Name: İmmünfluoresan siyon ile Primer Silyanın Basit Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, immunofluoresan boyama ile fibroblastlarda primer silyayı hızlı ve güvenilir şekilde tespit etme yöntemini. Bu protokol, hücre biyolojisi ve silya işlev bozuklukları araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çek Cumhuriyeti Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir - Uzun vadeli organizasyon geliştirme planı Askeri Sağlık Bilimleri Fakültesi, Savunma Üniversitesi Kitle İmha Silah Tıbbi Yönleri; Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti (Özel Araştırma Projesi No: SV/ FVZ201703) ve PROGRES Q40/06. Ayrıca Daniel Diaz İngilizce dil revizyon yaptığı tür yardım için teşekkür ederiz.

1. Kültür ortamının, çözümlerinin ve yemeklerinin hazırlanması
<ol><li>Otoklav kapakları (22 x 22 mm). 6 iyi plaka hazırlayın. Çözülme fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik penisilin / streptomisin ve oda sıcaklığına kültür ortamı sıcak (RT). Tripsin-EDTA (%0.25) kullanın ve 1x PBS (kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin) hücreleri geçmesi.</li>
	<li>DH2O'nda taze %4 paraformaldehit (PFA) (20 mL dH2O'da 800 mg PFA) hazırlayın. PfA her deney için yeni olarak hazırlanmalıdır. Çözeltiyi 55 °C'de kaputta 30 dk ısıtın. RT. Çözelti netleşene kadar 1 M sodyum hidroksit ekleyin (pH = 7.2-7.4). 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın. Not: PFA toksiktir; her zaman yeterli kişisel koruyucu ekipman giymek ve kimyasal başlık hazırlamak.</li>
	<li>%10 FBS, %1 penisilin/streptomisin ve %2 glutamin içeren 500 mL kültür ortamı, DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartalı orta) hazırlayın.</li>
	<li>Steril dH2O'da %1 jelatin çözeltisinin 13 mL'sini hazırlayın (13 mL dH2O'da 130 mg jelatin). 6 kuyuluk tabaktaki her kuyu için 2 mL %1 jelatin kullanın. Steril tutun.</li>
	<li>% 70 etanol kullanarak laminar akış kaputunu temizleyin. Deneye başlamadan önce gerekli malzemeyi laminar akış kaputunun içine yerleştirin.</li>
</ol>2. İmmünositokimya boyama için hücre kültürü
<ol><li>Hücreleri eritin (Bu çalışmada C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) standart teknikler kullanarak ve hazırlanan ortamın ~10-12 mL'si ile desteklenen bir T75 şişesinde plakalayın. Hücreler %70 birleştiğinde %37 °C/5% CO2/90% bağıl nem (RH) ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücreleri kuvözden çıkarın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile kısa bir süre 2x durula. T75 şişesine ~2 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve ~5 dk boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücre ayrışmasını izlemek için ters mikroskobu periyodik olarak kontrol edin. NOT: Kuluçka süresi hücre hattına bağlıdır ve bu nedenle ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	<li>Kültür medyasının 10 mL'lik hücrelerini yavaşça askıya alın ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için dikkatlice pipetleme. Gerekirse şişeyi tekrar durula.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 50 mL konik tüp ve santrifüjde ~200 x g'de5 dk yerleştirin. Supernatant decant, kültür medya 10 mL ekleyin ve yavaşça pelet askıya. Hücre süspansiyonunun 20 μL'sini alın ve trypan mavisi ile 1:1 oranında karıştırın ve standart yönteme göre bir sitometrede sayın.</li>
	<li>Cımbız kullanarak 6 kuyuluk tabak her kuyu nun içine bir kapak kaydırın. Kuyulara ~2 mL dökerek kapakları jelatinle kaplar. Bu hücrelerin kapakları eklemek yardımcı olacaktır. Jelatin çözeltisini çıkarın ve birkaç dakika havanın kurumasına izin verin. Kapaklar artık hücrelerin ekimi için hazır. Hemen ekime başlayın.</li>
	<li>Her kuyuya 100.000 fibroblast tohum ve 2 mL kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 °C/5%2CO 2/90% RH'de kuluçkaya yatırın. Bu noktada, hücreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre tedavi edilebilir. Silyasyon indüklemek için tedaviler daha önce tarif edilmiştir4,5. NOT: İlk tohumlama sayısı hücrelerin iki katına çıkarma süresine bağlıdır ve buna göre belirlenmelidir.</li>
