Name: Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Öğrenin, Aspergillus enfeksiyonlarını araştırmak için zebra balığı larvalarına mikroenjeksiyon tekniğiyle spor enjekte etme yöntemini. Bu model, canlı konakçıda bağışıklık hücre-patojen etkileşimlerini gerçek zamanlı görselleştirerek invaziv aspergilloz tedavileri için yeni terapötik hedefler keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü tarafından K22AI134677 Ödül Numarası altında desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Araştırmacılar, uygun hayvan bakım ve kullanım komitelerinden tüm hayvan deneyleri için onay almalıdır. Bu makalede gösterilen temsili veriler, Clemson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AUP2018-070, AUP2019-012) tarafından onaylanan protokoller kapsamında yapılan deneylerden elde edilmektedir.
1. Aspergillus sporlarının enjeksiyon için hazırlanması
<ol><li>Aspergillus spor süspansiyonundan, 1 x 106 spor elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. Hacim 20–100 μL olmalıdır; değilse, % 0.01 (v/ v) steril Ara-20'de (Ara su) 10x seyreltme üretin; Malzeme Masası). Örneğin, hesaplanan hacim 5 μL ise, 10x seyreltme üretin ve seyreltilmiş çözeltinin 50 μL'sini kullanın. NOT: Daha fazla spor toplamak için veya kontaminasyon durumunda yedek olarak iki plaka/ suş hazırlanabilir.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabininde steril tek kullanımlık L şeklinde bir serpici ile bir glikoz minimal ortam (GMM) plakasına(Malzeme Masası)1 x10 6Aspergillus sporları sürün. Plakanın kenar boşluğuna yayılmaktan kaçının. Plaka baş aşağı bakacak şekilde 3-4 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslayın.</li>
	<li>Toplama gününde, steril miracloth ve 50 mL konik tüpler (suş başına iki), taze steril Ara su şişeleri (suş başına bir) ve steril tek kullanımlık L şeklindeki serpicileri biyogüvenlik kabinine getirin. NOT: Miracloth parçalar halinde ~8 x 6'da kesilebilir, folyoya sarılabilir ve sterilize etmek için otoklavlanabilir.</li>
	<li>Etiketli her 50 mL konik tüpe bir parça miracloth yerleştirin ve yeniden kaplanın. Kalan miracloth paketini kaputtan çıkar.</li>
	<li>Plakaları biyogüvenlik kabinine getirin. Bir tabak açın, sonra tabağın yaklaşık dörtte üçünü kaplayacak şekilde üzerine Ara suyu dökün.</li>
	<li>Tek kullanımlık L şeklinde bir serpme kullanarak, mantar kültürünün yüzeyini ileri geri hareketle hafifçe kazıyın, diğer el ile plakayı döndürün. Neredeyse tüm sporlar ara suya homojenize olana kadar kazıyın. NOT: Yüksek hidrofobiklik nedeniyle, ara su eklendiğinde veya kazıma sırasında sporlar "puflar" oluşturabilir. Yakındaki tüplerin veya plakaların kirlenmesini önlemek için büyük özen verilmelidir. Eldivenlerin değiştirilmesi ve farklı suşların ekstraksiyonu arasında% 70 etanol ile yüzeyden silinmeleri önerilir.</li>
	<li>Bir adet 50 mL konik tüp alın ve miracloth parçasını çıkarın. İkiye katlayın ve 50 mL konik tüpün üstüne yerleştirilmiş bir filtre haline getirin.</li>
	<li>Mantar homojenatını plakadan miracloth'un üzerine tüpe dökün. NOT: Bir suşun iki plakası hazırlanırsa, her iki plakayı da kazıyın ve aynı konik tüpe dökün.</li>
	<li>Konik tüpteki toplam hacmi 50 mL'ye çıkarmak için ara su dökün.</li>
	<li>10 dakika boyunca 900 x g'da döndürün. Santrifüjde aerosolizasyon önleyici kapaklar kullandığınızdan emin olun.</li>
	<li>Arındırmak için süpernatantı ~% 10 çamaşır suyu çözeltisine dökün. Konik tüpe 50 mL steril 1x PBS dökün, ardından peleti yeniden çıkarmak için girdap veya sallama.</li>
	<li>10 dakika boyunca 900 x g'da tekrar döndürün. Süpernatant dökün ve peleti 5 mL steril 1x PBS'de yeniden diritin. Taze bir miracloth parçasından 50 mL'lik yeni bir konik tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Mantar homojenliğinin 10 kat seri seyreltmelerini (10x, 100x, 1000x) 1,7 mL santrifüj tüplerinde yapın (örneğin, 10x çözeltisi için, mantar homojenliğinin 100 μL'sini 900 μL Ara su ile karıştırın).</li>
	<li>Ara suya boşaltıldığında sporların görünmediği ilk seyreltmeyi seçin ve hemositometre kullanarak spor sayısını saymak için bu seyreltmeyi kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak hazırlanan mantar homojenatındaki (su süspansiyonu) spor konsantrasyonu hesaplayın: Konsantrasyon (sporlar/mL) = Ortadaki spor sayısı 25 kutu x seyreltme faktörü x 104</li>
	<li>Steril 1x PBS'de 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde 1,5 x 108 spor/mL'lik 1 mL'lik bir stok hazırlayın. Bu spor hazırlığı ~ 4 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Enjeksiyonlarda kullanılmadan önce, 1 x 108 spor/ mL'lik son bir spor konsantrasyonu elde etmek için 20 μL spor preparatını 1.7 mL santrifüj tüpünde% 1 steril fenol kırmızısının 10 μL'si ile karıştırın. Enjeksiyondan önce iyice girdap. NOT: %1 fenol kırmızı çözelti filtre sterilize edilmeli ve aliquotlarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Sahte bir enjeksiyon için, 20 μL 1x PBS'yi 10 μL% 1 steril fenol kırmızısı ile karıştırın.</li>
</ol>2. Enjeksiyon için agar plakalarının hazırlanması
<ol><li>E3 ortamında% 2 agarose hazırlayın ve bir mikrodalgada eritin.</li>
	<li>100 mm x 15 mm Petri kabına (plaka başına ~ 25 mL) dökün, plakayı eşit şekilde örtmek için döndürün ve soğumaya bırakın.</li>
	<li>Plakayı parafin filmi ile sarın ve 4 °C'de ters olarak saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyondan önce plakayı oda sıcaklığına (RT) getirin.</li>
	<li>Plakaya ~1 mL filtre sterilize edilmiş %2 sığır serum albümini (BSA) dökün, tüm tabanı yaymak ve örtmek için plakayı eğin ve E3 ile durulayın. NOT: %2 BSA çözeltisi filtre sterilize edilebilir ve -20 °C'de 1 mL aliquots olarak saklanabilir% 2 BSA ön işlem larvaların agarose yüzeyine yapışmasını önler.</li>
	<li>Plakaya tamponlu trikain ile E3 dökün ve enjeksiyona kadar bekletin.</li>
</ol>3. Zebra balığı larva arka beyin ventrikül mikroenjeksiyon
<ol><li>Bir Petri kabında 2 dpf'de yaban arıları ile larvaları manuel olarak kaynatır. NOT: Dekonsiyon 1,5 dpf'den enjeksiyon zamanına kadar her zaman yapılabilir.</li>
	<li>Petri kabından mümkün olduğunca çok E3 çıkarın ve larvaları uyuşturmak için E3'te tamponlanmış 300 μg / mL trikain ekleyin. NOT: E3'te tamponlanmış 4 mg/mL trikain stok çözeltisi hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Çalışma çözeltisi, stok çözeltisinin 4 mL'si E3 ile 50 mL'ye kadar seyreltilerek yapılabilir.</li>
	<li>Basınç enjektörü, sırt basınç ünitesi, ayak ispiyoncu, mikropipet tutucu, mikromanipülatör ve manyetik bir stand ve plaka ile birlikte verilen bir mikroenjeksiyon kurulumu kullanın, hepsi basınçlı hava kaynağına(Malzeme Tablası)bağlı.</li>
	<li>Basınçlı hava vanasını açın ve mikroenjektörü açın. Basıncı ~25 PSI, darbe süresini 60 ms ve geri basınç ünitesini 1 PSI olarak ayarlayın.</li>
	<li>Yaklaşık 3-5 μL hazırlanmış PBS veya fenol kırmızısı spor süspansiyonlu bir mikro doldurucu pipet ucu(Malzeme Masası)kullanarak bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. İğneyi mikromanipülatöre monte edin. NOT: Mikroenjeksiyon iğneleri daha önce açıklandığı gibi hazırlanabilir23. Mikroenjeksiyonlar için kullanılan stereo mikroskop, mikroenjeksiyon iğnesini kalibre etmek için bir göz parçası retiküline sahip olmalıdır. Retikül bir kademeli mikrometre ile kalibre edilmeli ve retikül ölçeğinin (μm) uzunluğu belirlenmelidir. İğneden fırlayan spor süspansiyon damlasının çapı, damla ile örtüşen hash sayısına (retikülün) bağlı olarak ölçülür.</li>
	<li>Mikromanipülatörü, iğnenin ucu stereo mikroskop altında en düşük büyütmede görüntülensin diye konumlandırın. İğneyi görünümde tutarak 4x büyütmeye yakınlaştırın.</li>
	<li>Keskin tokalar kullanarak iğnenin ucını kırpın. Çıkan damlacık boyutunu görselleştirmek için enjeksiyon pedalı tuşuna basın. ~3 nL spor süspansiyonu enjekte edilene kadar kırpmaya devam edin (burada, bu beş hashes' tir).</li>
	<li>Larvalar enjeksiyon plakasına düzenlenirken yanlışlıkla iğneye çarpmamak için mikromanipülatör ve iğneyi yoldan çıkar.</li>
	<li>Enjeksiyon plakasından E3-Tricaine dökün, ardından ~24 anestezi edilmiş larvayı bir transfer pipet kullanarak mümkün olduğunca az E3 ile enjeksiyon plakasına aktarın.</li>
	<li>Zebra balığı larvalarını (yani saç döngü aracını veya kirpik aracını) manipüle etmek için küçük bir araç kullanarak larvaları karşı karşıya oldukları yöne göre düzenleyin. Özellikle, tüm sağa bir satırda ve hepsi aşağıda bir satırda sola bakacak şekilde yerleştirin. NOT: Larvalar yer dışında "yüzeceğinden" plakada çok fazla sıvı varsa bu düzenleme zordur. Bununla birlikte, larvalar kuruyabileceği veya anestezi yıpranabileceği için enjeksiyonlar uzun sürerse çok az sıvı da sorunludur. Bu nedenle, tüm mikroenjeksiyon işlemi boyunca plakadaki sıvı miktarına dikkat edilmelidir.</li>
