün 35-90 farklılaşma, serebellar nöronların farklı türleri görülebilir, Purkinje hücreleri de dahil olmak üzere (Calbindin+), granül hücreleri (PAX6+/ MAP2+), Golgi hücreleri (Nörogranin+), unipolar fırça hücreleri (TBR2+), ve derin serebellar çekirdekleri projeksiyon nöronlar (TBR1+ ). Ayrıca kültürde 90 gün sonra oluşturulan serebellar organoidlerde önemli miktarda hücre ölümü gözlenmektedir.
Bu sistemde, insan iPSC kaynaklı organoidler farklı serebellar nöronlar içine olgun ve dissociation ve besleyici coculture gerek kalmadan 3 aya kadar hayatta, hastalık modelleme için insan serebellar nöronkaynağı sağlayan.

<table><tbody><tr><td>3MM kağıt</td><td>WHA3030861</td><td>Merck</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A6964 - 500mL</td><td>Sigma</td><td>hücre ayrılma ortamı</td></tr><tr><td>Anti-BARHL1 Antikoru</td><td>HPA004809</td><td>Atlas Antikorları</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin D-28k Antikoru</td><td>CB28</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Antikoru</td><td>M4403</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-Cadherin Antikoru</td><td>610921</td><td>BD Transdüksiyon</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NESTIN Antikoru</td><td>MAB1259-SP</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OLIG2 Antikoru</td><td>MABN50</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX6 Antikoru</td><td>PRB-278P</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2 Antikoru</td><td>MAB2018</td> R<td>& D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TBR1 Antikoru</td><td>AB2261</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TBR2 Antikoru</td><td>ab183991</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUJ1 Antikoru</td><td>801213</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>T1147</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys Nöronal Ortam N2-A & SM1 Kiti</td><td>5793 - 500mL</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi</td><td>11905031</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Lameller 24x60mm</td><td>631-1575</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kristalizasyon ile saflaştırılmış BSA</td><td>5470</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>10236276001</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyryl cAMP</td><td>SC- 201567B -500mg</td><td>Frilabo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>32500-035</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>A3840001</td><td>sığır derisinden elde edilen ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>G9391</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Cam Copling Kavanozu</td><td>E94</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>10566-016</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>MB014001</td><td>NZYtech</td><td></td></tr><tr><td>Jambon' s F12</td><td>21765029</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Epizomal iPSC Hattı</td><td>A18945</td><td>ThermoFisher</td><td>iPSC6.2</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>12440046</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>91077C</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>iPS DF6-9-9T. B</td><td></td><td>WiCell</td><td></td></tr><tr><td>İzo-pentan</td><td>PHR1661-2ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>A-92902</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>354230</td><td>Corning</td><td>bazal membran matrisi</td></tr><tr><td>Monotiogliserol</td><td>M6154</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>475904</td><td>Milipor</td><td>montaj ortamı</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>85850 -500ml</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>17502048</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal</td><td>12348017</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>158127</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>PBS-0.1 Tek Kullanımlık Kap</td><td>SKU: IA-0.1-D-001</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>PBS-MINI MagDrive Ana Ünite</td><td>Stok kodu: IA-UNI-B-501</td><td>PBS Biyoteknolojik</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan BDNF</td><td>450-02</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan bFGF/FGF2</td><td>100-18B</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan FGF19</td><td>100-32</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan GDNF</td><td>450-10</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan SDF1</td><td>300-28A</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>KAYA inhibitör Y-27632</td><td>72302</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>S4317</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>S7903</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Mikroskop slaytları</td><td>12372098</td><td>ThermoFisher</td><td>yapışma mikroskobu slaytları</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Bileşik</td><td>25608-930</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL 1M</td><td>T3038-1L</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>9002-93-1</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>P1379</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>15575020</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücrelerinden olgun serebellar organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile karakterizasyonu