</ol>3. Primer siliain in vitro immünükoporesan boyantisi
<ol><li>%4'lük paraformaldehiti RT'ye ısıtın Pasteur pipetleri, 1x PBS (RT), atık konteyneri, 15 mL konik tüpler, mikropipetler (0,5-10 μL, 20-200 μL ve 100-1000 μL) ve ipuçlarını hazırlayın. Kuvözdeki hücreleri alın ve banka yerleştirin. NOT: Boyama işleminin steril koşullarda yapılması gerekmez. Tüm çözümler RT'de olmalıdır.</li>
	<li>Her kuyudan ortamı kaldırın. Kapak kapağını kuyunun içinde bırak. Hücreleri 2 mL 1x PBS ile 3x yavaşça yıkayın. Pasteur pipeti kullanarak, hücreleri onarmak için her kuyuya 2 mL %4 PFA ekleyin. RT.'de 10 dakika kuluçkaya yat. PFA'yı çıkarın ve 1x PBS ile 3x yıkayın. NOT: Kuluçka dönemlerinde tüm kapak kaymasını kapsayacak kadar her zaman yeterli hacim kullanın. Asla hücrelerin kurumasına izin verme. Çözeltilerin hiçbirini doğrudan kapak kapağına dökmeyin.</li>
	<li>Kullanmadan önce 13 mL 1x PBS 10 dk %0,5 Triton X-100 hazırlayın. Her kuyuya 2 mL ekleyin. 15 dakika kuluçka. 1x PBS ile 4 x hafifçe yıkayın. NOT: Triton X-100, PBS'de ÇÖZÜNmez, RT. %0.5 Triton X-100 çözeltisini 37 °C'ye kadar su banyosunda çözünür.</li>
	<li>Kullanmadan önce keçi serumu 5 dk eritin. Keçi serumunu 1x PBS'de 1:20 oranında bloke edici bir çözelti olarak seyreltin. Her kapak slip'e 150 μL ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Gerekirse blokaj süresini 60 dk'ya kadar uzatın. Keçi serumu ile bloke sonra hücreleri yıkamayın.</li>
	<li>Birincil antikorları (yani, anti-acetylated alfa tubulin ve anti-gama tubulin) 5 dk kullanmadan önce eritin. Antikorları 1x PBS'de ayrı ayrı şu şekilde seyreltin: fare 1:800 oranında asetilalfa tubulin ve 1:300 oranında tavşan anti-gama tubulin. Engelleme çözümlerini kaldırın. Yıkamayın. Kapaklara her iki antikor seyreltmesinin 150 μL'sini ekleyin ve RT'de 60 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Bir gecede kuluçkaya yatan primer antikor solüsyonlarının 500-1.000 μL'sini kullanıyorsanız, 6 kuyu plakasını parafin filmli kapatın ve 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, nem odasında 150 μL antikor ve kuluçka kullanın.</li>
	<li>Birincil antikorları çıkarın. 2 mL 1x PBS ile kapakları çok hafifçe 3x yıkayın. 1:300 oranında Ayrı Cy3 koyun anti-fare ve Alexa Fluor488 keçi anti-tavşan seyrelterek 1x PBS ikincil antikorlar hazırlayın. Kapaklara her iki sekonder antikor seyreltmesinin 150 μL'sini ekleyin. Karanlıkta RT 45 dakika kuluçka. NOT: Fotobeyazlama önlemek için karanlıkta kuluçka. Gerektiğinde diğer ikincil antikor kombinasyonları kullanılabilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre bir DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindole) çözeltisi hazırlayın. Fazla aliquotları -20 °C'de saklayın. 1x PBS'nin 50 mL'inde bir stok aliquot'undan (1:5.000) 10 μL seyreltin. Bu seyreltmenin 2 mL'sini kapaklara ekleyin. Karanlıkta RT 5 dakika kuluçka. NOT: Fotobeyaztlamayı önlemek için karanlıkta ki hücreleri kuluçkaya yatırmak önemlidir. DAPI seyreltme 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Hazırlamak 2 iğneler, slaytlar, cımbız ve montaj medya. Slaytları etiketle.</li>
	<li>DAPI çözümlerini kuyulardan çıkarın. 1x PBS ile 3x yıkayın. Her slayta bir damla montaj ortamı koyun. Kapağı kuyunun dibinden hafifçe kaldırmak için iğneyi kullanın. Cımbızkullanarak kapağı çevirin ve yavaşça montaj ortamının üzerine yerleştirin. Dikkatlice herhangi bir kabarcıklar kaldırın.</li>
	<li>Slaytları ışıktan koruyun ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Primer silya görselleştirmek için yüksek büyütme ile bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın. NOT: Slaytlar karanlıkta 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyiyok.