	<li>Mikroskop yakınlaştırmasını en düşük büyütmeye ayarlayın. Mikromanipülatörü geri getirin ve iğnenin larvalara yakın olacak şekilde, görüş alanının ortasında ~ 30 ° - 60 ° açıyla düzenleyin.</li>
	<li>En yüksek büyütmeye yakınlaştırın ve iğnenin konumunu daha fazla ayarlamak için ince ayar düğmelerini kullanın. Spor süspansiyonu larvaların yanındaki plakadaki sıvıya enjekte ederek iğneden ~30-70 spor çıktığını doğrulayın. Gerekirse enjeksiyon kurulumundaki zamanı ve basıncı ayarlayın. NOT: İğneden çıkan spor sayısı zamanla artabileceğinden veya azalabileceğinden, bu test her beş ila altı larvadan sonra tekrarlanmalıdır.</li>
	<li>Larvaların iğneye doğru yöneldiği satırdan başlayarak, plakayı iğnenin doğrudan üstünde olacak ve ilk larvaların yanına yer olacak şekilde hareket ettinin.</li>
	<li>İğneyi mikromanipülatörle hareket ettirerek, iğneyi otik vezikülün etrafındaki dokudan geçirerek arka beyin ventrikülüne delin. İğne açısıyla larvaların doğru yönünü elde etmek için plakayı gerektiği gibi diğer elinizle hareket ettirin.</li>
	<li>İğnenin ucunun arka beyin ventrikülünün merkezinde olduğunu görsel olarak doğrulayın, spor enjekte etmek için ayak pedalını basın ve iğneyi hafifçe geri çekin. NOT: Fenol kırmızı boyası öncelikle arka beyin ventrikül içinde kalmalıdır. Küçük bir miktar orta beyine gidebilir, ancak beyine veya beynin dışına ulaşmamalıdır. Varsa, enjekte edilen hacim çok büyüktür ve basınç ve zaman buna göre azaltılmalıdır veya yeni bir iğne kalibre edilmelidir.</li>
	<li>Plakadan aşağı inerken, o sıradaki tüm larvaları enjekte edin. Ardından, plakayı çevirin ve diğer sıradaki tüm larvaları enjekte edin. NOT: Başarısız bir şekilde enjekte edilen veya yanlışlıkla hasar gören larvalar 1) kırmızı bir işaret oluşturmak için yumurta sarısına birkaç kez enjekte edilmesi veya 2) larvayı iğne ile sıranın dışına sürüklemesi ile işaretlenebilir.</li>
	<li>İğneyi tekrar yukarı ve yoldan çek. Mikroskopta daha düşük bir büyütmeye uzaklaştırın. Fenol kırmızı boyası her larvanın arka beyinlerinde hala görülebilir olmalıdır.</li>
	<li>İlk olarak, herhangi bir larvayı başarısız enjeksiyonlarla atmak için saç halkası aracı ve pipetle çekin. Kalan larvaları taze steril E3 ve transfer pipet ile tabaktan yıkayarak yeni bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>İstenilen son deneysel numune numarası için gerektiği gibi tekrarlayın.</li>
	<li>Larvaları E3 ile en az 2 kat durulayın ve anesteziden iyileşmeyi sağlayın.</li>
	<li>Başka bir tedavi olmadan sağkalım miktarını ölçmek için, bir transfer pipet kullanarak larvaları E3'te 96 kuyu plakasına (kuyu başına 1 larva) aktarın.</li>
</ol>4. Enjekte edilmiş ve uygulanabilir spor numaralarının oluşturulması
<ol><li>Enjeksiyondan hemen sonra, bir transfer pipet kullanarak, enjekte edilen larvalardan yaklaşık sekizini rastgele toplayın ve 1,7 mL santrifüj tüplerine (tüp başına bir larva) aktarın.</li>
	<li>Larvaları trikain ile veya 0,5-2,0 saat boyunca 4 °C'ye yerleştirerek ötenazi.</li>
	<li>Steril 1x PBS'de 1 mL 1 mg/mL ampisilin ve 0,5 mg/mL kanamycin antibiyotik çözeltileri hazırlayın. Kalan çözelti 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra kullanılabilir. NOT: Ampisilin stok çözeltileri 100 mg/mL ve kanamycin 50 mg/mL önceden yapılabilir, filtre sterilize edilebilir ve -20 °C'de aliquotlarda saklanabilir. Çalışma çözeltisini elde etmek için bu 100x'i 1x PBS'de seyreltin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, santrifüj tüpünden mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın, larvayı geride bırakın ve antibiyotiklerle 1x PBS'nin 90 μL'sini ekleyin. NOT: Antibiyotikler, ASPERGILLUS kolonilerinin sayımını engelleyebilecek GMM plakalarında bakteri üremesini önlemek için kullanılır.</li>
	<li>Larvaları 6 dakika boyunca 1.800 salınım/ dak (30 Hz) bir doku liköründe homojenize edin. 30 sn için 17.000 x g'da geri dön.</li>
	<li>Etiket GMM plakaları (homojenize larva başına bir plaka). Steril bir ortam oluşturmak için bir Bunsen brülörü kullanarak, homojenize süspansiyonu bir tüpten GMM plakasının ortasına pipetledi, ardından tek kullanımlık L şeklinde bir serpme aracı kullanarak yayıldı. Homojenatı janta yaymaktan kaçının.</li>
	<li>Plakaları 2-3 gün boyunca 37 °C'de baş aşağı kuluçkaya yatırın ve oluşan koloni sayısını (CFU) sayın.</li>
	<li>Enfeksiyon döneminde canlı spor sayısını ölçmek için, enjeksiyondan (dpi) sonra 1-7 gün içinde 96 kuyu plakasından larvaları toplayın ve santrifüj tüplerine aktarın. 4.1–4.5 adımlarında açıklandığı gibi, GMM plakalarında yayılmak için larvaları ötenazi ve homojenize edin.</li>
</ol>5. Enjekte edilen larvaların ilaç tedavisi
<ol><li>Bölüm 4'den sonra, kalan enjekte edilen larvaları iki 3,5 mm'lik yemeklere bölün: biri ilaç tedavisi ve diğeri kontrol için. Durum başına yaklaşık 24 enfekte larva kullanın. NOT: 3,5 mm'lik yemekler suda% 2 yağsız kuru sütle tedavi edilebilir, durulanabilir, havayla kurutulabilir ve önceden RT'de saklanabilir. Sütle kaplama, larvaların plastiğe yapışmasını önleyecektir.</li>
	<li>İstenilen ilaç solüsyonunu ve aracı E3'te konik tüplerde metilen mavisi olmadan gerekli son konsantrasyona göre hazırlayın, ardından iyice karıştırın. Örneğin, deksametazonlara maruz kalan larvaların hayatta kalmasını izlemek için, deksametazon için 24 larva (çoğalır) ve DMSO gibi araç kontrolü için 24 larva kullanın. İlaç çözeltisinin 5 mL'sini gerekli konsantrasyonda hazırlayın. Burada% 0.1 DMSO'nun 5 mL'si ve 10 μM deksametazon kullanıldı ve 24 larva / durum araç / ilaç çözeltisinin / larvalarının ~ 200 μL'sine aktarıldı.</li>
	<li>Transfer pipeti ile bir tabaktan mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın ve araç kontrolü içeren önceden karıştırılmış E3 ekleyin. Diğer yemek için ilginin tedavisini içeren önceden karıştırılmış E3 ile tekrarlayın.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak larvaları 96 kuyu plakasına (kuyu başına bir larva) aktarın. Araca veya ilaca maruz kalan enjekte edilmiş larvaların hayatta kalmasını 7 gün boyunca izleyin. NOT: İlaç sadece enfeksiyon gününde uygulanabilir ve tüm deney için larvalarda tutulabilir veya günlük olarak yenilenebilir.</li>
</ol>6. Zebra balığı Büyüme ve Görüntüleme için Yaralama ve Tuzak Cihazı (zWEDGI) kullanılarak enfekte larvaların günlük görüntülenmesi
<ol><li>Pigmentasyonu önlemek için larvaların 24 hpf'de 100 μM N-feniltilthiourea (PTU) ile tedavi edildiğinden ve PTU'nun tüm deney için larvalarda tutulduğundan emin olun. NOT: 75–100 μM'deki PTU, herhangi bir brüt gelişimsel kusur olmadan larvaların pigmentasyonunu önler24. Bununla birlikte, PTU bazı biyolojik süreçlere müdahale edebilir25ve araştırmacılar ilacın incelenecek herhangi bir süreci etkileyip etkileyemeyeceğine önceden karar vermelidir.</li>
	<li>Transgenik larvaları, bölüm 3'te açıklandığı gibi floresan bir proteini ifade etmek için tasarlanmış Aspergillus sporları ile 2 dpf'de etiketli hücre popülasyonlarıyla enfekte edin. Daha sonra, enfekte olmuş larvaları metilen mavisi olmadan yaklaşık 500 μL / kuyu E3'te 48 kuyu plakasının kuyularına aktarın. NOT: Burada 48 kuyu plakası kullanılır, çünkü tekrarlanan günlük görüntüleme sırasında larvaları içine ve dışına aktarmak daha kolaydır.</li>
	<li>Görüntüleme gününde, iki adet 3,5 mm Petri kabı hazırlayın: biri 100 μM PTU ve diğeri E3-trikaine ile.</li>
	<li>zWEDGI cihazının odalarına E3-tricaine ekleyin26,27. Stereo mikroskop altında, bir P100 mikropipette kullanarak odalardan ve kısıtlama kanalından hava kabarcıklarını çıkarın. Tüm fazla E3-trikaini çıkarın, böylece sadece odalarda.</li>
	<li>Bir transfer pipet kullanarak plakadan bir larva pipet. Çıkarmak için çok fazla sıvı kullanılırsa, E3-PTU içeren 3,5 mm'lik bir kabın içine pipet. Sonra, mümkün olduğunca az sıvı kullanarak tekrar pipet ve E3-tricaine aktarın.</li>
	<li>Anestezi için ~30 s bekleyin, ardından yaralama ve tuzak cihazının yükleme odasına aktarın (örneğin, zWEDGI).</li>
	<li>Stereo mikroskop altında larvayı konumlandırın. E3-trikaini yara odasından çıkarmak ve larva kuyruğunu kısıtlama kanalına taşımak için yükleme odasına bırakmak için P100 mikropipette kullanın. Larvaların yanal, dorsal veya dorso-lateral tarafına yerleştirildiğinden emin olun, böylece arka beyin ters objektif bir lensle görüntülenebilir.</li>
	<li>Konfokal mikroskop ile görüntü larva.</li>
	<li>Görüntülemeden sonra, P100 pipeti ile, larvaları kısıtlama kanalından yükleme odasına itmek için E3-trikaini yaralama odasına bırakın.</li>
	<li>Bir transfer pipet kullanarak larvayı alın ve E3-Tricaine ile Petri kabına geri aktarın. Mümkün olduğunca az sıvı kullanarak, E3-PTU ile Petri kabına aktarın. PTU'da durulayın ve 48 kuyu plakasına geri aktarın.</li>
</ol>

