Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu
July 23rd, 2020
Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.
Bu protokol, uçucu anesteziklerin bazı sinopsisleri diğerlerinden daha fazla bozup bozmadığını araştırmak, etkilerinin hücre tipi mi yoksa yola spesifik mi olduğunu belirlemek ve popülasyon düzeyinde hangi etkilerin meydana geldiğini belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uçucu anesteziklerin etkilerini değerlendirebildiğimiz özgüllüktür. Eşzamanlı olarak popülasyon aktivitesini test etmek için belirli yolları ve hücre tiplerini hedefleyebiliriz.
Doku bloğunu kesit için hazırlayarak başlayın. Beyni kafatası boşluğundan nazikçe kaldırın ve filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Beynin sagital düzlemi boyunca orta hatta paralel bir kesi yapın ve doku bloğunu bu sagital düzleme yerleştirin.
Filtre kağıdını engelleme şablonunun üzerine yönlendirin ve beyni alttaki şablon taslağıyla hizalayın. Şablon üzerindeki çizgilerle gösterildiği gibi koronal düzlemde paralel bir kesim yapın ve gerekirse filtre kağıdını ıslak tutmak için küçük bir damla dilimleme aCSF ekleyin. Doku bloğunu dört santigrat derece dilimleme aCSF'ye yerleştirin ve buz gibi soğuk numune aşamasına az miktarda yapıştırıcı uygulayın.
Doku bloğunu dilimleme aCSF'sinden kaldırın ve emici bir havlunun bir köşesi ile fazla solüsyonu fitilleyin. Doku bloğunun posterior koronal düzlemini, beynin dorsal yüzeyi safir bıçağa bakacak şekilde numune aşamasına yapıştırın. 500 mikrometre kalınlığında koronal beyin dilimleri toplayın ve bunları 34 santigrat derecede naylon bir ağ üzerine yerleştirin ve aCSF'yi dilimleyin.
Kabın oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Çözünmüş izofluran içeren deneysel aCSF torbaları hazırlamak için, boş bir politetrafloroetilen gaz torbasına 600 mililitre deneysel aCSF ve 600 mililitre %95 oksijen ve %5 karbondioksit gazı karışımı ekleyin. Bu çanta kontrolünü etiketleyin.
Başka bir politetrafloroetilen gaz torbasına 300 mililitre deneysel aCSF ekleyin ve bu torbayı izofluran olarak etiketleyin. İzofluran torbasını el yazması talimatlarına göre hazırlamaya devam edin. Her profile rastgele dalga formları atayarak ışık simülasyon protokollerini yapılandırın.
Atanmış dalga formuna sahip her profil, bir dijital TTL girişinden veya bir denemeden gelen bir tetikleme darbesine karşılık gelir. İşiniz bittiğinde profil sırasını kaydedin. Çok kanallı probu ex vivo beyin dokusu lamına yerleştirmek için, dakikada üç ila altı mililitre kabarcıklı deneysel aCSF'yi perfüze edin ve ilgilenilen alanı içeren beyin dilimini mikroskop perfüzyon odasındaki ağ ızgarasına aktarın.
Beyin dilimini platin bir arp ile sabitleyin. Ağ ızgarasını, çok kanallı probun distal ucundaki elektrot temas hattı, soyma yüzeyine yaklaşık olarak dik olacak şekilde döndürün. Geniş alan aydınlatması ve mikromanipülatörün hassas kontrolü altında, çok kanallı probu dilimin yüzeyine doğru indirin.
Kortikal afferentlerin akson terminallerinde eksprese edilen floresan raportör proteinin görselleştirilmesi için uygun filtre küpünü devreye sokun. Gerekirse, probu soyma yüzeyiyle daha hassas bir şekilde hizalamak için dilimi döndürün. Probu, x ekseni boyunca nihai hedef konumdan 200 mikrometre kısa dilim düzleminin hemen üzerine yerleştirin ve kaydedilen doku alanının dışında en az bir kanal bırakın.