Çeşitli yazarlar birincil silya tespiti için çeşitli yöntemler açıklanan, bazen de kendi algılama etkileyebilir çeşitli fiksasyon yöntemleri açıklayan6,20,21,22. Ne olursa olsun, algılama için tam ve basit bir protokol bulmak zordur. Böyle bir yöntemin hazır kullanılabilirliği şüphesiz birincil silya soruşturma çalışmasına büyük yardımcı olacaktır, özellikle araştırmanın erken aşamalarında ya d...

Primer silia duyusal, soliter, membrana bağlı, hücrenin ana centriole ile ilişkili nonmotile yapılardır. Primer silya kırmızı kan hücreleri hariç en omurgalı hücrelerde bulunur, adipositler1, ve hepatositler2. Primer silya, ana bileşeni α-tubulin olan mikrotübüllerden oluşan uzamış bir aksonme olarak oluşur. Aksonme γ-tubulin yapılandırılır bazal gövde, yetişir. Primer silyanın uzunluğu 2-10 μm arasında değişir; ancak, boyutları glisilasyon sırasında değişebilir, açlık, hipoksi, sitotoksik stres, ya da iyonlaştırıcıradyasyonamaruz kaldıktan sonra 3,4,5,6,7. Genellikle, hücrelerin sadece bir birincil cilium var, hangi morfogenez ve hücre sinyalyolları hücre çoğalması ve farklılaşma için önemli yer almaktadır8,9.
Primer silia, özellikle G0/G1 evrelerinde hücre döngüsü ilerlemesi sırasında dinamik olarak düzenlenir ve HDAC6 (histone deacetylaz 6)10aracılı tubulin deasetilasyonu ile ilişkili bir süreçte mitoz bölünmeye girmeden önce rezorbe edilir. Primer silia rezorpsiyon tam an hücre tipi ve doğrudan aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13gibi bu süreçte yer genlerin ekspresyonuna bağlıdır.13 Hücre tipine bağlı olarak, primer silya reseptörleri farklı ifade, iyon kanalları, ve aktif sinyal yolları. Bunlar arasında proliferasyon ve sağkalımı etkileyen en önemli sinyal reseptörleri, EGFR, PDGFR ve FGFR bulunmaktadır. Kirpi, Çentik ve Wnt gibi bir veya daha fazla organın işlevini etkileyebilecek sinyal yollarından bazıları da dahildir. Bu fonksiyon birincil silya Çentik için belirli ligands tespit sağlar, hormonlar, ve serotonin veya somatostatin gibi biyolojik olarak aktif maddeler. Farklı uzunluklarda primer silya tarafından sergilenen diğer özel fonksiyonlar sıcaklık, yerçekimi ve osmolality14değişikliklere reaksiyon içerir.
Birincil silia canlı görselleştirme, iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da birincil silia55,15,,16,17otomatik algılama için yazılım gibi çeşitli yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak, bu yöntemler son derece uzmanlaşmış ve devam eden araştırma araştırma her aşamasında birincil silya boyama için temel, hızlı ve kolay yöntemler ihtiyacı vardır. Açıklanan kültürlü hücrelerde birincil silya tespiti için kolay ve yararlı bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>Boyutlar 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')? Parça: Keçi, Anti-Tavşan, IgG</td></tr>, <tr><td>Anti-Tubulin ve gama;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Poliklonal Tavşan anti-Fare IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (fare)</td></tr> <tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-Fare IgG (tüm molekül) F (ab & prime;)2 parça&ndash; Koyun Dapi'de üretilen Cy3 antikoru</td></tr><tr><td>(4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&akut; s Modifiye Kartal ve akut; s orta</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>Yüksek glikoz, glutamin yok, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Salam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>MgCl 2 ve CaCl <2 / sub> ile, Steril filtreli, Hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Termo Bilimsel</td><td>16000044</td><td>Steril Filtreli, Gibco</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>Fare embriyonik fibroblastı</td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-Asetillenmiş Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Fare NHLF'de üretilen Monoklonal Anti-Asetilatlenmiş Tubulin antikoru</td></tr><tr><td></td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>Primer akciğer fibroblastları (insan)</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>% 0.9 NaCl'de mL başına 10.000 ünite penisilin ve 10 mg streptomisin, Steril Filtreli</td></tr><tr><td>ProLong Elmas Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Cilt fibroblastları</td><td>Charles Üniversitesi, Hradec Tıp Fakültesi'nden nazikçe hediye edilmiştir. sevgi&eacute;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kare Kapak Slipleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>Borosilikat cam, 22x22mm, Kare</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>25200072 Steril Filtreli, Gibco</td></tr></tbody></table>

