Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

Bu protokol, birden fazla kolon kanseri hücre sferoidi tipinde Lactobacillus hücresiz süpernatantın antikanser etkisini araştırmayı kolaylaştırmak için optimize edilmiştir. Bu teknik, in vivo taklit koşulları altında LCFS'nin kolon kanseri sferoidleri üzerindeki anti-kanser etkilerini araştıran ilk yaklaşımdır. Milyonda 20 parça oksijen içeren 37 santigrat derece hidrojen anaerobik odasına otoklavla sterilize edilmiş bir MRS agar plakası yerleştirerek ve plakayı taze çözülmüş Lactobacillus bakteri suyu ile aşılayarak başlayın.

Tüpe l-sistein ile takviye edilmiş iki ila üç mililitre MRS suyu ekleyin ve tüpü bütil kauçuk tıpa ve tüp kapağı ile kapatın. Daha sonra, tek bir koloniyi toplamak için bir halka kullanın ve koloniyi 500 mikrolitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir kültür tüpüne yerleştirin. Koloniyi salin içinde homojen bir şekilde yeniden süspanse edin ve tüm bakteri süspansiyonunu bir mililitrelik şırıngaya yükleyin.

İğneyi kültür tüpü kapağının ortasına yerleştirin ve koloniyi ortama verin. Kültürü 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve dakikada 200 devirde çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İki gün sonra, kültürün OD620'sini bir spektrofotometrede ölçün.

OD620 ikiye eşit olduğunda, bakterileri santrifüjleme ile çökeltin ve bakteri peletini PBS ile yıkayın. İkinci santrifüjlemeden sonra, bakterileri antibiyotiksiz% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş dört mililitre RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin ve bakterileri dakikada 100 devirde dört saat boyunca çalkalama inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, bakterileri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve geri kazanılan süpernatanı eksi 80 santigrat derece saklama için 0,22 mikronluk süzgeçten steril olarak süzün.

Kolorektal kanser hücre hatlarını sferoid oluşumu için hazırlamak için, ilgilenilen hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 100 milimetrelik Petri kaplarında tek tabakalar halinde kültürleyin. Hücreler% 70 ila% 80'lik bir birleşmeye ulaştığında, hücreleri tabak başına bir mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırmadan önce kültürleri yıkama başına dört mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İki dakika sonra, ışık mikroskobu altında ayrışma olup olmadığını kontrol edin.

Hücreler ayrılmışsa, enzimatik reaksiyonu beş mililitre büyüme ortamı ile nötralize edin. Hücreleri, hücre kültürü başına 15 mililitrelik bir konik tüpte santrifüjleme yoluyla toplayın ve peletleri tüp başına üç mililitre büyüme ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin. Ardından, tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını sayın.

Sayma işleminden sonra, hücreleri taze ortamda mililitre konsantrasyonunda bir ila iki kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin ve hücrelere nihai% 0.6'lık bir konsantrasyona kadar metilselüloz ekleyin. Hücreleri steril bir rezervuara aktarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 200 mikrolitre hücreyi ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir mikroplakanın her bir oyuğuna dağıtın. Daha sonra, ışık mikroskobu ile sferoid oluşumunu kontrol etmeden önce plakayı 24 ila 36 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

LCFS tedavisi için, hazırlanan çözülmüş LCFS stok çözeltisini taze büyüme ortamında %25, 12.5 ve 6 konsantrasyonlara seri olarak seyreltin ve kaplanmış kolorektal kanser hücre hattı kültürlerinin her bir oyuğundan mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, her bir kanser hücresi setine üç kopya halinde 200 mikrolitre LCFS takviyeli büyüme ortamı ekleyin ve plakayı 24 ila 48 saat daha inkübatöre geri koyun. % 0.6'lık bir metilselüloz konsantrasyonu, test edilen kanser hücre hattı hücrelerini kompakt sferoidlere dönüştürür, bu da sferoidlerin bu protokol kullanılarak çeşitli kolorektal kanser türlerinden üretilebileceğini gösterir.

% 25 LCFS ile kültürlenen sferoidler, doza bağlı bir şekilde bozulmuş yüzeyler ve azalmış hücre canlılığı sergiler. Gerçekten de, LCFS ko-kültürlenmiş hücreler, canlı kontrol hücrelerine kıyasla daha yüksek seviyelerde propidyum iyodür ekspresyonu gösterir. LCFS'nin kanser hücresi apoptozu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ters transkriptaz PCR analizi, Western blotlama ve akış sitometrik annexin V/7-AAD analizi de yapılabilir.

Büyüme ortamını çıkarırken sferoidleri nazikçe tuttuğunuzdan emin olun, çünkü sferoidler kolayca kırılabilir ve bu da LCFS tedavisinin etkisini gözlemlemeyi imkansız hale getirir. Bu prosedürü takiben, LCFS'nin antikanser etkisini daha ayrıntılı olarak karakterize etmek için hücre canlılığı testleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR, Western blotlama ve FACS analizi yapılabilir.