<ol><li>Latge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+and+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus and aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).</li>
<li>Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis.</a> Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).</li>
<li>Dagenais, T. R., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Aspergillus+fumigatus+in+Invasive+Aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).</li>
<li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+case-fatality+rate%3A+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).</li>
<li>Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+animal+models+of+aspergillosis+in+studying+immunity+against+Aspergillus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Mycologie+M%C3%A9dicale%22%5BJournal%5D)">Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections.</a> Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).</li>
<li>Behnsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+dimensionality+controls+the+interaction+of+phagocytes+with+the+pathogenic+fungi+Aspergillus+fumigatus+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 13(2007).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Infection%3A+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Host+for+Invasive+Fungal+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections.</a> Journal of Fungi. 4 (4), (2018).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).</li>
<li>Knox, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+phagocyte+responses+to+Aspergillus+fumigatus+conidia+and+hyphae+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae.</a> Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+inhibit+Aspergillus+fumigatus+germination+and+neutrophil-mediated+fungal+killing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing.</a> PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229(2018).</li>
<li>Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+establishes+infection+in+zebrafish+by+germination+of+phagocytized+conidia%2C+while+Aspergillus+niger+relies+on+extracellular+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12791(2019).</li>
<li>Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-glucan-dependent+shuttling+of+conidia+from+neutrophils+to+macrophages+occurs+during+fungal+infection+establishment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000113(2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis-dependent+activation+of+a+TLR9-BTK-calcineurin-NFAT+pathway+co-ordinates+innate+immunity+to+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+Orchestrates+Lateral+Transfer+of+Aspergillus+fumigatus+during+Macrophage+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenate+sensitivity+of+a+laeA+mutant+is+restored+by+overexpression+of+the+bZIP+protein+MetR+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus.</a> Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644(2019).</li>
<li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+voriconazole+against+A.+fumigatus+infection+depends+on+host+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+clinically+relevant+murine+model+of+solid-organ+transplant+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis.</a> Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).</li>
<li>Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+immune+cell+clearance+of+Aspergillus+fumigatus+spores+and+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae.</a> Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).</li>
<li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+the+Innate+Immune+Response+in+a+Zebrafish+Larval+Model+of+Streptococcus+iniae+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52788(2015).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Live+Imaging+Device+for+Improved+Experimental+Manipulation+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Antifungal+Drug+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Clinical+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Update on Antifungal Drug Resistance.</a> Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).</li>
</ol>