İmmünfluoresan siyon ile primer silya'nın basit tespiti

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primer silya, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında, özellikle hücre döngüsünün G0/G1 evreleri sırasında, mitoz dan önce rezorbe edilir. Primer silia iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da primer silia otomatik algılama için yazılım kullanarak dahil olmak üzere son derece sofistike yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak bu yöntemlerin gerçeklefltirilmesi için primer silyanın immünüdüoresan boyamasi gerekmektedir. Bu yayın asetilli alfa tubulin boyama tarafından primer silia in vitro kolay tespiti için bir protokol açıklar (aksoneme) ve gama tubulin (bazal vücut). Bu immünofloresan boyama protokolü nispeten basittir ve yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanır. Bu protokol, primer silya'yı ifade eden dört hücre hattının (C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) nasıl sabit, immünosülvetli ve floresan veya konfokal mikroskopla görüntülenmiş olduğunu açıklamaktadır.

Primer silianın immünoresan boyama yüksek kaliteli görüntüler le sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu deneylerde, primer silya ifade eden fibroblastlar, yukarıda açıklanan protokole göre floresan veya konfokal mikroskopiçinde sabit, immünoskoplu ve görüntülendi. Primer cilyum asetilatlı α-tubulin ve γ-tubulin kullanılarak saplandı. Primer silianın değerlendirilmesi çeşitli düzeylerde yapılabilir ve bu konudaki herhangi bir değişiklik iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma ile bağlantılı olabilir, hücre metabolizması ...