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Beyincik denge ve motor koordinasyonun korunmasında kritik bir rol oynar ve farklı serebellar nöronlarda fonksiyonel bir defekt serebellar disfonksiyonu tetikleyebilir. Hastalığa bağlı nöronal fenotipler hakkındaki mevcut bilginin çoğu postmortem dokular dayanmaktadır, bu da hastalığın ilerlemesini ve gelişimini zorlaştırır. Hayvan modelleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları da nörodejeneratif bozukluklar için model olarak kullanılmıştır. Ancak, onlar tam olarak insan hastalığı özetlemek yok. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) hastalık modelleme için büyük bir potansiyele sahip ve rejeneratif yaklaşımlar için değerli bir kaynak sağlar. Son yıllarda, hasta kaynaklı iPSCs gelen serebral organoidlerin nesil nörodejeneratif hastalık modelleme için umutları geliştirdi. Ancak, organoidler çok sayıda ve 3D kültür sistemlerinde olgun nöronların yüksek verim üreten protokoller eksiktir. Sunulan protokol, organoidlerin serebeller kimlik elde ettiği ölçeklenebilir tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan iPSC kaynaklı organoidlerin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi için yeni bir yaklaşımdır. Oluşturulan organoidler hem mRNA hem de protein düzeyinde spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterizedir. Belirli protein gruplarının analizi, lokalizasyonu organoid yapının değerlendirilmesi nde önemli olan farklı serebellar hücre popülasyonlarının saptanmasına olanak sağlar. Organoid kriyoselve organoid dilimlerin daha fazla immünboyama belirli serebellar hücre popülasyonlarının varlığını ve mekansal organizasyonlarını değerlendirmek için kullanılır.

Protokol, 0.1 L biyoreaktörler(Şekil 1A)kullanılarak hücre agregasyonu teşvik edilerek başlatılmıştır. 250.000 hücre/mL ile 60 mL orta alanda 27 rpm ajitasyon hızıile tek hücreli aşılama yapıldı. Bu gün 0 olarak tanımlanmıştır. 24 saat sonra hücreler spheroid şekilli agregaları (gün 1, Şekil 1B)verimli bir şekilde oluşturdular ve morfoloji 5. (Şekil 1B). Mikroskopi ile yapılan bir kantitatif analizde, agrega boyutlarının 1. güne gör...