Açıklanınacak herhangi bir çatışma veya finansal çıkar yoktur.

Burada açıklanan enfeksiyon modeli konak immün yanıtları, konak-patojen etkileşimleri ve mantar patogenezini analiz etmek için faydalıdır12,13,14,15. Bu bilgiler, floresan etiketli patojenlerin ve konak hücrelerin13, larva sağkalımının ve zaman içinde CFU kalıcılığının yüksek çözünürlüklü görüntülemesinden elde edilebilir.
Mikroenjeksiyon tekniği bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir ve farklı mikroenjeksiyon ekipmanları ve kurulumları kullanırken ayarlanması gerekebilir. Özellikle, enjeksiyon basıncı ve zamanı iki ana değişkendir ve iğne tarafından çıkarılan hacmin ~3 nL olduğundan emin olmak için ayarlanabilir. İğneninpsle kırpılarak belirlenen boyutu, enjekte edilen spor sayısını da düzenler; ancak, daha büyük bir açıklık larva doku hasarına neden olabilir. Öte yandan, bir açıklığın çok küçük kısmı nispeten büyük sporların (>2 μm) dışarı çıkmasına izin vermez ve iğne tıkanmasına neden olabilir. Bu durumda, iğne biraz daha büyük bir açıklığa sahip olacak şekilde kapatılabilir.
Bakterilerin mikroenjeksiyonu için diğer protokoller homojen bir enjeksiyon karışımının korunmasına yardımcı olmak için PVP-40'ı kullanır, ancak bu taşıyıcıyı Aspergillus sporlarıyla kullanmakta herhangi bir avantaj bulamadık. İğnenin tıkanması, iğneyi yüklemeden önce herhangi bir kümeyi kırmak için mantar preparatının iyice girdaplanmasıyla hafifletilebilir. Bazen, iğnedeki bir tıkanıklık, basıncı veya enjeksiyon süresini geçici olarak artırarak ve iğne larvaları çevreleyen sıvıdayken mikroinjektörü tetikleyerek de yerinden çıkabilir. Basınç ve enjeksiyon süresi daha sonra tekrar önceki seviyelere indirilmelidir. Diğer durumlarda, bir tıkanıklık çıkarılamaz ve yeni bir iğnenin yüklenmesi ve yeniden kalibre edilmesi gerekir.
Bu protokol larva başına ~30-70 spor enjekte etmek için tasarlanmıştır. Spor hazırlığının konsantrasyonuna ve enjekte edilen hacme dayanarak, bu sayının oldukça düşük olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, ampirik olarak bu koşullar altında enjekte edilen spor sayısının bu olduğu bulunmuştur. Bu farkın neden oluştuğu bilinmemektedir, ancak iğnedeki spor topaklarından kaynaklanabilir. Daha fazla sayıda spor enjekte etme girişimlerimiz büyük ölçüde başarısız oldu.
Yaklaşık 30-70 spor enjekte edildiğinden emin olmak ve tüm larvalar boyunca enjeksiyonların tutarlılığını korumak için, larvaları çevreleyen E3'e enjekte ederek spor sayısını kontrol edin. Tüm enjeksiyonlar boyunca her beş ila altı larvada bir tekrarlayın. Spor sayısı değişiyor gibi görünüyorsa, basınç ve/ veya enjeksiyon süresi birden fazla larvaya tutarlı sayıda spor enjekte etmek için ayarlanabilir. Bununla birlikte, enjeksiyon dozun öncelikle arka beyinde kalmasına ve orta beyin ve ön beyinleri doldurmamasına dikkat edilmelidir.
Lokalize bir enfeksiyon sağlamak için, spor süspansiyonu arka beyin ventrikül içinde yer almalıdır. Bu, enjeksiyondan hemen sonra fenol kırmızısı lekeleme ile görselleştirilebilir, ancak kırmızı renk zamanla yayılır. Enjeksiyonlar için, otik veziklin etrafındaki bölge, ventrikülü 45 ° - 65 ° açıyla delmek ve ulaşmak için kullanılır. Bu bölgenin ana kan damarları yoktur, daha az doku hasarına neden olur ve anında iyileşir. Ventrikül üzerindeki deri delinirse, spor süspansiyonu dışarı sızabilir, çünkü Aspergillus spor enjeksiyonları için kullanılması gereken iğne bakteriyel süspansiyonlar için kullanılandan daha büyüktür. Başarısız bir şekilde enjekte edilen veya yanlışlıkla hasar gören larvalar, kırmızı bir işaret oluşturmak için yumurta sarısına birkaç kez enjekte edilerek veya larvayı iğneyle sıranın dışına sürükleyerek işaretlenebilir. Bir dizi enjeksiyon tamamlandıktan sonra, geri kalanı plakadan yıkanmadan önce bu larvalar çıkarılmalı ve atılmalıdır. Metilen mavisi olmayan E3, enjeksiyondan önce larvaları uyuşturmak ve ayrıca enjeksiyonlardan sonra larvaları tutmak için kullanılır, çünkü metilen mavisi mantar karşıtıdır.
Enjeksiyon anında, CFU sayıları enfekte konakçı içindeki uygulanabilir sporların sayısını temsil eder. Bununla birlikte, sporlar hyphae'ye çimlenirse, bunlar homojenizasyon sırasında ayrı uygulanabilir "mantar birimlerine" ayrılabilir ve birden fazla koloniye yol açabilir. Ya da kırılmamış çok hücreli bir hypha tek bir koloniye yol açabilir, bu da mantar yükünün ortalama, ancak kesin olmayan bir temsili ile sonuçlanır. Bu, CFU sayılarının, enjekte edilen sporların kaderinin görsel verilerini sağlayan bireysel larvaların boyuna mikroskopisi ile birleştirilmesiyle azaltılabilir.
Memeli sistemi ile karşılaştırıldığında, zebra balığı larva enfeksiyon modeli optik erişilebilirliği nedeniyle özellikle önemlidir. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve yanıtları canlı sağlam bir konakçı içinde görselleştirilebilir. Bu, her hedefin canlı bir hayvanda Aspergillus sporlarına karşı makrofaj veya nötrofil reaksiyonunu nasıl etkilediğini analiz etmek için moleküler hedeflerin genetik veya kimyasal inhibisyonu ile birlenebilir.
Zebrabalığı larvası Aspergillus enfeksiyon modeli IA 12 , 13 ,14, 15,16,17,18,19,20,22'ninfarklı yönlerini tanımlamada etkili olmaya devam ederken, başka genişleme alanları da vardır. Konakçı tarafından, hücresel düzeyde bağışıklık tepkilerini tanımlamak için kullanılır, ancak bu, hedeflenen morfoino, CRISPR, kararlı mutant çizgileri veya kimyasal maruziyet ile birleştirerek bağışıklık mekanizmalarını moleküler düzeyde analiz etmek için genişletilebilir. Bir uyarı, zebra balıklarında bilinen tüm memeli doğuştan gelen bağışıklık yolu bileşenleri için homologların tanımlanmış olmamasıdır.
Patojen tarafından, farklı türlerin ve suşların virülansı tanımlanmıştır. Gelecekteki araştırmaların umut verici bir yolu, belirli genlerin veya proteinlerin virülans faktörleri olarak nasıl katkıda bulunduğunu test etmek için mutant Aspergillus suşlarının kullanılmasıdır. Böylece, bu proteinleri hedeflemek için yeni mantar önleyici ilaçlar geliştirilebilir. Mevcut mantar önleyici ilaçlar insan hastalarda düşük etkililiğe sahiptir ve mantarlarda bu ilaçlara karşı artan direnç vardır28. Bu in vivo model, bu ilaçların neden başarısız olduğunu araştırmak ve yeni anti-mantar ilaçlarının etkinliğini test etmek için bir ara model olarak kullanılabilir. Genel olarak, bu model kullanılarak keşfedilen bulgular, Aspergillusenfekte hastalar için gelecekteki etkili tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.

