Toksisite Testi için Havadaki Parçacıklara Gerçekçi, Tekrarlanan Soluma Maruziyeti için Hava Sıvısı Arayüzü Bronşiyal Epitel Modeli
13 Mayıs 2020
Tanımlanan, toksisite testi için parçacıklara gerçekçi, tekrarlanan inhalasyon maruziyeti için bir in vitro bronş modelinin hücre kültürü ve maruz kalma yöntemidir.
Bu protokol, insan bronşiyal epitel hücrelerinin hava yoluyla nasıl kültürleneceğini ve maruz bırakılacağını açıklar. Bu, akciğerin solunan parçacıklara maruz kalmasını incelemek için daha gerçekçi bir modeldir. Bu yöntemlerle hazırlanan akciğer hücreleri, akciğerdeki gerçek ortama benzeyecek şekilde hazırlanır. Hücreler mukus üretecek, sıkı bir bariyer oluşturacak ve birkaç hafta boyunca canlı kalacaktır. Bu yöntem, havadaki partiküllerin toksik etkilerini incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, solunum yollarının bulaşıcı hastalıklarını ve soluma yoluyla alınan ilaçları incelemek için de kullanılabilir. Bu protokolü ilk kez denerken, bir agile oluşturmanın uzman bilgisi gerektirdiğini unutmayın. Ayrıca ölçüm için özel ekipman gerektirir. Hücreleri önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamında veya CCM'de, 6 oyuklu ekler için mililitrede 500.000 hücre konsantrasyonuna seyrelterek başlayın. Ve 12 oyuklu ekler için mililitrede 250.000 hücre. Aseptik koşullar altında ekleri olan bir hücre kültürü plakası yerleştirin ve bazal yan tarafı önceden ısıtılmış CCM ile doldurun. Hücre süspansiyonunu karıştırdıktan sonra, hücre kültürü ekindeki zarın üzerine pipetleyin. Plakayı örtün ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücreleri yedi gün boyunca batık koşullar altında kültürleyin, böylece CCM'yi her iki ila üç günde bir değiştirerek birleşmelerine izin verin. Transepitelyal elektrik direncini ölçmek için, bir çubuk elektrot seti ile desteklenmiş yüklü bir epitelyal voltohmmetre kullanın. Elektrotları %70 etanol ile temizleyin. Daha uzun elektrodu, tabağın dibine değene kadar dış kültür ortamına yerleştirin. Ve ortamdaki daha kısa elektrot, zara dokunmadan. Hücresiz boş ek parçada ölçümleri toplamaya başlayın. Ölçüm stabilize olana kadar bekleyin ve direnci ohm cinsinden yazın. Bu ölçüm, herhangi bir hücre veya boş direnç olmadan ek membranın direncidir. Her kesici uç için ölçümü tekrarlayın ve gerçek direnci elde etmek için boş direnci çıkarın ve kesici ucun yüzey alanıyla çarpın. Ortamı eklerin apikal tarafından çıkarın ve kuyucuğun bazolateral tarafına önceden ısıtılmış CCM ekleyin. Ortam, zara alttan temas etmeli, ancak ek parçanın üstüne sızmamalıdır. Hücreleri inkübatördeki hava-sıvı arayüzünde, yedi gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Bazolateral ortamın her iki ila üç günde bir değiştirilmesi. Partikül maruziyetinden kısa bir süre önce,% 1 nanopartikül süspansiyonu hazırlayın. NP'leri %96 etanol ile önceden ıslatın. % 1 NPs'lik bir son konsantrasyona saf su ekleyin. Şişeyi buz üzerinde bir behere koyun. Süspansiyonu 16 dakika boyunca sonikleştirin, dispersiyonla şişeye bir karışım ekleyin, daha sonra şişeyi küçük bir tüp aracılığıyla peristaltik bir pompaya bağlayın ve akışı saatte 25 mililitreye ayarlayın. Maruz kalmadan bir gün önce, otomatik maruz kalma istasyonunu veya AES'i açın ve kabinin 37 °C sıcaklığa ulaşmasını bekleyin
Genel Bakış
Bu çalışma, toksisite testleri için havada asılı partiküllere tekrarlanan inhalasyon maruziyetini simüle eden in vitro bir bronşiyal model geliştirilmesine odaklanmaktadır. Kültürlenmiş insan bronşiyal epitel hücreleri, uzun süreli canlılık ve gerçekçi mukus üretimi sergileyerek modelin toksikolojik çalışmalar ve bulaşıcı hastalıklar üzerine araştırmalar için uygun olmasını sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Toksikoloji
- Solunum biyolojisi
- In vitro modeller
Arka Plan
- Gerçekçi akciğer maruziyet modellerine olan ihtiyaç
- Solunan partiküllerin incelenmesinin önemi
- İlaç iletimi ve bulaşıcı hastalık araştırmalarındaki uygulamalar