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Serebellar Organoidler'de elde edilen IPS hücrelerinin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar ve tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak ilk kez yeni bir yaklaşım saklıyız. Biyo-reaktörün tohumlanması için hücre elde etmek için, insan iPSC'nin altı kuyu plakasının her kuyusuna bir mililitre hücre ayırma ortamı ekleyin. Plakayı 7 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ta ki hafif sallayarak hücreleri kuyudan kolayca ayırana kadar.P 1000 mikropipet kullanarak, hücreler tek hücrelere ayrışana kadar hücre ayırma ortamını yukarı ve aşağı boruhaline getirin. Sonraki iki mililitre ekleyin, her iyi tam hücre kültürü orta, bu enzimatik sindirim inaktive edecektir. Sonra yavaşça steril konik bir tüp hücreleri aktarmak için, pipet kullanın.Tüpü 210 kez yer çekiminde üç dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve kültür orta hücre pelet yeniden askıya alın. Hücreleri hemositometre kullanarak ve mavi boyayı deneyin.Mililitrebaşına 250,000 hücre yoğunluğunda iPSC'li biyoreaktör kabına bakın. Biyoreaktör kabını, 37 santigrat derece, %95 nem ve %5 karbondioksit le bir kuvözde, Evrensel Baz Ünitesi'ne yerleştirin. iPSC toplamayı teşvik etmek için, Temel Kontrol Ünitesi'nin ajitasyon oranını 27 RPM olarak ayarlayın.İlk gün, sıfır ın biyoreaktörü tohumlama günü olduğu için, biyoreaktörü ve Baz Ünitesini steril bir akış başlığına yerleştirin, sonra bir mililitrelik numune toplamak için serolojik pipet kullanın, hücre süspansiyonundan. Plaka hücre süspansiyon ultra düşük eki, 24 iyi plaka. iPSC kaynaklı agregaların oluştuğunu doğrulamak için bir mikroskop kullanın.Eğer öyleyse, 40 X veya 100 X.Up iPSC ve biyoreaktör, agregaların ortalama çapı kadar, 100 mikrometre, sonra taze MT01 ile kaya inhibitörü olmadan orta% 80 değiştirin, kültüre devam agregaların görüntüleri yakalamak. Agregalar 200 ila 250 mikro metre çapa ulaştığında, biyoreaktörün en altında tüm organoidlerin yerleşmesine izin verin, sonra harcanan tüm ortamı gfCDM farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Baz ünitesini ve biyoreaktörü kuvöze yerleştirin ve ajitasyonu 25 RPM'ye düşürün.Depolanan organoidler supernatant çıkardıktan sonra, pelet için% 15 sakaroz bir mililitre ekleyin ve yavaşça girdap tarafından iyice karıştırın. Bir gecede organoidler kuluçka sonra, dört derece santigrat, sakaroz çözeltisi kaldırmak, sonra% 15 sakaroz bir mililitre ekleyin, 7.5% jelatin, ve yavaşça girdap tarafından hızlı bir şekilde karıştırın. Organoidler 37 santigrat derecede kuluçkaya yatarken plastik bir kabı %15 sakaroz %7.5 jelatin çözeltisi ile yarıya kadar doldurur ve katılaşmasını sağlar.Organoidler bir saat kuluçka yadadıktan sonra, katılaşmış sakaroz ve jelatin üzerine organoid sakaroz jelatin karışımı bir damla yerleştirmek için, bir Pasteur pipet kullanın. Damlanın katılaşması için 15 dakika bekledikten sonra, plastik kabın geri kalanını %15 daha fazla sakaroz, %7,5 jelatin le doldurun, oda sıcaklığında tamamen katılaşmasını bekleyin ve ardından 4 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bir küp halinde jelatin kesin, merkezinde organoidler ile, karton bir parça küp düzeltmek, OCT bileşik bir damla ile, sonra Isopentane 250 mililitre yerleştirilir, 500 mililitrelik fincan içinde, sıvı nitrojen ile uygun bir kap doldurun.Forceps ve kalın eldiven kullanarak, dikkatle Sıvı nitrojen yüzeyine, Isopentane fincan yerleştirin. Isopentane ve sıvı nitrojenler, tehlikeli reaktiflerdir. Bu iki reaktifkullanımı, kalın eldiven ve yeterli havalandırma da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman gerektirir.Isopentane, negatif 80 santigrat dereceye soğuduktan sonra jelatin küpü donana kadar Isopentane'ye yerleştirin. İyi donmuş bir küp, hafifçe kirişlerle dokunduğunda metalik bir ses üretir ve depoya hazır olduğunu gösterir. 50 mililitre 1X PBS ile organoid kesitleri içeren mikroskop slaytlarını beş dakika yıkayın ve slaytları taze 1X PBS içeren coplin kavanozuna aktarın.Slaytları, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 mililitre taze hazırlanmış glisin ve kuluçka içeren Coplin kavanozuna aktarın, ardından slaytları %0,1 Triton'un 50 mililitresini içeren coplin kavanozuna aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika geçirin. Slaytları her seferinde beş dakika boyunca 1X PBS ile iki kez yıkayın. 1X PBS'de ıslatılmış üç milimetrelik kağıtla immünboyama kabını hazırlayın.Dilimlerin her yerine bir doku ile slaytlar kuruve üç milimetrelik kağıt üzerine yerleştirin. Pasteur pipetiyle, her slaytı 0,5 mililitre engelleme çözeltisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkadan sonra, fazla engelleme çözeltisini çıkarın ve dilimlerin her yerinde bir doku ile slaytları sürükleyin.Her slayt üzerine seyreltilmiş primer antikor 50 mikrolitre yerleştirin ve kapak fişleri ile kaplayın. Dantel slaytlar, daha önce hazırlanmış immunostaining çanak, ve dört derece santigrat onları kuluçka. Bir gece kuluçka sonra, bir Coplin kavanoza slaytlar aktarın, TBST 50 mililitre ile, kapak fişleri düşmesine izin, sonra TBST ile slaytlar üç kez yıkamak, beş dakika her zaman.Her slaytüzerine seyreltilmiş ikincil antikor 50 mikrolitre yerleştirin ve kapak fişleri ile kaplayın. Slaytlar yerleştirin, önceden hazırlanmış immunostaining çanak, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka, ışıktan korunan. Slaytları tekrar Coplin kavanozuna aktarın ve her seferinde beş dakika boyunca 50 mililitre TBST ile üç kez yıkayın.Pasteur Pipeti kullanarak, 0,5 mililitre dappy çözeltisi, her slayt tüm yüzeyüzerinde ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka. Biyoreaktörde 24 saat kaldıktan sonra, iPSC'nin verimli bir şekilde oluşan küresel şekilli agregaları. Morfolojisi beşinci güne kadar bakımlıydı ve boyutu nda kademeli bir artış oldu.Yüksek derecede homojenlik gösteriyor. Mikroskopi ile yapılan kantitatif analiz, aynı zamanda normal dağılım ortaya, ilk güne kadar toplam boyutları, ve her iki hücre hatları gün iki optimum toplam boyutuna ulaştı. İstenilen agrega çapı sağlandıktan sonra nöral bağlılık başlatıldı ve daha sonra farklı serebellar ataların üretimi teşvik edildi.Diferansiyasyon organoidleri sırasında, luminal alana sahip nöral tüp benzeri yapılara benzer daha belirgin bir epitelizasyon gösterdi. Ayrıca organoid çap dağılımı, 14. İmmünofloresans analizi destekler, etkili bir nöral bağlılık, iPSC türetilmiş organoidler, zaten elde edilir, farklılaşma gün yedi.İmmünostaining de gösterdi, etkin serebellar bağlılık ve serebellar organoidlerin verimli olgunlaşma. Ayrıca, biyoreaktörde 80 gün sonra, organoidlerin canlı ölü boyama yüksek hücre canlılığı gösterdi, ve nekrotik alanlarda hiçbir kanıt. Bu teknik önemli bir aracı temsil eder, patolojik yollar incelenmesi için, serebellar dejenerasyonu gözlenen ve yeni ilaçların terapötik etkisini değerlendirmek için rol.