Aspergillus fumigatus her yerde bulunan bir saprofitik mantardır ve havadaki sporları hem iç hem de dış mekanlarda bulunabilir1. Bu sporlar herkes tarafından solunur, ancak bağışıklık yetersiz bireylerin akciğerlerinden etkili bir şekilde temizlenir1,2. Bununla birlikte, kistik fibrozis gibi akciğer rahatsızlıkları değişmiş olan kişilerde akciğerlerde mantar çimlenmesine bağlı bronkopulmoner aspergillosis gelişebilir3. Bu enfeksiyonun en şiddetli formu olan invaziv aspergillosis (IA), bağışıklık sistemi baskılanmış bireyleri etkiler ve mantarın diğer organlara büyümesini içerir2,3. IA, mantar karşıtı tedavilerin mevcudiyetine rağmen enfekte hastaların%50'>ölümüne yol açar 4 . İmmün yetinsiz bireylerde doğuştan gelen immün yanıtlar solunan sporların temizlenmesinde önemli rol oynar1. Bununla birlikte, bu doğuştan gelen bağışıklık boşluğuna katkıda bulunan spesifik mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. IA için yeni terapötik stratejiler bulmak için Aspergillus'un temizlenmesinde ana doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin (yani makrofajların ve nötrofillerin) hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir.
Memeli modelleri mantar virülans faktörlerinin tanımlanmasında etkili olmuş ve immün yanıtları barındırırken5,6, hücresel düzeyde konak-patojen etkileşimleri için görsel erişilebilirlik sınırlıdır. Doku kültürü deneyleri, tüm hayvanlarda var olan karmaşık çok hücreli ortamı ve etkileşimleri tam olarak nüksedemez7. Bu nedenle, zebra balığı bu boşluğu doldurmak ve çok günlük bir enfeksiyon boyunca canlı, sağlam bir konakta konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini kolaylaştırmak için alternatif bir model organizma olarak popülerlik kazanmıştır8,9. Zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi 24 saat döllenme sonrası (hpf)10kadar erken gelişir ve adaptif sistemin 11 geliştirmesi4-6hafta sürer , doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının izolasyonda değerlendirilebileceği bir zaman aralığı sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkileri insanlar ve zebra balıkları arasında iyi korunmuş11. Zebra balıkları, optik netlik (sağlam konakçıların yüksek çözünürlüklü canlı görüntülenmesine izin verir) ve genetik çekiş (moleküler mekanistik çalışmaları kolaylaştıran) dahil olmak üzere bu yanıtların araştırılmasını kolaylaştıran birçok özelliğe sahiptir.
Burada açıklanan larva zebra balığı Aspergillus enfeksiyon modeli başlangıçta Knox ve ark.12. Son zamanlarda grubumuz ve diğerleri tarafından konak bağışıklık mekanizmaları12,13,konak-patojen etkileşimleri13 , 14,15, immünosupresyon mekanizmaları 13,16,17,mantar virülansı18ve mantar önleyici ilaç etkinliği19,20' yi araştırmak için genişletilmiştir. Bu model, insan aspergillosisinin birden fazla yönünü yeniden özetler. İmmün yetme larvalar dirençli olsa da, bağışıklık sistemi baskılanmış larvalar enfeksiyona yenik düşebilir12,13,16,17.
Bu modelde, fagositlerle daha az nüfuslu bir alan olan larvaların arka beyin ventriküllerine spor enjekte edilerek lokalize bir enfeksiyon kurulur ve fagosit işe alımı ve davranışıdeğerlendirilebilir 12,13. Makrofajların, insanlarda Aspergillus sporlarına karşı ilk savunma hattı olarak hareket ettiğine inanılmaktadır 1 vememeli modelleri6,21. Benzer şekilde, zebra balığı modelinde, enjekte edilen Aspergillus sporlarına makrofajlar işe toplanırken, nötrofiller hipnoz büyümesine yanıt olarak ikinci olarak işe alınmaktadır12,13,22. Bu modelden, Aspergillus'un 7 günden fazla enfeksiyondan sonra wildtype immün yetmsiz larvalarda devam edebileceği de öğrenilmiştir. Ayrıca, enfeksiyonun tüm seyri aynı canlı hayvanlarda günlük konfokal görüntüleme ile takip edilebilir.
Bu protokol, döllenme sonrası 2 günlük (2 dpf) larvaların arka beyin ventriküllerine spor enjekte etmek için mikroenjeksiyon tekniğini açıklar. Zebra balığı larvaları beslenmeden 10 dpf'ye kadar yaşayabildiği için enfeksiyon 7 güne kadar izlenir. İmmünsüpresyon ilaç tedavisi ile indüklenebilir ve ilaçların larvalara uygulanması da tarif edilir. Son olarak, bireysel larvalardan CFO'ların ölçülmesi ve günlük canlı görüntüleme kurulumu da dahil olmak üzere enfeksiyon ilerlemesini takip etmek için iki yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Dumont forseps # 5</td><td>Roboz Cerrahi Alet A.Ş.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Mercek retikül</td><td>Mikroskobu Dünya</td><td>RETR10</td><td>Stereomikroskop Mikroenjektör kurulumunda kullanılan iğneleri kalibre etmek için</td></tr><tr><td>: Geri basınç ünitesi</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Ayak Pedalı</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>FTSW</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pipet tutucu kiti</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>M-Pip</td><td></td></tr><tr><td>Basınç enjektörü</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör kurulumu: Mikromanipülatör</td><td>Narashige (Tritech)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand ve plaka</td><td>Tritech</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>İğne çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td></td></tr><tr><td>Tissuelyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Larvaları</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> homojenize etmek <tr><td>için<güçlü>Malzeme< / güçlü></td><td><güçlü>Şirket< ></td><td><güçlü>Katalog Numarası</td><td> Yorumlar / Açıklama</td></tr> <tr><td></td><td>Agarose Fisher</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Fisher</td><td>AAJ6380706</td><td></td></tr><tr><td>BSA, fraksiyon V</td><td>VWR</td><td>AAJ65855-22</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Fisher</td><td>AAJ1792406</td><td></td></tr><tr><td>L serpme makineleri</td><td>Fisher</td><td>14 665 230</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokılcal iğneler (filamentsiz)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>İğneyi Aspergillus süspansiyonu ile yüklemek için</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>Aspergillus süspansiyonunu filtrelemek için</td></tr><tr><td>N-feniltiüre</td><td>Fisher</td><td>AAL0669009</td><td>Pigmentasyonu önlemek için</td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı,% 1 çözelti</td><td>Fisher</td><td>57254</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (Etil 3-aminobenzoat, metansülfonik asit tuzu)</td> <td>Fisher</td><td>AC118000500</td><td>Larvaları uyuşturmak için</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Medya ve Çözümler</güçlü></td><td><güçlü>Bileşenler/Tarif</güçlü></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3 ortamı: 60x E3</td><td>17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl<alt>2</alt>, 4,9 g MgSO<alt>4</alt> ve orta nokta; 7H<alt>2</alt>O, H2O</td><td></td><td></td>ile 1 L'ye kadar</tr><tr><td>1x E3</td><td>16,7 ml 60x stok, 430 ul 0,05 M NaOH, H2O ile 1 L'ye kadar (isteğe bağlı: + 3 ml %0,01 metilen mavisi)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trikain stok çözeltisi</td><td>2 g Trikain, 5 g Na2HPO4 ve orta nokta; 7H2O, 4.2 ml 60X E3, H 2O ile 500 ml, NaOH</td><td></td><td></td>ile pH 7.0-7.5</tr><tr><td>Glikoz minimal ortamı (GMM) agar: GMM agar</td><td>10 g Glikoz (Dekstroz), 50 ml 20x Nitrat tuzları, 1 ml TE, H2O ile 1 L'ye, NaOH ile pH 6.5'e kadar, + 16 g Agar, otoklav</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Nitrat tuzları</td><td>120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 & middot; 7H 2 O, 30.4 g, KH2PO 4, H2O ile 1 L'ye kadar, otoklav</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İz elementler (TE)</td><td>2,20 g ZnSO4 & 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0.50 g MnCl < alt > 2 < / alt> ve orta nokta; 4H < alt > 2 < / alt >O, 0.16 g FeSO < alt > 4< / alt > ve orta nokta; 7H < alt > 2 < / alt >O, 0.16 g CoCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 6H<alt>2</alt>O, 0.16 g CuSO<alt>4</alt> ve orta nokta; 5H<alt>2</alt>O, 0.11 g (NH<alt>4</alt>)<alt>6</alt>Mo<alt>7</alt>O<alt>24</alt> ve orta nokta; 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, H2O ile 100 ml'ye kadar, gece boyunca karıştırarak çözün, otoklav</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