Probu, uzunlamasına ekseni boyunca dilime yavaşça yerleştirin. Dokuya verilen hasarı en aza indirmek için, probu yalnızca keskin uçlar doku yüzeyinin hemen altında görülebilecek kadar ilerletin. Deneysel aCSF kaynağını torbalı kontrol çözeltisine geçirin ve hedeflenen yama kelepçesi kaydı için floresan etiketli hücreyi tanımlayın.
Diyaframı en küçük çapla sınırlayın ve çok kanallı prob ile objektif lens arasındaki teması önlemek için yüksek güçlü suya daldırma objektifini devreye sokun. Dokuyu odak noktasına getirin. Işığı, çok kanallı proba bitişik ancak onunla örtüşmeyen bir doku alanı üzerinde ortalayın.
Cre'ye bağlı floresan işaretleyiciyi ifade eden hücrelerin görüntülenmesine izin vermek için uygun filtre setini kullanın. Bir yama pipetini indirmek için geniş alan yaratmak için objektif lensi kaldırın. Dahili solüsyon içeren bir yama pipeti yükleyin ve elektrot tutucusuna monte edin.
Yaklaşık 0,1 mililitre havaya karşılık gelen pozitif basınç uygulamak için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Yama pipetini solüsyonun içine indirin, ucu görsel rehberlik altında odak noktasına getirin ve hedeflenen hücreden tüm hücre kaydını alın. Bu protokolde kullanılan hayvanlar, somatostatin veya parvalbümin pozitif internöronlarda floresan raportör protein tdTomato eksprese etti.
Bu internöronlar, uygun filtre küpü devreye girerken görsel rehberlik altında yama klemplemesi için hedeflendi. Postsinaptik potansiyeller, dört iki milisaniyelik ışık darbesi dizisine yanıt olarak internöronlarda gözlendi. Yerel saha potansiyelleri de kaydedildi.
Mevcut kaynak yoğunluğu ve çok birimli aktivite, yerel saha potansiyellerinden çıkarıldı. Akım kaynak yoğunluğundan çıkarılan akım lavabolarının genliği, ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak artmıştır. Üç parametreli doğrusal olmayan bir lojistik denklem, yollar arasında karşılaştırmalar için verilere uygun hale getirildi.
postsinaptik potansiyel genliği de akım sink genliği ile artmıştır. Kontrol, izofluran ve iyileşme koşulları sırasında talamokortikal ve kortiko-kortikal girdilere sinaptik yanıtlar ölçüldü. Somatostatin ve kortiko-kortikal uyaranların post sinaptik yanıtları ve uyarılmış akım lavaboları izofluran koşullarında baskılandı.
Beyin dilimlerini hazırlarken, dokunun sağlığını korumak çok önemlidir. Dilimleme prosedürü boyunca dokuyu serin tutmak, dokuya zarar vermeden hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Çok kanallı hücre dışı kayıtlar çeşitli şekillerde sonradan işlenebilir.
Örneğin, geniş bant sinyalinin yüksek geçişli filtrelemesi, popülasyon ani yükselme aktivitesini izole ederken, mevcut kaynak yoğunluğu hesaplamaları sinaptik aktiviteyi vurgular. Birlikte, bu teknikler, kortikal devrelerin belirli izole bileşenleri üzerindeki anestezik etkileri keşfetmemize izin vererek, in vivo bilinç kaybının altında yatan mekanizmalar hakkında fikir verdi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, izofluran gibi uçucu anesteziklerin aferent girdilere karşı nöronal tepkiler üzerindeki etkilerini araştırmak için ex vivo beyin dilimlerini kullanmaktadır. Araştırmacılar, optik genetik kullanarak, primer olmayan neokortekste talamik ve kortikokortikal aferentleri bağımsız olarak aktive ederek, anestetik maruziyetin sinaptik ve ağ tepkilerini nasıl modüle ettiğini araştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Sinaptik plastisite
Arka Plan
- Uçucu anesteziklerin nöronal devreleri nasıl etkilediğini anlamak kritiktir.
- Ex vivo beyin dilimleri, bu tür çalışmalar için kontrollü bir ortam sağlar.
- Optik genetik, nöronal yolakların spesifik aktivasyonunu sağlar.
