Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Merhaba, ben Chris Glembotski. Phoenix'teki Arizona Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde tıp profesörüyüm. Ve ben yine burada, Phoenix'te bulunan Translasyonel Kardiyovasküler Merkezi'nin direktörüyüm.

Bugün size yeni tekniğimizi gösterecek olan iki kişiyi tanıtmak istiyorum, Dr.Erik Blackwood, kıdemli doktora sonrası araştırmacım ve eğitim fakültesi ve kıdemli araştırma görevlisi Bayan Alina Bilal. Mevcut kardiyak miyosit izolasyon protokolleri, kültürdeki hücrelerin miktarını ve canlılığını sınırlayarak, kardiyak fizyoloji ve patofizyoloji anlayışımızı ilerletmek için deneysel bir çıkmaz yaratmaktadır. Bu protokol sadece erişkin murin kardiyak hücre izolasyonu sürecini hızlandırmayı değil, aynı zamanda tek bir fare kalbinden aynı anda atriyal ve ventriküler kardiyak hücrelerin hücre verimini ve canlılığını artırmayı da amaçlamaktadır.

Bu tekniğin terapötik keşif için derin etkileri vardır ve atriyal fibrilasyon gibi hastalıkların hücre tipine özgü bir düzeyde daha iyi karakterize edilebileceği ve terapötik hedeflerin tanımlanmasına izin vereceği görülmektedir. Daha önce mikrocerrahi deneyimi olmayan kişilerin, tam izolasyon protokolünü denemeden önce yükselen aort eksplantasyonu ve kanülasyon adımlarını kapsamlı bir şekilde uygulamalarını öneririz. Anestezi uygulanmış 10 haftalık bir C57 siyah 6J farenin göğsünü orta karın bölgesinden çeneye hızlı bir şekilde açmak için orta hat cilt kesisi yapmak için makas kullanarak başlayın.

Peritona girin ve künt diseksiyon ile diyaframı temizleyin. Göğüs kafesini her iki tarafın yan tarafında göğüs duvarı boyunca kesilerle kesin ve kalp ile göğüs duvarı arasındaki lifli bağlantıları koparın. Göğüs kafesinin tamamen çıkarılmasından sonra, kalbin arka yüzünü açığa çıkaran apeksten kalbi nazikçe kaldırmak için küçük forseps ve makas kullanın.

Kalbi çıkarmak için, çıkan aort üzerindeki innominat arterden hemen daha aşağı diseksiyon yapın ve kalbi hemen buz gibi kalp perfüzyon ortamına yerleştirin. Çıkan aortu ortaya çıkarmak için kalan dokuyu hızla inceleyin ve fazla dokuyu çevreleyen alanı temizlemek için mikrodiseksiyon forseps ve makas kullanın. Temizlenmiş aortu bir perfüzyon kanülüne iki milimetre yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın ve kanülü 5-0 ipek sütür ile sabitleyin.

15 ila 17,5 dakika boyunca sindirim tamponuna geçmeden önce kanüllü kalbi dakikada üç mililitre akış hızında dört dakika boyunca kalp perfüzyon ortamı ile yıkayın. Perfüzyonun son dakikalarında, sekiz mililitre sindirim tamponu akışını toplayın ve kalbi kanülden 60 milimetrelik plastik bir kültür kabına aktarın, ardından fazla dokuyu çıkarın ve kalbi 2,5 mililitre sindirim tamponuna batırın. Atriyal hücre izolasyonu için, kulakçıkları kalpten uzağa doğru inceleyin ve kulakçıkları 750 mikrolitre sindirim tamponu içeren 30 milimetrelik plastik bir kültür kabına yerleştirin.

İnce uçlu cerrahi makas kullanarak, kas liflerini çalkalamadan veya ayırmadan dokuyu ince forseps ile daha fazla incelemeden önce kulakçıkları kıyın ve ayırın. Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 15 dakika boyunca nazikçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Her beş dakikada bir, bir Brightfield mikroskobunun 10X hedefi altında atriyal miyosit ayrışmasını gözlemleyin.

Doku daha fazla sindirildikçe, hücre süspansiyonunu steril iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan önce daha küçük gözenek boyutuna sahip steril bir transfer pipet ucu kullanarak dokuyu nazikçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. 30 milimetrelik plakayı 750 mikrolitre 37 santigrat derece miyosit durdurma tamponu ile durulayın ve tamponu hücre süspansiyonu ile birleştirin. Atriyal miyositlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yerçekimi ve hafif çalkalama ile çökelmesine izin verin.

Görünür bir pelet oluştuğunda, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve miyosit içermeyen süpernatanı, atriyal miyosit peletini bozmadan 15 mililitrelik bir polipropilen konik tüpe aktarın. Miyosit olmayan fraksiyonu santrifüjleyin ve miyosit olmayan peleti% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Saymadan sonra, miyosit olmayan hücreleri aşağı akış analizi için uygun deney yoğunluğuna yerleştirin, ardından izole edilmiş atriyal miyosit peletini laminin kaplı kültür plakalarına tohumlama için uygun deneysel konsantrasyonda yeniden süspanse edin.