konakçı-patojen etkileşimlerinin analizi için zebra balığı larvalarının aspergillus sporları ile enfeksiyonu

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

İnvaziv aspergillosis (IA), bağışıklık sistemi baskılanmış bireyler arasında en sık görülen mantar enfeksiyonlarından biridir. Antifungal ilaçların mevcudiyetine rağmen, IA enfekte immün sistemi baskılanmış hastalarda% 50'> mortaliteye neden olabilir. Yeni terapötikler geliştirmek için enfekte hastalarda enfeksiyon duyarlılığına ve düşük sağkalım oranlarına katkıda bulunan hem konak hem de patojen faktörlerinin belirlenmesi çok önemlidir. Doğuştan gelen immün yanıtlar, Aspergillus sporlarının tanınmasında ve temizlenmesinde önemli bir rol oynar, ancak tam hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konakçı ve patojen arasındaki ayrıntılı mekanistik etkileşimleri araştırmak için güvenilir modeller gereklidir. Zebra balığı larvalarının optik netliği ve genetik çekiş kabiliyeti, onları canlı ve sağlam bir konakta birden fazla insan bakteriyel ve mantar enfeksiyonunun konak-patojen etkileşimlerini incelemek için ilgi çekici bir model haline getirir. Bu protokol larva zebra balığı Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. İlk olarak, Aspergillus sporları izole edilir ve mikroenjeksiyon yoluyla zebra balığı arka beyin ventrikül içine enjekte edilir. Daha sonra, immünsüpresif ilaçlar gibi kimyasal inhibitörler doğrudan larva suyuna eklenir. Enjekte edilen larvalarda enfeksiyonu izlemek için iki yöntem tanımlanmıştır, 1) koloni oluşturma ünitesi (CFU) numaralandırması için larvaların homojenizasyonu ve 2) tekrarlanan, günlük canlı görüntüleme kurulumu. Genel olarak, bu teknikler in vivo Aspergillus enfeksiyonunun ilerlemesini mekanistik olarak analiz etmek için kullanılabilir ve konak-patojen etkileşimlerini sorgulamak için farklı konak arka planlarına ve Aspergillus suşlarına uygulanabilir.