- Anestetiklerin sinaptik tepkiler üzerindeki etkileri, klinik ortamlarda anestezi için daha geniş çaplı etkileri açıklayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Uçucu anesteziklerin farklı sinaptik yollarda çeşitli etkileri olup olmadığını belirlemek.
- Bu etkilerin belirli hücre tiplerine özgü olup olmadığını değerlendirmek.
- Anestetik maruziyeti sırasında popülasyon düzeyindeki tepkileri değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bu çalışmada kullanılan ana platform, hayvanlardan elde edilen ex vivo beyin dilimleriydi.
- Hedeflenen hücre tipleri arasında somatostatin ve parvalbumin-pozitif internöronlar yer aldı.
- Beyin dilimleri, doku hasarını en aza indirgemek için koşullarda hazırlandı ve korunmuştur.
- Deneyler, postsinaptik potansiyelleri ölçmek için optik genetik stimülasyon içermiştir.
- Kritik adımlar, deneysel çözeltilerin hazırlanmasını ve ışık stimülasyonu protokollerinin yapılandırılmasını içermiştir.
Ana Sonuçlar
- Izofluran maruziyeti, talamik ve kortikokortikal girdilere karşı sinaptik tepkileri baskılamıştır.
- Post-sinaptik potansiyel genlikleri ışık yoğunluğu ile artmış, hedeflenen internöronların duyarlılığını göstermiştir.
- Akım kaynak yoğunluğu hesaplamaları, belirli koşullar altında sinaptik aktivitenin arttığını vurgulamıştır.
- Bulgular, anestetiklerin nöronal uyarılabilirlik ve sinaptik modülasyon üzerindeki net etkilerini göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, anestetiklerin nöral devrelerdeki etkilerini incelemek için ex vivo beyin dilimlerinin yararlılığını göstermektedir.
- Uçucu anestezikler tarafından etkilenen sinaptik dinamikler hakkında bilgiler sunarak, anestezi altındaki nöronal mekanizmaların daha derinlemesine anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Bulgular, anestezi ve beyin fonksiyonu üzerindeki etkileriyle ilgili klinik uygulamaları bilgilendirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise dissection of anesthetic effects on defined neural pathways and cell types, supporting mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By isolating thalamocortical and corticocortical inputs in ex vivo brain slices, it provides quantitative, pathway-specific readouts that enhance target validation confidence. The approach aids in predicting how CNS-active compounds modulate network excitability and synaptic transmission, informing early go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether volatile anesthetics differentially affect synaptic pathways.
- Operational Value: Enables cell type- and pathway-specific assessment of drug effects on neuronal excitability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with selective modulation of thalamocortical versus corticocortical transmission.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with quantifiable extracellular and intracellular responses to afferent stimulation.
- Reproducibility: Standardizes optogenetic stimulation and anesthetic delivery via aCSF for consistent synaptic response measurements.
- Scalability: Supports multi-condition testing (control, drug, recovery) to enable dose-response and time-course profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thalamocortical circuits implicated in consciousness and sensory processing, aligning with neuropsychiatric indications.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving key physiological properties of cortical networks.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into anesthetic-induced suppression of postsynaptic potentials, informing safety pharmacology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a platform to evaluate CNS compound effects on defined neural circuits before in vivo testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathway-specific drug actions and biological de-risking of synaptic targets.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable postsynaptic potential and current source density outputs.
- Analytics: Enables comparison of synaptic responses across conditions using non-linear logistic fitting of light-intensity response curves.
- Translational Research: Maintains cortical circuit integrity to support extrapolation to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening anesthetic and non-anesthetic CNS modulators on isolated afferent pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating cell type-specific effects of volatile anesthetics on synaptic transmission.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue preparation, optogenetic stimulation, and anesthetic delivery in aCSF.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether compounds preferentially disrupt thalamocortical or corticocortical signaling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on pathway-selective modulation of interneuron activity in sensory cortex.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electrophysiology, and brain slice preparation.
- Depends on fluorescence-guided patch clamping and multi-channel extracellular recording systems.
- Necessitates precise control of anesthetic concentration in aCSF and light stimulation protocols.
- Involves adaptation considerations when translating findings across species or disease models.
- Limited by tissue viability duration and the need to maintain physiological conditions throughout experimentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
