Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Bu protokol, uçucu anesteziklerin bazı sinopsisleri diğerlerinden daha fazla bozup bozmadığını araştırmak, etkilerinin hücre tipi mi yoksa yola spesifik mi olduğunu belirlemek ve popülasyon düzeyinde hangi etkilerin meydana geldiğini belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uçucu anesteziklerin etkilerini değerlendirebildiğimiz özgüllüktür. Eşzamanlı olarak popülasyon aktivitesini test etmek için belirli yolları ve hücre tiplerini hedefleyebiliriz.

Doku bloğunu kesit için hazırlayarak başlayın. Beyni kafatası boşluğundan nazikçe kaldırın ve filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Beynin sagital düzlemi boyunca orta hatta paralel bir kesi yapın ve doku bloğunu bu sagital düzleme yerleştirin.

Filtre kağıdını engelleme şablonunun üzerine yönlendirin ve beyni alttaki şablon taslağıyla hizalayın. Şablon üzerindeki çizgilerle gösterildiği gibi koronal düzlemde paralel bir kesim yapın ve gerekirse filtre kağıdını ıslak tutmak için küçük bir damla dilimleme aCSF ekleyin. Doku bloğunu dört santigrat derece dilimleme aCSF'ye yerleştirin ve buz gibi soğuk numune aşamasına az miktarda yapıştırıcı uygulayın.

Doku bloğunu dilimleme aCSF'sinden kaldırın ve emici bir havlunun bir köşesi ile fazla solüsyonu fitilleyin. Doku bloğunun posterior koronal düzlemini, beynin dorsal yüzeyi safir bıçağa bakacak şekilde numune aşamasına yapıştırın. 500 mikrometre kalınlığında koronal beyin dilimleri toplayın ve bunları 34 santigrat derecede naylon bir ağ üzerine yerleştirin ve aCSF'yi dilimleyin.

Kabın oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Çözünmüş izofluran içeren deneysel aCSF torbaları hazırlamak için, boş bir politetrafloroetilen gaz torbasına 600 mililitre deneysel aCSF ve 600 mililitre %95 oksijen ve %5 karbondioksit gazı karışımı ekleyin. Bu çanta kontrolünü etiketleyin.

Başka bir politetrafloroetilen gaz torbasına 300 mililitre deneysel aCSF ekleyin ve bu torbayı izofluran olarak etiketleyin. İzofluran torbasını el yazması talimatlarına göre hazırlamaya devam edin. Her profile rastgele dalga formları atayarak ışık simülasyon protokollerini yapılandırın.

Atanmış dalga formuna sahip her profil, bir dijital TTL girişinden veya bir denemeden gelen bir tetikleme darbesine karşılık gelir. İşiniz bittiğinde profil sırasını kaydedin. Çok kanallı probu ex vivo beyin dokusu lamına yerleştirmek için, dakikada üç ila altı mililitre kabarcıklı deneysel aCSF'yi perfüze edin ve ilgilenilen alanı içeren beyin dilimini mikroskop perfüzyon odasındaki ağ ızgarasına aktarın.

Beyin dilimini platin bir arp ile sabitleyin. Ağ ızgarasını, çok kanallı probun distal ucundaki elektrot temas hattı, soyma yüzeyine yaklaşık olarak dik olacak şekilde döndürün. Geniş alan aydınlatması ve mikromanipülatörün hassas kontrolü altında, çok kanallı probu dilimin yüzeyine doğru indirin.

Kortikal afferentlerin akson terminallerinde eksprese edilen floresan raportör proteinin görselleştirilmesi için uygun filtre küpünü devreye sokun. Gerekirse, probu soyma yüzeyiyle daha hassas bir şekilde hizalamak için dilimi döndürün. Probu, x ekseni boyunca nihai hedef konumdan 200 mikrometre kısa dilim düzleminin hemen üzerine yerleştirin ve kaydedilen doku alanının dışında en az bir kanal bırakın.

Probu, uzunlamasına ekseni boyunca dilime yavaşça yerleştirin. Dokuya verilen hasarı en aza indirmek için, probu yalnızca keskin uçlar doku yüzeyinin hemen altında görülebilecek kadar ilerletin. Deneysel aCSF kaynağını torbalı kontrol çözeltisine geçirin ve hedeflenen yama kelepçesi kaydı için floresan etiketli hücreyi tanımlayın.

Diyaframı en küçük çapla sınırlayın ve çok kanallı prob ile objektif lens arasındaki teması önlemek için yüksek güçlü suya daldırma objektifini devreye sokun. Dokuyu odak noktasına getirin. Işığı, çok kanallı proba bitişik ancak onunla örtüşmeyen bir doku alanı üzerinde ortalayın.

Cre'ye bağlı floresan işaretleyiciyi ifade eden hücrelerin görüntülenmesine izin vermek için uygun filtre setini kullanın. Bir yama pipetini indirmek için geniş alan yaratmak için objektif lensi kaldırın. Dahili solüsyon içeren bir yama pipeti yükleyin ve elektrot tutucusuna monte edin.

Yaklaşık 0,1 mililitre havaya karşılık gelen pozitif basınç uygulamak için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Yama pipetini solüsyonun içine indirin, ucu görsel rehberlik altında odak noktasına getirin ve hedeflenen hücreden tüm hücre kaydını alın. Bu protokolde kullanılan hayvanlar, somatostatin veya parvalbümin pozitif internöronlarda floresan raportör protein tdTomato eksprese etti.

Bu internöronlar, uygun filtre küpü devreye girerken görsel rehberlik altında yama klemplemesi için hedeflendi. Postsinaptik potansiyeller, dört iki milisaniyelik ışık darbesi dizisine yanıt olarak internöronlarda gözlendi. Yerel saha potansiyelleri de kaydedildi.

Mevcut kaynak yoğunluğu ve çok birimli aktivite, yerel saha potansiyellerinden çıkarıldı. Akım kaynak yoğunluğundan çıkarılan akım lavabolarının genliği, ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak artmıştır. Üç parametreli doğrusal olmayan bir lojistik denklem, yollar arasında karşılaştırmalar için verilere uygun hale getirildi.

postsinaptik potansiyel genliği de akım sink genliği ile artmıştır. Kontrol, izofluran ve iyileşme koşulları sırasında talamokortikal ve kortiko-kortikal girdilere sinaptik yanıtlar ölçüldü. Somatostatin ve kortiko-kortikal uyaranların post sinaptik yanıtları ve uyarılmış akım lavaboları izofluran koşullarında baskılandı.

Beyin dilimlerini hazırlarken, dokunun sağlığını korumak çok önemlidir. Dilimleme prosedürü boyunca dokuyu serin tutmak, dokuya zarar vermeden hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Çok kanallı hücre dışı kayıtlar çeşitli şekillerde sonradan işlenebilir.

Örneğin, geniş bant sinyalinin yüksek geçişli filtrelemesi, popülasyon ani yükselme aktivitesini izole ederken, mevcut kaynak yoğunluğu hesaplamaları sinaptik aktiviteyi vurgular. Birlikte, bu teknikler, kortikal devrelerin belirli izole bileşenleri üzerindeki anestezik etkileri keşfetmemize izin vererek, in vivo bilinç kaybının altında yatan mekanizmalar hakkında fikir verdi.