Aspergillus sporlarının zebra balığı larvalarının arka kısmına mikroenjeksiyondan sonra, enfeksiyon sonucu hayatta kalma, CFO'lar ve canlı görüntüleme dahil olmak üzere birden fazla test ile takip edilebilir. Bir sağkalım testinde, 1-7 dpi hayatta kalan enfekte larvaların sayısı izlendi. Wildtype larvaları tedavi edilmediğinde, çok az ölüm gözlendi ve larvaların ~% 80-100'ü deneyin tamamında hayatta kaldı (Şekil 1). Larvalar, kortikosteroid ilaç deksametazon (10 μM) maruz kalarak immünosuprese edilmişse, sağkalımda önemli ölçüde azalma gözlenmiştir(Şekil 1).
CFO'lar, A. fumigatus sporları ile enfekte olan wildtype larvalarından 7 günlük deney boyunca ölçtildiğinde, zaman içinde yavaş boşluk ile sporların kalıcılığı gözlenmiştir (Şekil 2A). 1, 2, 3, 5 ve 7 dpi'de hayatta kalan spor sayısı, çoğaltmalar arasında kalıcılık ve boşluğu karşılaştırmak için 0 dpi'de enjekte edilen spor sayısına normalleştirildi (Şekil 2B).
Lökositlerdeki floresan proteinleri floresan protein ifade eden Aspergillus sporları ile birlikte ifade eden transgenik balık hatları, hem lökosit işe alım ve davranışını hem de mantar çimlenmesini ve büyümesini görselleştirmek için kullanılabilir13. Makrofajlar etiketlendiğinde (örneğin, Tg (mpeg1:H2B-GFP) larvaların ~ % 50'sinde makrofaj kümelenmesi tipik olarak 2-3 dpi'den başlayarak gözlenmiştir (Şekil 3A). Nötrofil (Tg (lyz:BFP) işe alımı tipik olarak ertelendi, öncelikle mantar çimlenmesi meydana geldikten sonra meydana geldi (Şekil 3A). Larvaların çoğunda tüm deney için mantar yükü devam ederken (Şekil 3A), boşluk gözlenmiştir (Şekil 3B). Bazı larvalarda, makrofajlarda muhtemelen mantar yayılması nedeniyle, enfeksiyonun ilerleyen bölümlerinde arka beyin dışındaki mantar yükü de gözlenmiştir.
Otik veziklin etrafındaki alan, bu yayılmanın bulunabileceği olası bir yerdir (Şekil 3C). Bu gözlemler tüm deney boyunca birden fazla bireysel larvada ölçüldü (Şekil 4). Tipik olarak, çimlenme larvaların ~% 60'ında 5 dpi(Şekil 4A) ile görülmüştür. Fagosit küme alanı, makrofaj işe alımı ve nötrofil işe alımı hem zaman içinde hem de larvalar arasında değişir, bazıları deney boyunca eğilim gösterir ve bazıları zaman içinde çözülür (Şekil 4B,C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg"> Şekil 1: Enfekte larvaların temsili sağkalım analizi. Aspergillusenfekte larvalar araç kontrolüne (DMSO) veya deksametazon (Dex) maruz kaldı ve sağkalım izlendi. Veriler üç havuza kopyayı temsil eder. Ortalama enjeksiyon CFO'ları: DMSO = 30, Dex = 29 (p değeri ve tehlike oranı Cox oransal tehlike gerileme analizi, ****p &lt; 0.0001 ile hesaplanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg"> Şekil 2: Temsilci CFU, enjeksiyondan hemen sonra (0 dpi) ve enfeksiyon seyri sırasında (2, 3, 5 ve 7 dpi) bireysel enfekte larvalardan sayılır. Sekiz enfekte larva homojenize edildi ve her zaman noktası için CFU'ya saymak ve çoğaltmak için kaplandı. (A) Bir yinelemeden örnek veriler. Her nokta bir larvayı temsil eder, çubuklar her zaman noktası için araçları temsil eder. (B) CFU sayıları her çoğaltma için 0 dpi olarak CFU sayısına normalleştirildi ve üç çoğaltma birleştirildi. Veriler varyans analizi kullanılarak deneysel koşullar arasında karşılaştırılmış ve tahmini marjinal araçlar ve standart hatalar açısından özetlenmiştir. Asterix, 0 dpi'deki CFU ile karşılaştırıldığında istatistiksel önemi temsil eder (*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg"> Şekil 3: Enfeksiyon deneylerinden temsili görüntüler. Floresan makrofajlar (mpeg1:H2B-GFP) ve nötrofiller (lyz:BFP) ile PTU ile tedavi edilen larvalara RFP ekspresyörü A. fumigatusenjekte edildi. Canlı, enfekte larvalar konfokal mikroskopta 2, 3 ve 5 dpi'de tekrar tekrar görüntülendi. Maksimum yoğunluklu Z projeksiyon görüntüleri görüntülenir. Larva şemaları her panel için görüntülemenin yerini gösterir. Tüm ölçek çubukları, 25 μm olan içe ölçek çubukları hariç 100 μm'yi temsil eder. (A) Gösterilen görüntüler, tipik bir enfeksiyon ilerlemesini temsil eden 2, 3 ve 5 dpi'de çekilen tek bir larvadandır. İç kısımlar 3 ve 5. (B) Enfeksiyonu temizleyebilen larva alt kümesinin temsili görüntüsü, düşük mantar yükü ve 5 dpi'de çok fazla iltihaplanma. (C) Enfeksiyonun daha sonraki zaman noktalarında arka beyinden dışarı yaydığı larva alt kümesinin temsili görüntüsü. Bu görüntüde, mantar, makrofajlar ve nötrofiller otik vezikliğin etrafında ve altında bulunabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg"> Şekil 4: Görüntüleme deneylerinin temsili nicelemesi. Şekil 3'teki deneysel kurulumdan elde edilen görüntüler mantar çimlenmesi ve lökosit alımı için analiz edilmiştir. (A) Larvalar her gün çimlenmiş sporların varlığı için puanlandı ve çimlenme ile larvaların yüzdesi hesaplandı. (B,C,D) Her bir larva farklı bir renk çizgisi olarak temsil edilir. Her larva için 5 günlük deney boyunca fagosit kümesi görünümü ve boyutu (B), makrofaj işe alımı (C) ve nötrofil işe alımı (D) takip edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Bu protokol, bu mantara karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini araştırmak için kullanabileceğimiz bir larva zebra balığı aspergillus enfeksiyon modelini göstermektedir. Larva zebra balığı modelinin temel avantajı, çok günlük bir enfeksiyon boyunca canlı bir konakçı hayvan içindeki bağışıklık hücresi patojen etkileşimlerini ve enfeksiyon ilerlemesini görselleştirebilmemizdir. Bu modelden elde edilen bulgular, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda invaziv aspergillozu tedavi etmek için yeni terapötik hedeflerin keşfi için geçerli olabilir.Sporların larva zebra balığına mikro enjeksiyonu, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmeden önce önemli ölçüde pratik gerektiren zor bir tekniktir. Mikroenjeksiyonları gerçekleştirmek için, bir basınç enjektörü, vakum basınç ünitesi, ayak pedalı, mikropipet tutucu, mikro manipülatör ve manyetik bir stand ve plaka ile birlikte verilen kurulumu kullanın. Hepsi bir basınçlı hava kaynağına bağlı.Basınçlı hava valfini açın. Ve mikroenjektörü açın. Basıncı yaklaşık 25 psi'ye, desteği 60 milisaniyeye ve vakum basınç ünitesini 1 psi'ye ayarlayın.Mikroenjeksiyon iğnesine üç ila beş mikro litre PBS veya fenol kırmızısı ile spor süspansiyonu yüklemek için bir mikro yükleyici pipet ucu kullanın. Ardından iğneyi mikromanipülatöre monte edin. Aspergillus fumigatus, insanlarda fırsatçı bir patojendir.Yüklenen iğne ile cildin delinme riski vardır. İğne mikroenjektöre çok sıkı bir şekilde takılmalı ve araştırmacılar her zaman eldiven giymeli ve delinmeyi önlemek için iğne etrafındaki el hareketlerine çok dikkat etmelidir. Mikromanipülatörü, iğnenin ucu stereo mikroskop altında en düşük büyütmede görünecek şekilde konumlandırın.İğneyi görüş alanında tutarak 4x büyütmeye yakınlaştırın. Ardından iğnenin ucunu kesmek için keskin forseps kullanın. Damlacığın boyutunu görselleştirmek için enjeksiyon pedalına basın.Ve yaklaşık üç nanolitre spor süspansiyonu çıkana kadar iğneyi kırpmaya devam edin. Hazır olduğunuzda, larvaları enjeksiyon plakasına yerleştirirken yanlışlıkla iğneye çarpmamak için mikromanipülatörü ve iğneyi yoldan çekin. E3 tricaine'i enjeksiyon plakasından dökün.Ve yaklaşık 24 anestezi uygulanmış iki günlük larvaları mümkün olduğunca az E3 ile plakaya aktarın. Ardından, larvaları baktıkları yöne göre düzenleyin, tüm larvaları bir sıra halinde sağa bakacak şekilde ve aşağıda bir sıra halinde sola bakacak şekilde yerleştirin. Mikroskop en düşük büyütme oranına ayarlandığında, mikromanipülatörü geri getirin, böylece iğne larvalara 30-60 derecelik bir açıyla yakın olur.En yüksek büyütme oranına yakınlaştırın. İğnenin konumunu daha da ayarlamak için ince ayar düğmelerini kullanın. İğneden 30-70 sporun çıktığını doğrulamak için spor süspansiyonunu larvaların yanındaki sıvıya enjekte edin.Daha sonra plakayı, iğne doğrudan yukarıda olacak ve ilk larvaların yanına gelecek şekilde hareket ettirin. İğneye doğru bakan larvalardan başlayarak. İğneyi otik vezikülün etrafındaki dokudan geçirin ve larvaların doğru yönünü elde etmek için plakayı gerektiği gibi hareket ettirerek arka beyin ventrikülüne doğru delin.İğnenin ucunun arka beyin ventrikülünün merkezinde olduğunu görsel olarak doğrulayın. Ardından sporları enjekte etmek için ayak pedalına basın ve iğneyi nazikçe geri çekin. Tüm larvaları her iki sıraya da enjekte ettikten sonra, iğneyi tekrar yoldan çekin.Ve daha düşük bir büyütme oranına yakınlaştırın. Fenol kırmızı boya, her larvanın arka beyninde hala görünür olmalıdır. Başarısız enjeksiyonlarla larvaları atın ve kalan larvaları taze E3 ile plakadan yıkayarak bir petri kabına aktarın. Larvaları E3 ile iki kez durulayın ve anesteziden kurtulduklarından emin olun.Enjeksiyondan hemen sonra, larvaların sekizini ayrı ayrı 1.7 mililitrelik tüplere aktarın ve ötenazi yapın. Ampisilin ve kanamisin ile 1 mL PBS hazırlayın. Larvaların bulunduğu tüplerden mümkün olduğunca fazla sıvı alın.Sonra antibiyotikli 90 mikrolitre PBS ekleyin. Larvaları bir TissueLyser'da dakikada 1800 salınımla altı dakika boyunca homojenize edin. Ardından, 30 saniye boyunca 17.000 kez G'de döndürün.Homojenize süspansiyonu her tüpten etiketli bir GMM plakasının ortasına pipetleyin ve tek kullanımlık L şeklinde bir yayıcı kullanarak yayın. Janta yayılmamaya dikkat edin. Plakaları iki ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.Ardından, oluşan kolonilerin sayısını sayın. Kalan enjekte edilen larvaları iki adet 3,5 milimetrelik tabağa bölün. Biri ilaç tedavisi için, diğeri kontrol için.Mümkün olduğu kadar çok sıvıyı çıkarın ve araç kumandası ile E3'ü bir tabağa ekleyin. Ve E3 ile diğerinin ilgisini çekmek. Her larvayı 96 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya aktarmak için bir pipet kullanın.Ve yedi gün boyunca hayatta kalmalarını izleyin. Görüntüleme gününde, 100 mikromolar PTU ile bir adet 3,5 milimetre petri kabı ve E3 trikain ile bir tane hazırlayın. Bir Z-wedge E cihazının haznelerine E3 tricaine ekleyin ve haznelerdeki ve sınırlama kanalındaki hava kabarcıklarını çıkarmak için bir P100 mikropipet kullanın.Daha sonra odaların dışındaki tüm fazla E3 tricaine'i çıkarın. Bir larvayı pipetleyin ve E3 PTU ile tabağa aktarın. Daha sonra mümkün olduğunca az sıvı ile E3 tricaine'e aktarın.30 saniye sonra, anestezi uygulanmış larvaları yaralama ve tuzak cihazının yükleme odasına aktarın. E3 trikaini yaralama odasından çıkarın ve larvaların kuyruğunu kısıtlama kanalına hareket ettirmek için yükleme odasına bırakın. Arka beynin ters çevrilmiş bir objektif mercekle görüntülenebilmesi için larvanın yan, sırt veya dorsolateral tarafına yerleştirildiğinden emin olun.Larvaları konfokal bir mikroskopla görüntüledikten sonra, larvaları kısıtlama kanalından yükleme odasına itmek için E3 trikaini yara odasına bırakın. Larvaları toplayın ve E3 tricaine ile tabağa geri aktarın. Daha sonra mümkün olduğunca az sıvı ile E3 PTU ile tabağa aktarın.PTU'da durulayın ve tekrar 48 kuyulu plakaya aktarın. Aspergillus sporları, zebra balığı larvalarının arka beynine mikroenjekte edildi, bir enfeksiyon sonucu izlendi. Yabani tip larvalarda çok az ölüm gözlendi ve larvaların %80 ila 100'ü tüm deney boyunca hayatta kaldı.İmmün sistemi baskılanmış larvalarda sağkalımda önemli bir azalma gözlenmiştir. Enfekte yabani tip larvalardan koloni oluşturan birimler ölçüldüğünde, sporların kalıcılığı ve zaman içinde yavaş klerens gözlenmiştir. Enfeksiyondan bir, iki, üç, beş ve yedi gün sonra hayatta kalan sporların sayısı, kopyalar arasında kalıcılığı ve klerensi karşılaştırmak için enjekte edilen spor sayısına normalleştirildi.Makrofajlar etiketlendiğinde, larvaların yaklaşık% 50'sinde mikrofaj kümelenmesi tipik olarak enfeksiyondan iki ila üç gün sonra başlayarak gözlenmiştir. Nötrofil alımı, esas olarak bir mantar çimlenmesinden sonra meydana gelen gecikti. Larvaların çoğunda mantar yükü tüm deney boyunca devam ederken.Enfeksiyondan beş gün sonra bazılarında klerens gözlendi. Larvaların başka bir alt kümesinde, arka beyin dışındaki bölgelere mantar yayılımı gözlendi. Otik vezikülün etrafındaki alan, bu yayılımın bulunduğu bir yerdir.Mantar çimlenmesi tipik olarak larvaların %60'ında beş gün boyunca görülmüştür. Fagosit küme alanı, makrofaj alımı ve nötrofil alımı tüm larvalarda zamanla değişmiştir. Bazıları deney boyunca eğilim gösterirken, diğerleri zamanla çözülür.Bu prosedür, aspergillus'a karşı başarılı bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde spesifik konak yollarının gereksinimini belirlemek için CRISPR gibi zebra balıklarının genetik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu protokol, aspergillus'un doğuştan gelen bağışıklık hücresi etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak, canlı, sağlam konakçılarda görselleştirilmesine izin vermiştir.