Ventriküler hücre izolasyonu için, atriyal doku numunesi için gösterildiği gibi ventriküler kalp dokusunu kesin ve elde edilen hücre süspansiyonunu, 2.5 mililitre 37 santigrat derece miyosit durdurucu tampon içeren 15 mililitrelik polipropilen konik bir tüpe aktarın. Diseksiyon plakasını 2,5 mililitre 37 santigrat derece miyosit durdurma tamponu ile durulayın ve yıkamayı hücre süspansiyonu ile birleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanarak, dokuyu dört dakika boyunca nazikçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin.

Kuluçka işleminin sonunda, çubuk şeklindeki miyositlerin varlığını kontrol etmek için hücrelerin 10 mikrolitrelik bir alikotunu kullanın. Hücre süspansiyonunu steril bir 100 mikrolitrelik naylon filtreden 50 mililitrelik bir polipropilen konik tüpe geçirin ve steril naylon filtreden kalan hücreleri yıkamak için önceden toplanan sindirim tamponundan iki mililitre kullanın. Ventriküler miyositlerin, tüpün dibinde görünür bir pelet oluşana kadar hafif bir çalkalama ile altı dakika boyunca yerçekimi ile çökelmesine izin verin.

Steril bir pipet ucu kullanarak, ventriküler miyosit peletini bozmadan miyosit içermeyen süpernatanı 15 mililitrelik polipropilen konik bir tüpe aktarın ve miyosit olmayan fraksiyonu santrifüjleyin. Miyosit olmayan peleti, sayım için% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri aşağı akış analizleri için uygun konsantrasyonda plakalayın, daha sonra izole edilmiş ventriküler miyositleri iki mililitre miyosit durdurma tamponunda yeniden süspanse edin. Aşamalı bir paradigma kalsiyum yeniden girişi oluşturmak için, oda sıcaklığında dört dakikalık bir inkübasyon için iyice karıştırarak ventriküler miyosit hücre süspansiyonuna 50 mikrolitre 10 milimolar kalsiyum klorür ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, oda sıcaklığında dört dakikalık bir inkübasyon için karıştırarak hücrelere 50 mikrolitre 10 milimolar kalsiyum klorür ilave edin. Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre 10 milimolar kalsiyum klorür ile dört dakikalık bir inkübasyon ve 80 mikrolitre 10 milimolar kalsiyum klorür ile dört dakikalık bir inkübasyon ile tedavi edin. Son inkübasyondan sonra, kalsiyumla muamele edilmiş ventriküler miyositleri, planlanan aşağı akış analizlerine göre uygun bir hacimde ventriküler miyosit kaplama ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri laminin kaplı kültür plakaları üzerine tohumlayın.

Bir saat sonra, süpernatanı 25 mikromolar Blebbistatin ile takviye edilmiş ventriküler miyosit koruma ortamı ile değiştirin. Kardiyak kas troponin T, kardiyak miyositlerin bir belirtecidir ve hem atriyal hem de ventriküler kardiyak miyosit kültürlerinde sağlam bir şekilde eksprese edilir. Buna karşılık, atriyal natriüretik peptit ve miyozin hafif zincir iki, sırasıyla atriyal ve ventriküler kardiyak miyosit kültürlerinde sağlam ve spesifik olarak eksprese edilir.

Fibroblast belirteçleri sadece hem atriyal hem de ventriküler odacıklardan izole edilen miyosit olmayan kültürlerde eksprese edilir. Yetişkin fare atriyal ve yetişkin fare ventriküler miyositlerinin T-tübül markörü dihidropiridin ve ryanodin reseptörü için immün boyama, izolasyon ve uzun süreli kültür boyunca sağlam T-tübülleri gösterir. Sarkomerik çizgileme paterni, çubuk şeklindeki morfoloji ve TO-PRO-3 ile nükleer boyama ile birlikte izole edilmiş kardiyak miyositlerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için kullanılabilir.

Beklendiği gibi, ventriküler kardiyak miyositler büyüktür ve ortalama uzunluğu yaklaşık 150 mikrometredir, oysa atriyal kardiyak miyositler ortalama yaklaşık 75 mikrometredir. Ayrıca, immünoboyama analizi üzerine, atriyal kardiyak miyositler, endoplazmik retikulum ve salgı granüllerine lokalizasyonun karakteristiği olan bir boyama modelinde sağlam bir atriyal natriüretik peptit ekspresyonu sergiler. Atriyal miyositler bazal koşullarda atriyal natriüretik peptit salgılarken, sekretagoglara yanıt olarak sekresyon artar.

Ayrıca, atriyal kardiyak miyositler atriyal natriüretik peptit salgılar ve birlikte sekresyon, hormonun sadece bir kısmını öncü durumundan ürün peptidine kadar işler. En yaygın önlenebilir hatalar arasında kurban edilmeden önce hayvanın sakin tutulmaması, perfüzyon sistemindeki hava kabarcıklarının tahliye edilmemesi ve cerrahın kendisinin sakin kalmaması yer alır. Bu prosedürü takiben, elektrofizyolojik ve kalsiyum işleme parametrelerinin tahlili, immünositokimya, hipertrofik yanıt ve sinyalleme çalışmaları ve simüle edilmiş iskemi reperfüzyon çalışmaları dahil olmak üzere herhangi bir yaygın deneysel prosedür gerçekleştirilebilir.