Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon
May 10th, 2020
Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (<50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.
Bu protokol, ulaşım saat sonra bile, insan ve hayvan kalplerinden örnekler ile çalışır. Miligram başına 200 kadar miyosit vibratom kesim doku dilimlerinden izole edilebilir. Kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik, yapısal ve biyokimyasal analizi, kalp hastalığının mekanizmalarının keşfedilmesine ve daha iyi anlaşılmasına yardımcı olur.
100 milimetrelik doku kültür çanasını 20 mililitre soğuk kesme solüsyonuyla doldurduktan sonra doku örneğini kültür kabına yerleştirin. Bir tabakta 4 santigrat dereceye soğutulmuş kültür çanak tutun. Hayvanlardan ve özellikle insanlardan alınan canlı doku örneklerinin potansiyel olarak bulaşıcı olduğunu unutmayın.
Makas veya neşter kullanın, aşırı fibrotik doku ve epikardiyal yağ kaldırmak için, örnekten. Büyük doku örneklerinin optimal vibratom işleme için, doku sekiz milimetre küpleri kesmek için neşter kullanın. Biyopsilerden alınan küçük numuneler için bu gerekli değildir.
Epikardiyumun epikardiyal yağ tabakası ile tanımlanabilir. Aşırı yağ çıkardıktan sonra, epikardiyum aşağı bakacak şekilde, çanak içine doku bloğu yerleştirin. Doku katıştırma için hazırlamak için, kesme çözeltisi on mililitre düşük erime noktası agarose 400 miligram kaynatın.
Sıcak çözünmüş agarose jel ile on mililitrelik şırınga doldurun. Şırıngayı kapatın ve agarose'un dengesini sağlamak için en az 15 dakika boyunca 37 derecelik bir su banyosuna koyun. Forceps kullanarak, epikardiyum aşağı bakacak şekilde, temiz bir 35 milimetrelik doku kültürü çanak içine trim örneği taşıyın.
Daha sonra, steril bir bez ile, numuneden fazla sıvı çıkarın. Numuneyi forceplerle tutarak harekete karşı sabitle. Ve agarose şırıngAyı üzerine boşaltın, numuneyi tamamen batırdığından emin olun.
Hemen buz üzerine çanak yerleştirilir ve agarose 10 dakika katılaşmak sağlar. Vibratomun bıçak tutucusuna kullanılmayan bir jilet takın. Mümkünse, bıçağın Z saptırMa sını ayarlayarak vibratome kalibre edin.
Vibratom numune sahibi neşter bir agarose doku bloğu çıkarmak için bir neşter kullanın. İstikrar sağlamak için, doku hala yeterince agarose batırılmış olduğundan emin olun. En az sekiz milimetrelik agarose marjları var.
Numune tutucuya ince bir siyanoakrilat tutkalı uygulayın. Ve yavaşça sahibi üzerine, agarose doku bloğu basın. Kesme çözeltisi ile bir vibratom banyosu oluşturun.
Daha sonra, kesme işlemi boyunca, 4 ila 6 santigrat derecelik bir sıcaklık korumak için, ezilmiş buz ile vibratom dış soğutma tankı doldurun. Agarose doku bloğunu içeren numune tutucuyu vibratom banyosuna yerleştirin. El yazmasında açıklanan vibratom ayarlarını kullanarak 300 mikrolitre kalınlığında dilimler oluşturun.
Bu nasıl kardiyomiyosit lifleri ventriküler duvarda hizalanır çünkü paralel epikardin bölümler oluşturmak için çok önemlidir. Aksi takdirde, çok fazla hasar olacak. Kardiyomiyositlerin ve doku dilimlerinin hizalanmasını kontrol etmek için standart bir ışık mikroskobu kullanın.
Dokuzarar önlemek için, doku kendisi yerine, agarose tutun. Bir kardiyomiyosit lifleri, düzgün hizalanmış olmalı ve miyositler, sözleşmeli olmamalıdır. Laboratuvar shaker bir ısı plakası yerleştirin ve 37 santigrat dereceye ısıtın.
65 RPM'de laboratuvar çalkalayıcısını başlatın. Proteinazı iki mililitre çözeltide çözün. Ve kollajenazı iki mililitre çözeltide çözün.
Ama proteinaz ve kollajenaz karışımı yok. Kollajenaz çözeltisine kalsiyum klorür ekleyin, son konsantrasyon için, beş mikromolar. Her iki çözeltiyi de 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Temiz bir 60 milimetrelik doku kültürü çanak bir doku dilimi aktarmak için forceps kullanın. Beş milimetre önceden soğutulmuş kesme solüsyonu ile. Buz veya soğuk bir plaka üzerinde çanak tutulması, dikkatle bir bıçak veya forceps kullanarak, dokudan agarose çıkarın.
Doku dilimlerinin ilk yıkama gerçekleştirmek için, ısı bıçak üzerinde temiz bir 35 milimetrelik doku kültür çanak yerleştirin. Ve iki milimetre önceden ısıtılmış çözelti yle doldurun. Hazırlanan çanağa bir veya iki doku dilimi aktarın.