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Bu protokol, çeşitli araştırma çalışmaları içinde, kültürlü hücrelerde birincil silya hızlı ve kolay tespit sağlar. Yöntem primer silya bazal organları etkileyen bozukluk kullanılabilir. Bu işlem aynı zamanda parafin gömülü dokuda primer silia boyama veya floresan gerekli diğer deneyler için uygulanabilir.22'ye 22 milimetrelik kapak fişlerini otomatikleştirerek ve deney için malzeme hazırlayarak başlayın. Çözülme FBS ve penisilin streptomisin, ve oda sıcaklığına kültür orta Sıcak. Tripsin EDTA ve PBS ile hücreleri geçiş.El yazması talimatlara göre taze %4 paraformaldehit, kültür ortamı ve %1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra laminar akış başlığı %70 etanol ile temizleyin ve gerekli tüm malzemeleri içine yerleştirin. Paraformaldehit son derece tehlikelidir.Uygun PPE her zaman giyilmelidir, ve sadece kimyasal bir başlık ele alınmalıdır. İstenilen hücreleri %70'e çıkardıktan sonra kuvözden çıkarın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. Kültür ortamını çıkarın ve pbs ile hücreleri iki kez durula.Kültür şişesine yaklaşık iki mililitre 0.25% tripsin EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Müfrezeyi izlemek için hücreleri ters mikroskopta periyodik olarak kontrol edin. Hücreler yavaşça kültür orta 10 mililitre onları resuspend ayırdı, tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için dikkatle pipetting.Hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik konik bir tüp verin ve 5 dakika boyunca 200 kez G'santrifüj edin. Decant supernatant sonra kültür orta 10 mililitre ekleyin ve yavaşça pelet resuspend. Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini alın ve bire bir hacim oranında trypan mavisi ile karıştırın.Sonra standart hemositometri kullanarak hücreleri saymak. Altı kuyu plakasının her kuyusunun içine bir kapak fişi yerleştirin ve kapak kaymasına bağlı hücrelere yardımcı olacak iki mililitre jelatin çözeltisi ile kapak fişini kaplayın. Jelatini çıkarın ve plakanın birkaç dakika kurumasına izin verin.Tohum 100, 000 fibroblastlar her kuyuya ve kültür orta iki mililitre ekleyin. Sonra hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit ve %90 bağıl nemde kuluçkaya yatırın. Kuluçka dan sonra siliasyon indüklemek için hücreleri tedavi.Oda sıcaklığına % 4 paraformaldehit ısıtın ve bir mera pipetleri, ABS, bir atık konteyner, 15 mililitre konik tüpler, mikro pipetler ve ipuçları hazırlayın. Kuvözdeki hücreleri alın ve laboratuar bankına yerleştirin. Her kuyudan ortamı çıkarın ve kapak fişini bırakarak.Hücreleri iki mililitre PBS ile üç kez hafifçe yıkayın. Sonra hücreleri düzeltmek için her kuyuiçine% 4 PFA iki mililitre ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından PFA'yı çıkarın ve PBS ile yıkarları tekrarlayın.Her kuyuya %0,5 Triton X-100'ün iki mililitresini ekleyin ve tabağı 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra pbs ile kuyuları dört kez yıkayın. Engelleme çözeltisi yapmak için, beş dakika boyunca bir keçi serumu eritin ve PBS bir ila 20 oranında seyreltin.Her kapak kayma için bu çözeltinin 150 mikrolitre ekleyin ve 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Birincil antikorları beş dakika boyunca eritin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi PBS'de ayrı ayrı seyreltin. Kapak fişlerinden bloke solüsyonu çıkarın ve her iki antikor çözeltisinden 150 mikrolitre ekleyin.Sonra oda sıcaklığında 60 dakika boyunca plaka kuluçka. Birincil antikorları çıkarın ve iki mililitre PBS ile kapağı üç kez hafifçe yıkayın. Seyreltik Cy3 Koyun Anti-Mouse ve Alexa flor 488 Keçi anti-Rabbit PBS, bir ila 300 oranında, ve kapak kayma her iki ikincil antikor çözümleri 150 mikrolitre ekleyin.PBS 50 mililitre stok 10 mikrolitre seyreltme tarafından çalışan bir DAPI çözeltisi hazırlayın ve kapak fişleri için bu seyreltme iki mililitre ekleyin. Tabağı karanlıkta, oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kapak fişlerini slaytlara yerleştirmeden önce, iki iğne, cımbız ve montaj ortamı hazırlayın ve tüm slaytları etiketlayın.DAPI çözeltisini kuyulardan çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Her slayta bir damla montaj ortamı koyun. Kapağı kuyunun dibinden hafifçe kaldırmak için iğneyi kullanın.Sonra çevirin ve yavaşça cımbız kullanarak montaj ortamı damla üzerine yerleştirin. Dikkatlice herhangi bir kabarcıklar kaldırın. Slaytları ışıktan koruyun ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın.Ertesi gün primer silya görselleştirmek için yüksek büyütme ile bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın. Bu protokol immünleke düzeltmek için kullanılmıştır, ve görüntü çeşitli hücre hatları birincil silya ifade. Fare miyoblastları çeşitli dozlarda iyonlaştırıcı radyasyona maruz kaldığında, daha yüksek dozlarda birden fazla primer silia görünümünü indüklediği bulunmuştur.Düşük dozlarda tek primer silya görünümünü neden iken. Benzer şekilde, insan akciğer fibroblastları düşük dozda yayıldığında, immünoresans tarafından tek primer silya saptandı. Açlıktan ölen fare embriyonik fibroblastlarında primer silyada artış gözlendi ve metabolik stresin primer silya olaylarını etkilediğini gösterdi.Deri fibroblastları 120 nanomolar doksorubisin ile tedavi edildiğinde, tek bir primer cilium ifade. Yüksek dozlarda birden fazla primer silya görünümünü indükler. Fibroblastlar 1.25 nanomolar Taxol ile tedavi de tek bir birincil cilium ifade.Ama birden fazla silya yüksek dozlarda tedaviden sonra tespit edilmedi. Bu protokolü açarken tüm PPE yönetmeliklerine uyun. Seçtiğiniz hücre hattının kültür ihtiyaçlarını unutmayın ve antikorlarınızı dikkatle seçtiniz.Hücreler geri alınamaz olduğundan, bu yordam doğrudan diğer yordamlar tarafından takip edilemez. Bunun yerine, paralel deneyler programlanmalıdır.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Koku alma duyusal nöronlarının kirpikleri, sinyal iletim kaskadının proteinlerini içerir, ancak kriyoseksiyonlarda dağılımlarının ayrıntılı bir uzamsal analizi zordur. Burada, siliyer proteinlerin tüm montaj etiketlemesi ve yüz görselleştirmesi için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Burada, in vivo ve ex vivo spesifik fizyolojik yanıtlarda yer alan nöronal popülasyonların tanımlanması için kullanılan klasik bir teknik olan c-FOS protein immünohistolojik tespitine dayalı bir protokol sunuyoruz.