infection-zebrafish-larvae-with-aspergillus-spores-for-analysis-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Kaynak: Zhang, X. ve diğerleri, Biyomateryalle ilişkili Staphylococcus aureus Enfeksiyonunun İn Vivo Görselleştirmesi ve İntravital Analizi için Bir Zebra Balığı Embriyo Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, implante edilmiş biyomateryallerle bağlantılı enfeksiyonları incelemek için bir zebra balığı embriyo modelini göstermektedir. Staphylococcus aureus'un polistiren mikrokürelerle enjekte edilmesi, implante edilen materyallerin enfeksiyonu teşvik edici rolünü doğrulayarak bakterilerin hayatta...

Zebra Balığı Embriyoları Kullanılarak İmplantla İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonların İn Vivo Analizi

Kaynak: Bernut, A. ve ark., Zebrafish embriyolarında Mycobacterium abscessus'un Patogenezi ve Kordonlanmasının Çözülmesi ve Görüntülemesi. J. Vis. Deneyim (2015).Bu video, enfekte bir zebrafish embriyosundan Mycobacterium abscessus'u izole etmek ve nicelik ölçmek için bir protokolü göstermektedir. Bu işlem, embriyo ötenazisi, doku lizizasyonu ve homojenizasyonu ile bakterilerin serbest bırakılmasını, ardından santrifüj ve yüzeyaktif bir tamponda yeniden süspansiyonu içerir. Son olarak,...

Zebrafish embriyolarından bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilişi enfeksiyon yükünü değerlendirmek için

Kaynak: Bernut, A. ve diğerleri. Zebrafish embriyolarında Mycobacterium abscessus'un patogenezi ve kordonunun çözülmesi ve görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, floresan makrofajları ifade eden ve floresan Mycobacterium absessus kaba suşuyla enfekte olan transgenik zebrafish embriyolarını kullanarak konak-patojen etkileşimlerini görselleştiren bir protokolü göstermektedir. Ekstrahücre kordonunun bağışıklık kaçışını nasıl mümkün kıldığını, bakterilerin hayatta kalmasını ve konak hücre...

Mycobacterium abscessus ile enfekte olan zebrafish embriyolarında konak-patojen etkileşimlerinin canlı görüntülemesi

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Bu video, zebra balığı larvalarında mantar enfeksiyonunu ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Mantar sporları larva arka beyin ventrikülüne mikroenjekte edilir ve larvalar enfeksiyon gelişimine izin vermek için kuluçkaya yatırılır. Enfekte larvalar belirli aralıklarla toplanır ve enfeksiyon ilerlemesi, koloni oluşturan birimlerin numaralandırılmasıyla değerlendirilir.

Zebra Balığı Larvalarında Mantar Enfeksiyonunu Ölçmek İçin Bir Teknik

Video, zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş mantar patojen enfeksiyonunu gözlemlemek için bir zebra balığı yaralama ve tuzak cihazı tekniğini göstermektedir. İlk enfeksiyon makrofajları çeker ve enfeksiyon devam ettikçe enjeksiyon bölgesinde nötrofil alımı ilerler.

Mantar Patojeni ile Enfekte Zebra Balığı Larvalarını Görselleştirmek için Bir zWEDGI Tekniği

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Bu da çalışmanın bir zebra balığı embriyo modeli içinde vivo görselleştirme ve enfeksiyonu floresans mikroskobu göre zaman içinde biomaterial ilgili intravital analizi için açıklar. Bu model içinde vivo biomaterial ilişkili enfeksiyonların çalışmak için fare modelleri gibi memeli hayvan modelleri tamamlayan gelecek vaat eden bir sistemdir.

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Öğrenin, Aspergillus enfeksiyonlarını araştırmak için zebra balığı larvalarına mikroenjeksiyon tekniğiyle spor enjekte etme yöntemini. Bu model, canlı konakçıda bağışıklık hücre-patojen etkileşimlerini gerçek zamanlı görselleştirerek invaziv aspergilloz tedavileri için yeni terapötik hedefler keşfetmeye yardımcı olur.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Daha fazla video keşfet