Sonra yıkama adımları için, bir milimetrelik pipet kullanın. Dilimleri yıkadıktan sonra, çözeltiyi yemekten çıkarın ve proteinaz çözeltisinin iki mililitresini ekleyin. 65 RPM de çalkalayıcı ile, ısı bıçak üzerinde 12 dakika boyunca dilimleri kuluçka.
İki mililitre önceden ısıtılmış çözelti ile doku dilimlerini iki kez daha yıkayın. Sonra, çanak çözelti bir çıkarın ve kollajenaz çözeltisi iki mililitre ekleyin. 65 RPM'de sallayarak, ısı bıçağı üzerinde en az 30 dakika boyunca dilimleri kuluçkaya yatırın.
Kuluçka 15 dakika sonra, hafif bir mikroskop altında çanak inceleyerek, ücretsiz bireysel miyositler için kontrol edin. Tek tek miyositler görünene kadar her beş dakikada bir kontrol edin. Daha sonra, iki kez dilimleri yıkayarak alt sindirim, önceden ısıtılmış çözelti iki iki mililitre ile.
Ve iki mililitre çözelti iki ile çanak doldurun. Dikkatle ince forceps kullanarak, ayrı doku dilimi lifleri çekin. Kardiyomiyositlere zarar vermemek için dikkatli çalışmaya devam edin.
Ve pipet birkaç kez, tek bir kullanım ile pipet geçmiş. Daha sonra, çubuk şeklindeki kardiyomiyositlerin, yemeği inceleyerek, hafif bir mikroskop altında ayırdığını doğrulayın. 37 santigrat derece ısı plakası üzerinde çanak geri yerleştirin ve sallayarak çalkalayın.
10 milimolar ve 100 milimolar kalsiyum klorür stok çözeltisi ekleyerek, yavaş yavaş beş mikromolar 1.5 milimolar için doku süspansiyon kalsiyum konsantrasyonu artırmak. Kalsiyum artışı tamamlandığında, kalan sindirilmemiş doku parçalarını kaldırmak için forceps kullanın. İlk olarak, süspansiyon ajitasyon durdurun.
Daha sonra, 1000 mikrolitrelik pipet kullanarak, çözeltinin 1/3'ünün süspansiyonun üstünden yavaşça çıkarın. Kardiyomiyositlerin aspirasyonundan kaçının. Sonra hücrelere çözelti üç 700 mikrolitre ekleyin.
Ajitasyon 10 dakika sonra, bu yıkama adımları tekrarlayın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ve kardiyomiyositler oda sıcaklığında tortu izin, en az 10 dakika ve en fazla 30 dakika.
Supernatant'ı tamamen çıkarın. Ve modifiye tyrode çözeltisi veya istenen deneme arabelleği pelet resuspend. Hafif bir mikroskop kullanarak, hücre kalitesini doğrulayın.
Kardiyomiyositlerin %30-50'si çubuk şeklinde, membran blebs olmadan pürüzsüz olmalıdır. Ve göster, açık haç lar. İzolasyon verimliliğini doğrulamak için protokol fare miyokardiyumuna uygulandı.
Ve küçük doku parçalarından koroner perfüzyon ve izolasyon yoluyla izolasyon ile karşılaştırıldığında. Protokol kullanılırken çubuk şeklindeki hücrelerin daha düşük bir oranına uyulduğu, daha sonra perfüzyon ile izolasyon dan sonra gözlenmiştir. Ama toplam sayı hala yüksekti.
Buna karşılık, doku parçalarından izolasyon, daha az çubuk şeklinde hücreler verdi. Akış sitometrisi, sonuçları nicel olarak karşılaştırmak için kullanılmıştır. Kardiyomiyositlerin doku dilimlerinden izolasyonu, koroner perfüzyon ile elde edilen verime ulaşmaz.
Ama sağlar, doku parçalarından miyosit izolasyonu daha önemli ölçüde daha yüksek verim. Daha sonra protokol insan miyokardiyumuna uygulandı. Miyokardiyal dilimlerden izolasyon, Hyde numaraları ve çubuk şeklinde insan miyositleri büyük bir oranda verdi.
Ve sadece küçük bir oranda yuvarlak kardiyomiyosit. Miyokardiyal dilimlerden izolasyon, doku parçalarından izolasyona göre çarpıcı derecede daha yüksek sayıda çubuk şeklinde miyosit le sonuçlandı. Fotometrik nicelik miyokard dilimlerinden izolasyon dan sonra önemli ölçüde daha yüksek miyosit canlılığı doğruladı.
Açıklanan protokolle izole edilen insan hücreleri yapısal analize tabi tutulabilir. Alfa aktinin boyama, yoğun bir düzenli Z çizgi deseni ve ortalama sarcomere uzunluğu ortaya 1.92 mikrometre, kardiyomiyosit dinlenme. LTCC ve RyR boyama, açık küme hücre zarı ve T tübülleri yakınında birlikte lokalize olduğunu gösterdi.
