Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.

Bu protokol, bu mantara karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini araştırmak için kullanabileceğimiz bir larva zebra balığı aspergillus enfeksiyon modelini göstermektedir. Larva zebra balığı modelinin temel avantajı, çok günlük bir enfeksiyon boyunca canlı bir konakçı hayvan içindeki bağışıklık hücresi patojen etkileşimlerini ve enfeksiyon ilerlemesini görselleştirebilmemizdir. Bu modelden elde edilen bulgular, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda invaziv aspergillozu tedavi etmek için yeni terapötik hedeflerin keşfi için geçerli olabilir.

Sporların larva zebra balığına mikro enjeksiyonu, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmeden önce önemli ölçüde pratik gerektiren zor bir tekniktir. Mikroenjeksiyonları gerçekleştirmek için, bir basınç enjektörü, vakum basınç ünitesi, ayak pedalı, mikropipet tutucu, mikro manipülatör ve manyetik bir stand ve plaka ile birlikte verilen kurulumu kullanın. Hepsi bir basınçlı hava kaynağına bağlı.

Basınçlı hava valfini açın. Ve mikroenjektörü açın. Basıncı yaklaşık 25 psi'ye, desteği 60 milisaniyeye ve vakum basınç ünitesini 1 psi'ye ayarlayın.

Mikroenjeksiyon iğnesine üç ila beş mikro litre PBS veya fenol kırmızısı ile spor süspansiyonu yüklemek için bir mikro yükleyici pipet ucu kullanın. Ardından iğneyi mikromanipülatöre monte edin. Aspergillus fumigatus, insanlarda fırsatçı bir patojendir.

Yüklenen iğne ile cildin delinme riski vardır. İğne mikroenjektöre çok sıkı bir şekilde takılmalı ve araştırmacılar her zaman eldiven giymeli ve delinmeyi önlemek için iğne etrafındaki el hareketlerine çok dikkat etmelidir. Mikromanipülatörü, iğnenin ucu stereo mikroskop altında en düşük büyütmede görünecek şekilde konumlandırın.

İğneyi görüş alanında tutarak 4x büyütmeye yakınlaştırın. Ardından iğnenin ucunu kesmek için keskin forseps kullanın. Damlacığın boyutunu görselleştirmek için enjeksiyon pedalına basın.

Ve yaklaşık üç nanolitre spor süspansiyonu çıkana kadar iğneyi kırpmaya devam edin. Hazır olduğunuzda, larvaları enjeksiyon plakasına yerleştirirken yanlışlıkla iğneye çarpmamak için mikromanipülatörü ve iğneyi yoldan çekin. E3 tricaine'i enjeksiyon plakasından dökün.

Ve yaklaşık 24 anestezi uygulanmış iki günlük larvaları mümkün olduğunca az E3 ile plakaya aktarın. Ardından, larvaları baktıkları yöne göre düzenleyin, tüm larvaları bir sıra halinde sağa bakacak şekilde ve aşağıda bir sıra halinde sola bakacak şekilde yerleştirin. Mikroskop en düşük büyütme oranına ayarlandığında, mikromanipülatörü geri getirin, böylece iğne larvalara 30-60 derecelik bir açıyla yakın olur.

En yüksek büyütme oranına yakınlaştırın. İğnenin konumunu daha da ayarlamak için ince ayar düğmelerini kullanın. İğneden 30-70 sporun çıktığını doğrulamak için spor süspansiyonunu larvaların yanındaki sıvıya enjekte edin.

Daha sonra plakayı, iğne doğrudan yukarıda olacak ve ilk larvaların yanına gelecek şekilde hareket ettirin. İğneye doğru bakan larvalardan başlayarak. İğneyi otik vezikülün etrafındaki dokudan geçirin ve larvaların doğru yönünü elde etmek için plakayı gerektiği gibi hareket ettirerek arka beyin ventrikülüne

İğnenin ucunun arka beyin ventrikülünün merkezinde olduğunu görsel olarak doğrulayın. Ardından sporları enjekte etmek için ayak pedalına basın ve iğneyi nazikçe geri çekin. Tüm larvaları her iki sıraya da enjekte ettikten sonra, iğneyi tekrar yoldan çekin.

Ve daha düşük bir büyütme oranına yakınlaştırın. Fenol kırmızı boya, her larvanın arka beyninde hala görünür olmalıdır. Başarısız enjeksiyonlarla larvaları atın ve kalan larvaları taze E3 ile plakadan yıkayarak bir petri kabına aktarın. Larvaları E3 ile iki kez durulayın ve anesteziden kurtulduklarından emin olun.

Enjeksiyondan hemen sonra, larvaların sekizini ayrı ayrı 1.7 mililitrelik tüplere aktarın ve ötenazi yapın. Ampisilin ve kanamisin ile 1 mL PBS hazırlayın. Larvaların bulunduğu tüplerden mümkün olduğunca fazla sıvı alın.