c-FOS Protein Immünohistolojik Algılama: Belirli Fizyolojik Yanıtları ilgilendim Merkez Pathways bir Marker Olarak Faydalı Aracı<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; Ex Vivo</em

Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Görüntüleri analiz etmek için yapay zekanın (Ai) kullanımı, yaygın olarak kullanılan yöntemlere kıyasla güçlü, daha az önyargılı ve hızlı bir yaklaşım olarak ortaya çıkıyor. Burada Ai'yi hücresel bir organel, birincil cilia'yı tanıması ve uzunluk ve lekelenme yoğunluğu gibi özellikleri titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz etmesi için eğitdik.

Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Yüksek hızlı video mikroskopi analizi, gerçekleştirilmesi nispeten kolay, hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde, primer siliyer diskinezinin birinci basamak teşhisi için oldukça güvenilir bir araçtır ve ciddi akciğer hastalıklarının teşhisi ve tedavisinde yer alan her merkezde mevcut olmalıdır.

Primer Siliyer Diskinezinin Birinci Basamak Tanısı için Yüksek Hızlı Video Mikroskopi Analizi

Bu yöntem, bir ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modelindeki endojen sinyalin, doku toplamadan kirpik organizasyonunun analizine kadar, mineralize dokunun geniş alanlarında üç boyutlu olarak primer kirpikleri yerinde görüntülemek için kullanılmasını tanımlar. Bu protokol diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Laminopati bozuklukları genellikle nükleer zarfta değişikliklere yol açar ve bu da nükleer kanama ve sızıntıya neden olabilir. Bu çalışma, memeli hücrelerinde nükleer yapıyı ve bütünlüğü değerlendirmek için bir araç sağlayan, çift sarmallı DNA (dsDNA) ile birlikte nükleer laminayı görselleştirmek için bir immünofloresan yöntemi sunmaktadır.

İmmünofloresan ile Memeli Hücrelerinde Nükleer Kanama ve DNA Sızıntısının Tespiti

Öğrenin, immunofluoresan boyama ile fibroblastlarda primer silyayı hızlı ve güvenilir şekilde tespit etme yöntemini. Bu protokol, hücre biyolojisi ve silya işlev bozuklukları araştırmalarında kullanılır.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Daha fazla video keşfet