İzole kardiyomiyositler uyarılabilir ve hücresel elektrofizyoloji veya uyarma daralma kaplin çalışmaları için kullanılabilir. Eylem potansiyel şekli ve süresi, aralığında diğerleri tarafından bildirilen oldu, ventriküler kardiyomiyositler için, başarısız insan kalplerinden. Khan ses hattı taraması ile kaydedilen kalsiyum geçici, stimülasyon dan sonra net bir upstroke gösterdi.
Ve, gürültü oranı için kabul edilebilir bir sinyal. Kasıltı ile kardiyomiyosit kısalması alt hücre sınırının sapması görülebilir. Bu protokol le elde edilen izolatör kardiyomiyosit sayısının yüksek olması nedeniyle hücre kültürü mümkündür.
Bu gen transferi için izin verebilir, farmakolojik test ve insan kardiyomiyosit doku mühendisliği. Önemli bir uygulama, insan hücrelerinde hayvan modellerinden bulguların doğrulanmasıdır. Kalp yetmezliği çok sınırlı tedavi seçenekleri ile bir klinik sendromdur.
Geliştirilmiş kardiyomiyosit izolasyon teknikleri tanı ve gelecekteki tedaviler için hücresel hedefleri belirlemek için yardımcı olacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, vibratom kesimiyle elde edilen miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyositlerin izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Kalsiyum toleranslı hücrelerin yüksek verimiyle sonuçlanır ve kalp hastalığı mekanizmaları üzerine araştırmaları kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyomiyosit izolasyonu
- Kardiyak fizyoloji
- Elektrofizyolojik analiz
Arka Plan
- Kardiyomiyosit izolasyonu, kalp fonksiyonunu incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Vibratom kesimi, doku dilimlemesi için hassas bir yöntem sunar.
- Kalsiyum toleranslı hücreler, doğru deneysel sonuçlar için esastır.
- Soğuk iskemi maruziyeti altındaki örnekler üzerinde araştırmalar yapılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kardiyomiyosit izolasyonu için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Kardiyak hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışı geliştirmek.
- Elektrofizyolojik ve biyokimyasal analizlerin kolaylaştırılması.
Kullanılan Yöntemler
- Soğuk kesme solüsyonunun hazırlanması.
- Doku dilimlemesi için vibratom kullanımı.
- Miyokard dilimlerinden miyositlerin izolasyonu.
- Araştırma amaçlı izole edilen hücrelerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Doku başına 200 miyositin izolasyonu mümkündür.
- Protokol, taşıma sonrası örnekler için uygulanabilir.
- İzole edilen hücrelerin yüksek canlılığı daha fazla analizi desteklemektedir.
- Yöntem, iskemik koşullardan kaynaklanan kardiyomiyositlerin çalışılmasına olanak tanır.
Sonuçlar
- Protokol, kardiyomiyosit izolasyonu için sağlam bir yöntem sunar.
- Kardiyak hastalıklar ve mekanizmaları üzerine araştırmaları destekler.
- Yüksek canlı hücre verimi, deneysel sonuçları artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in cardiac drug discovery by enabling reliable isolation of viable human ventricular cardiomyocytes from limited tissue samples, supporting translational validation of animal model findings. The method enhances predictive confidence in target validation by providing access to physiologically relevant human cells for mechanistic de-risking. It is particularly valuable for institutions without on-site cardiac surgery, expanding access to human tissue for preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in human cardiomyocytes, clarifying pathway relevance and reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Provides a reproducible source of rod-shaped, calcium-tolerant cardiomyocytes for functional assays.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing verification of animal model findings in human cells before lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers high-yield, viable cardiomyocytes suitable for electrophysiological, structural, and biochemical analysis.
- Operational Value: Standardizes cell preparation from myocardial slices, improving assay consistency and scalability.
- Strategic Value: Enables reliable compound screening in human cells, increasing predictive confidence for cardiac safety and efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular excitability and contractility, supporting disease-relevant modeling of cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Allows isolation from tissue stored up to 36 hours in cold cardioplegic solution, facilitating multi-site collaboration.
- Strategic Value: Bridges discovery and preclinical stages by providing translatable human cell data for go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through human cell-based assays and enabling lead identification via functional screening in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing access to viable human ventricular cardiomyocytes.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized isolation of rod-shaped myocytes with high viability and functional integrity.
- Analytics: Enables quantitative assessment via flow cytometry and functional readouts such as calcium transients and action potential duration.
- Translational Research: Connects animal model findings to human physiology through direct comparison in isolated cardiomyocytes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiomyocyte isolation across projects, reducing dependency on variable tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing species-specific translational gaps.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability of cardiomyocyte isolation from limited human tissue samples.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets using human cell data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on human cardiomyocyte responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome operation, and enzymatic digestion protocols.
- Depends on access to a vibratome, temperature-controlled incubation systems, and standard cell culture equipment.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure consistency in slice thickness, enzyme exposure, and calcium reintroduction.
- Requires adaptation considerations for varying tissue quality, including fibrotic or ischemic samples.
- Limited by the availability of human myocardial specimens, though mitigated by tolerance to cold ischemia up to 36 hours.