scalable-generation-mature-cerebellar-organoids-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Bu video, tek kullanımlık bir 3D biyoreaktör kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) olgun serebellar organoidler üretme tekniğini göstermektedir. Biyoreaktör, daha sonra iPSC agregatlarının olgun serebellar organoidlere farklılaşmasını indükleyen büyüme faktörleri ve kemokinler açısından zenginleştirilmiş bir dizi kültür ortamı ile muameleye tabi tutulan iPSC agregat oluşumunu kolaylaştırır. Daha sonra, organoidler hasat edilir ve daha fazla analiz için dondurularak...

Tek Kullanımlık Biyoreaktörler Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Olgun Serebellar Organoidlerin Üretilmesi

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri serebellar progenitörlere ayırmak için bir protokolü göstermektedir. Embriyoid cisimcikleri oluşturmak için kök hücre kolonilerinin ultra düşük bir bağlanma plakasına aktarılmasını, büyüme faktörleri ile farklılaşmanın teşvik edilmesini ve daha sonra embriyoid cisimciklerinin yapışma için matris kaplı bir plakaya aktarılmasını içerir. Sonraki adımlar, hücre göçünü indüklemeyi ve glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncülerin ve...

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden 2D Tek Tabakalı Serebellar Hücreler Oluşturma Tekniği

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) küresel beyin organoidlerine dönüşümünü göstermektedir. Spesifik inhibitörler kullanılarak, hPSC'ler, nöroektodermal koloniler oluşturan bir nöronal soya doğru farklılaşmaya yönlendirilir. Daha sonra, kolonilerin kendi kendine örgütlenmesini ve çoğalmasını teşvik eden ve sonuçta küresel beyin organoidlerinin oluşumuna yol açan özel büyüme faktörleri tanıtılır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Sferoid Üretimi

Bu video, organoid olgunlaşmanın göstergesi olan çeşitli serebellar nöronlarda eksprese edilen spesifik hedef antijenleri tanımlamak için serebellar organoid dilimlerinin immünofloresan boyamasını göstermektedir.

Serebellar Organoid Dilimlerin Floresan İmmün Boyanması

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

Mevcut protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen serebral organoidlerin çoğaltılabilir üretimi, bakımı ve yaşlanması için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Bu yöntem, beyin yaşlanması ve yaşa bağlı patogenezde yer alan süreçlerin modellenmesini kolaylaştıran serebral organoidlerin uzun süreler boyunca kültürlenmesini ve olgunlaşmasını sağlar.

Yaşlanma Araştırmaları için iPSC Kaynaklı Beyin Organoidlerinin Uzun Süreli Kültürü için Sağlam Doku Üretimi

Öğrenin, tek kullanımlık biyoreaktörler kullanarak iPSC'lerden ölçeklenebilir serebellar organoid üretimi ve immünboyama ile karakterizasyon yöntemlerini. Bu protokol nörobilim araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet