Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi
13 Haziran 2020
Burada Lactobacillus hücresiz süpernatantın (LCFS) kanser önleyici etkilerini anlamak için yöntemler sunulmaktadır. Kolorektal kanser hücre hatları 3D kültürlerde LCFS ile tedavi edildiğinde hücre ölümlerini göstermektedir. Sferoid üretme süreci iskeleye bağlı olarak optimize edilebilir ve sunulan analiz yöntemleri ilgili sinyal yollarını değerlendirmek için yararlıdır.
Bu protokol, birden fazla kolon kanseri hücre sferoidi tipinde Lactobacillus hücresiz süpernatantın antikanser etkisini araştırmayı kolaylaştırmak için optimize edilmiştir. Bu teknik, in vivo taklit koşulları altında LCFS'nin kolon kanseri sferoidleri üzerindeki anti-kanser etkilerini araştıran ilk yaklaşımdır. Milyonda 20 parça oksijen içeren 37 santigrat derece hidrojen anaerobik odasına otoklavla sterilize edilmiş bir MRS agar plakası yerleştirerek ve plakayı taze çözülmüş Lactobacillus bakteri suyu ile aşılayarak başlayın.
Tüpe l-sistein ile takviye edilmiş iki ila üç mililitre MRS suyu ekleyin ve tüpü bütil kauçuk tıpa ve tüp kapağı ile kapatın. Daha sonra, tek bir koloniyi toplamak için bir halka kullanın ve koloniyi 500 mikrolitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir kültür tüpüne yerleştirin. Koloniyi salin içinde homojen bir şekilde yeniden süspanse edin ve tüm bakteri süspansiyonunu bir mililitrelik şırıngaya yükleyin.
İğneyi kültür tüpü kapağının ortasına yerleştirin ve koloniyi ortama verin. Kültürü 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve dakikada 200 devirde çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İki gün sonra, kültürün OD620'sini bir spektrofotometrede ölçün.
OD620 ikiye eşit olduğunda, bakterileri santrifüjleme ile çökeltin ve bakteri peletini PBS ile yıkayın. İkinci santrifüjlemeden sonra, bakterileri antibiyotiksiz% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş dört mililitre RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin ve bakterileri dakikada 100 devirde dört saat boyunca çalkalama inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, bakterileri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve geri kazanılan süpernatanı eksi 80 santigrat derece saklama için 0,22 mikronluk süzgeçten steril olarak süzün.
Kolorektal kanser hücre hatlarını sferoid oluşumu için hazırlamak için, ilgilenilen hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 100 milimetrelik Petri kaplarında tek tabakalar halinde kültürleyin. Hücreler% 70 ila% 80'lik bir birleşmeye ulaştığında, hücreleri tabak başına bir mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırmadan önce kültürleri yıkama başına dört mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İki dakika sonra, ışık mikroskobu altında ayrışma olup olmadığını kontrol edin.
Hücreler ayrılmışsa, enzimatik reaksiyonu beş mililitre büyüme ortamı ile nötralize edin. Hücreleri, hücre kültürü başına 15 mililitrelik bir konik tüpte santrifüjleme yoluyla toplayın ve peletleri tüp başına üç mililitre büyüme ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin. Ardından, tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını sayın.
Sayma işleminden sonra, hücreleri taze ortamda mililitre konsantrasyonunda bir ila iki kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin ve hücrelere nihai% 0.6'lık bir konsantrasyona kadar metilselüloz ekleyin. Hücreleri steril bir rezervuara aktarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 200 mikrolitre hücreyi ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir mikroplakanın her bir oyuğuna dağıtın. Daha sonra, ışık mikroskobu ile sferoid oluşumunu kontrol etmeden önce plakayı 24 ila 36 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
LCFS tedavisi için, hazırlanan çözülmüş LCFS stok çözeltisini taze büyüme ortamında %25, 12.5 ve 6 konsantrasyonlara seri olarak seyreltin ve kaplanmış kolorektal kanser hücre hattı kültürlerinin her bir oyuğundan mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, her bir kanser hücresi setine üç kopya halinde 200 mikrolitre LCFS takviyeli büyüme ortamı ekleyin ve plakayı 24 ila 48 saat daha inkübatöre geri koyun. % 0.6'lık bir metilselüloz konsantrasyonu, test edilen kanser hücre hattı hücrelerini kompakt sferoidlere dönüştürür, bu da sferoidlerin bu protokol kullanılarak çeşitli kolorektal kanser türlerinden üretilebileceğini gösterir.
% 25 LCFS ile kültürlenen sferoidler, doza bağlı bir şekilde bozulmuş yüzeyler ve azalmış hücre canlılığı sergiler. Gerçekten de, LCFS ko-kültürlenmiş hücreler, canlı kontrol hücrelerine kıyasla daha yüksek seviyelerde propidyum iyodür ekspresyonu gösterir. LCFS'nin kanser hücresi apoptozu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ters transkriptaz PCR analizi, Western blotlama ve akış sitometrik annexin V/7-AAD analizi de yapılabilir.
Büyüme ortamını çıkarırken sferoidleri nazikçe tuttuğunuzdan emin olun, çünkü sferoidler kolayca kırılabilir ve bu da LCFS tedavisinin etkisini gözlemlemeyi imkansız hale getirir. Bu prosedürü takiben, LCFS'nin antikanser etkisini daha ayrıntılı olarak karakterize etmek için hücre canlılığı testleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR, Western blotlama ve FACS analizi yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Lactobacillus hücreden arındırılmış süpernatantın (LCFS) kolon kanseri sferoidleri üzerindeki antitümör etkilerini incelemek için bir protokol sunmaktadır. Çalışma, sferoid oluşumunu optimize etmekte ve hücre ölümüyle ilişkili sinyal yolaklarını değerlendirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kanser Araştırmaları
Arka Plan
- Lactobacillus, potansiyel sağlık faydalarıyla bilinir.
- Hücresiz süpernatantlar biyoaktif bileşikler içerebilir.
- Kolorektal kanser, önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir.
- 3D hücre kültürleri, in vivo koşulları daha iyi taklit eder.
Çalışmanın Amacı
- LCFS'nin kolon kanseri sferoidleri üzerindeki antikanser etkilerini araştırmak.
- Sferoid oluşturma tekniklerini optimize etmek.
- Gözlemlenen etkilerde rol oynayan sinyal yollarını analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Anaerobik oda içerisinde MRS agar plaklarının hazırlanması.
- Plakların Lactobacillus bakteri stokları ile ekilmesi.
- Bakterilerin l-sistein ile takviye edilmiş MRS besiyerinde kültüre edilmesi.
- İşlem için bakteri kolonilerinin toplanması ve yeniden süspansiyona getirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Kolorektal kanser hücre hatları, LCFS ile tedavi edildiklerinde hücre ölümü sergilemiştir.
- Optimize edilmiş sferoid oluşturma yöntemleri, deneysel sonuçları iyileştirmiştir.
- Hücre ölümünde rol oynayan sinyal yolakları etkili bir şekilde analiz edilmiştir.
- Bu çalışma, kanser tedavisi araştırmalarına yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
Sonuçlar
- LCFS, potansiyel bir anti-kanser ajan olarak gelecek vaat etmektedir.
- Doğru modelleme için 3D kültür teknikleri gereklidir.
- Sürece dahil olan mekanizmaları tam olarak anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin, fizyolojik olarak ilgili 3D kolorektal kanser modellerinde probiyotik kaynaklı süpernatantların anti-kanser aktivitesini değerlendirmesine olanak tanır. Stabil sferoid kültürlerinde Lactobacillus fermentum hücreden arındırılmış süpernatantı (LCFS) kullanan bu yöntem, doğal ürün adaylarının mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler ve hedef doğrulama çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır. Bu yaklaşım, kanser hücresi canlılığını etkileyen bağırsak mikroçevre etkileşimlerini modelleyerek, keşif aşamasındaki taramalar ile translasyonel uygunluk arasında bir köprü kurar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Mikrobiyal metabolitlere ve bunların kolorektal kanser hücre ölümü yolları üzerindeki etkilerine ilişkin terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: 3D sferoid modellerde doz bağımlı canlılık okumaları yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: LCFS kaynaklı apoptozu qRT-PCR, Western blot ve FACS aracılığıyla ölçülebilir moleküler belirteçlerle ilişkilendirerek portföy elemelerini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Ultra düşük yapışmalı plaklarda tekrarlanabilir sferoid oluşumu kullanarak, sonraki bileşik taramaları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Kantitatif Çıktılar: IC50 tahmini ve yapı-aktivite ilişkisi modellemesine olanak tanıyan doz-yanıt verileri (25%, 12.5%, 6% LCFS) üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Otomatik sıvı aktarımı ve yüksek kapasiteli canlılık taraması ile uyumlu 96 kuyucuklu format kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: In vivo tümör mimarisini yansıtan hasta türevli veya yerleşik hücre hattı sferoidlerini kullanarak kolorektal kanser patofizyolojisini modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Analiz aşamaları boyunca tutarlı 3D kültür koşullarını koruyarak, keşif bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riske Göre Ayarlanmış Kararlar: Sferoid ko-kültürlerinde gözlemlenen apoptoz indüksiyonu ve canlılık eşiklerine dayalı olarak git/gitme (go/no-go) kriterlerini kolaylaştırır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef tanımlamasının ardından ve ön madde optimizasyonundan önce erken keşif iş akışlarına entegre edilerek, mikrobiyal kaynaklı biyoaktif süpernatantların değerlendirilmesi için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Keşif Biyolojisi: in vivo yanıtları daha iyi tahmin eden 3D modellerde, mikrobiyal anti-kanser mekanizmalarının hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış sferoid oluşumu ve LCFS tedavi protokolleri aracılığıyla assay standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitik: Farklı tedavi koşulları ve hücre hatları arasında istatistiksel karşılaştırmayı destekleyen kantitatif bağımlı değişken ölçümlerine (viyabilite, apoptoz markırları) olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: 3D kültür sadakatini koruyarak, sferoid tabanlı taramadan preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çoklu kanser türleri genelinde probiyotik süpernatantların, fermente gıda ekstraktlarının veya mikrobiyom kaynaklı terapötiklerin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: 2D modellerden gelen yanlış pozitifleri azaltarak ve mikroortam bağımlı etkileri yakalayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Sferoit üretimi ve tedavi iş akışlarını standartlaştırarak, farklı merkezler arasındaki tekrarlanabilirliği artırır ve analiz değişkenliğini azaltır.
- Stratejik Değer: Maliyetli in vivo çalışmalar öncesinde mikrobiyom hedefli müdahalelerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Klinik olarak ilgili modellerdeki apoptoz indüksiyonu ve doz-yanıt değerlerine dayanarak, doğal ürün öncü maddelerinin riskten arındırılmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Anaerobik bakteri kültürü, 3D sferoid yönetimi ve apoptoz analiz teknikleri (qPCR, WB, FACS) konusunda uzmanlık gerektirir.
- Anaerobik odalar, çalkalamalı inkübatörler, spektrofotometreler ve akış sitometreleri dahil olmak üzere cihaz donanımına bağlıdır.
- Tutarlı LCFS hazırlama ve sferoid kalite kontrolü için mikrobiyoloji ve kanser biyolojisi ekipleri arasında ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Kolorektal modeller dışındaki diğer bakteri suşlarına veya kanser türlerine genişletilirken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Besiyeri değişimi sırasında sferoidlerin kırılganlığı ile sınırlıdır; doğru okumalar için yapısal bütünlüğü korumak adına nazik işlem gerektirir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