Kullanılan Yöntemler
- İnsan bronşiyal epitel hücreleri için hücre kültürü teknikleri
- Hava-sıvı ara yüzey kültürü koşulları
- Transepitelyal elektriksel direncin ölçümü
Temel Sonuçlar
- Hücreler sıkı bir bariyer oluşturur ve mukus üretir
- Kontrollü koşullar altında canlılık birkaç hafta boyunca korunur
- Yöntem, toksikolojik değerlendirmelerde kullanım için valide edilmiştir
Sonuçlar
- Geliştirilen model, solunan partiküllerle olan akciğer maruziyetini etkili bir şekilde taklit etmektedir
- Toksisite testleri ve solunum araştırmaları için önemli çıkarımlar sunmaktadır
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Gerçekçi in vitro bronşiyal epitel modelleri, öngörücü inhalasyon toksisite testleri ve solunum yoluyla ilaç iletim araştırmaları için kritik öneme sahiptir. Calu-3 hücreleri ile hava-sıvı arayüzü (ALI) sistemi, insan havayolu koşullarını yakından taklit eden tekrarlı, düşük dozlu maruziyet çalışmalarına olanak tanıyarak erken evre bileşik değerlendirmelerinde daha yüksek translasyonel güvenilirlik sağlar. Bu yaklaşım, solunum yolu biyofarmasötik süreçlerinde fizyolojik olarak ilgili ve tekrarlanabilir modellere duyulan ihtiyacı karşılamaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Solunan bileşiklerin hava yolu epitelyumu üzerindeki etkilerinin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlar.
- Sıkı bağlantıların ve mukus üretiminin uzun süreler boyunca korunmasını sağlayarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Solunum toksisitesi ve güvenlik değerlendirmelerinde öngörü güvenilirliğini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Epitel bariyer bütünlüğünün kantitatif ölçümü için valide edilmiş, tekrarlanabilir bir sistem sağlar.
- Tekrarlanan, düşük konsantrasyonlu partikül maruziyetleri için assay standardizasyonunu destekler.
- Sürekli akış koşulları altında havadan yayılan bileşiklerin etkilerinin güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel biyobelirteç çalışmaları için hastalıkla ilgili havayolu modelleriyle uyumludur.
- İn vitro keşiften preklinik inhalasyon toksikolojisi iş akışlarına kadar süreklilik sağlar.
- Gerçekçi maruziyet senaryolarını modelleyerek geç aşama kaybı riskini azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu ALI bronşiyal modeli, solunum terapötikleri ve inhalasyon toksikolojisi için keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Hava yolu bariyer fonksiyonu ve partikül toksisitesine ilişkin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir, kantitatif transepitelyal direnç ve canlılık verileri sağlar.
- Analitikler: Maruziyet konsantrasyonunun ve uygulanan dozun sürekli izlenmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: In vitro bulguları, hastalıkla ilgili son noktalar içeren preklinik inhalasyon çalışmalarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hava yolu partikül ve ilaç çalışmaları için uyarlanabilir, standartlaştırılmış bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Solunum sistemi toksisite testlerinde öngörü güvenini artırır ve mekanizmaya yönelik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanan maruziyet protokolleri için tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Solunum portföy geliştirme süreçlerinde devam/tamamla kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İnhale edilen bileşiklerin ve formülasyonların riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- ALI hücre kültürü ve epitelyal bariyer ölçümü konusunda uzmanlık gerektirir.
- Sürekli akışlı maruziyet ve direnç izleme için özel cihazlandırma gereklidir.
- Maruziyet protokolleri ve veri analizi için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Model sınırları dahilinde, çeşitli hava yolu partikül türlerine ve konsantrasyonlarına uyarlanabilir.
- Hücre canlılığının ve sıkı bağlantı (tight junction) bütünlüğünün uzun süreli kültür dönemleri boyunca korunmasına bağlıdır.