Sonra antibiyotikli 90 mikrolitre PBS ekleyin. Larvaları bir TissueLyser'da dakikada 1800 salınımla altı dakika boyunca homojenize edin. Ardından, 30 saniye boyunca 17.000 kez G'de döndürün.

Homojenize süspansiyonu her tüpten etiketli bir GMM plakasının ortasına pipetleyin ve tek kullanımlık L şeklinde bir yayıcı kullanarak yayın. Janta yayılmamaya dikkat edin. Plakaları iki ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin.

Ardından, oluşan kolonilerin sayısını sayın. Kalan enjekte edilen larvaları iki adet 3,5 milimetrelik tabağa bölün. Biri ilaç tedavisi için, diğeri kontrol için.

Mümkün olduğu kadar çok sıvıyı çıkarın ve araç kumandası ile E3'ü bir tabağa ekleyin. Ve E3 ile diğerinin ilgisini çekmek. Her larvayı 96 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya aktarmak için bir pipet kullanın.

Ve yedi gün boyunca hayatta kalmalarını izleyin. Görüntüleme gününde, 100 mikromolar PTU ile bir adet 3,5 milimetre petri kabı ve E3 trikain ile bir tane hazırlayın. Bir Z-wedge E cihazının haznelerine E3 tricaine ekleyin ve haznelerdeki ve sınırlama kanalındaki hava kabarcıklarını çıkarmak için bir P100 mikropipet kullanın.

Daha sonra odaların dışındaki tüm fazla E3 tricaine'i çıkarın. Bir larvayı pipetleyin ve E3 PTU ile tabağa aktarın. Daha sonra mümkün olduğunca az sıvı ile E3 tricaine'e aktarın.

30 saniye sonra, anestezi uygulanmış larvaları yaralama ve tuzak cihazının yükleme odasına aktarın. E3 trikaini yaralama odasından çıkarın ve larvaların kuyruğunu kısıtlama kanalına hareket ettirmek için yükleme odasına bırakın. Arka beynin ters çevrilmiş bir objektif mercekle görüntülenebilmesi için larvanın yan, sırt veya dorsolateral tarafına yerleştirildiğinden emin olun.

Larvaları konfokal bir mikroskopla görüntüledikten sonra, larvaları kısıtlama kanalından yükleme odasına itmek için E3 trikaini yara odasına bırakın. Larvaları toplayın ve E3 tricaine ile tabağa geri aktarın. Daha sonra mümkün olduğunca az sıvı ile E3 PTU ile tabağa aktarın.

PTU'da durulayın ve tekrar 48 kuyulu plakaya aktarın. Aspergillus sporları, zebra balığı larvalarının arka beynine mikroenjekte edildi, bir enfeksiyon sonucu izlendi. Yabani tip larvalarda çok az ölüm gözlendi ve larvaların %80 ila 100'ü tüm deney boyunca hayatta kaldı.

İmmün sistemi baskılanmış larvalarda sağkalımda önemli bir azalma gözlenmiştir. Enfekte yabani tip larvalardan koloni oluşturan birimler ölçüldüğünde, sporların kalıcılığı ve zaman içinde yavaş klerens gözlenmiştir. Enfeksiyondan bir, iki, üç, beş ve yedi gün sonra hayatta kalan sporların sayısı, kopyalar arasında kalıcılığı ve klerensi karşılaştırmak için enjekte edilen spor sayısına normalleştirildi.

Makrofajlar etiketlendiğinde, larvaların yaklaşık% 50'sinde mikrofaj kümelenmesi tipik olarak enfeksiyondan iki ila üç gün sonra başlayarak gözlenmiştir. Nötrofil alımı, esas olarak bir mantar çimlenmesinden sonra meydana gelen gecikti. Larvaların çoğunda mantar yükü tüm deney boyunca devam ederken.

Enfeksiyondan beş gün sonra bazılarında klerens gözlendi. Larvaların başka bir alt kümesinde, arka beyin dışındaki bölgelere mantar yayılımı gözlendi. Otik vezikülün etrafındaki alan, bu yayılımın bulunduğu bir yerdir.

Mantar çimlenmesi tipik olarak larvaların %60'ında beş gün boyunca görülmüştür. Fagosit küme alanı, makrofaj alımı ve nötrofil alımı tüm larvalarda zamanla değişmiştir. Bazıları deney boyunca eğilim gösterirken, diğerleri zamanla çözülür.

Bu prosedür, aspergillus'a karşı başarılı bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde spesifik konak yollarının gereksinimini belirlemek için CRISPR gibi zebra balıklarının genetik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu protokol, aspergillus'un doğuştan gelen bağışıklık hücresi etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak, canlı, sağlam konakçılarda görselleştirilmesine izin vermiştir.