Name: C. elegansta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Keşfedin C. elegans'ta nöronal agrega ve organel ekstrüzyonunun kantitatif puanlama yöntemlerini. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıkların patolojisini anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için canlı görüntüleme kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aşağıdaki NIH hibelerini kabul ediyoruz: R01AG047101 ve R37AG56510. Driscoll ve Grant laboratuvarlarının üyeleri, sıkı deneyler ve güçlü iletişim le tanımlanan protokollerin geliştirilmesine ve ince ayarlanmasına büyük katkıda bulunmuştur.

<ol><li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li>
<li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li>
<li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Know+No+Boundaries%3A+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107(2016).</li>
<li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li>
<li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367(2017).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351(2013).</li>
<li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768(2015).</li>
<li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes%2C+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li>
<li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway%2C+SKN-1%2FNrf%2C+and+stomatin-like+protein+STL-1%2FSLP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li>
<li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
<li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693(2013).</li>
</ol>

Agrega ve organel eliminasyonunun in vivo moleküler mekanizmalarının büyük eksophers şeklinde karakterizasyonu emekleme dönemindedir. Sınırdışı için yüklerin atanması, hücre içindeki bu yüklerin polarize toplaması, eksopher oluşturma kararının düzenlenmesi, ekstrüzyonlara aracılık eden makinelerin düzenlenmesi ve ekstrüzyonların komşu hücredeki bozunan makinelerle etkileşimi ile ilgili sorular ele alınmaya devam etmektedir. Ayrıca, kalsiyum, agrega ve mitokondri içeren biyolojik maddeleri geçirebilen boru bağlantılarının in vivo görselleştirilmesi ilginçtir ve kendi başına yeterince incelenmiştir. Bazı hücrelerin neden eksopher üretimine diğerlerinden daha yatkın olduğu sorusu da çözülmese de, bu protokolde belirtilen yaklaşımlarla genetik olarak incelenmeye başlanabilir.
Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan eksopher üretiminin tekrarlanabilir skorlama elde etmek için yaklaşımlar, yakındaki hücre somas gelen eksophers ayırt dikkat ile, eksopher üretiminin doruk yakalamak için analizzamanlaması, ve ekofher düzeylerini modüle etmek istenmeyen stresleri ortadan kaldırmak için büyüme koşullarının sıkı kontrolü. Büyük erken dışa dönük lük ya da çevredeki hipodermisin "yıldızlı gece" dağılımı, eksopher üretiminin kanıtı olarak ölçülebilir. Bu söyleniyor, bazal koşullar altında mCherry ifade nöronlar en sık bir eksopher üreten belirli bir tip nöronların% 5-25 ile ilişkilidir. Ekstrüzyon üreten nöronların %90'ı kadar yüksek olan ve özellikle modifiye ediciler için genetik veya farmakolojik ekranlar için yararlı olan eksopher üretimini artırmak için stres koşullarının kontrollü olarak getirilmesi uygulanabilir.
İnsan nörodejeneratif hastalık, büyük agregalar patoloji yayılmasını teşvik etmek için komşu hücrelere hastalıklı nöronlar aktarabilirsiniz. Eksopher mekanizması phyla boyunca agrega ekstrüzyon için kullanılan korunmuş bir mekanizma ile transpire olabilir. Ya bu sürecin verimliliğini artırmak in vivo molekülleri tanımlanması (daha etkili proteostaz kontrolü olarak kabul edilir) ya da birden fazla nörodejeneratif hastalıklarla mücadele için yeni stratejilerin tasarımı nı etkilemek için harnessed olabilir blok. Bu nedenle, burada açıklanan protokol klasik genetik mutagenez ekranları, genom çapındaki RNAi ekranları, arttırıcıları ve bastırıcıları tanımlamak için genleri sistematik olarak deviren ekranlar veya bu sürecin aday farmakolojik değiştiricilerini tanımlayan ilaç müdahale çalışmaları için kullanılabilir. Yaklaşım, biraz zahmetli olmasına rağmen, basittir. Eksophers onlar yüksek büyütme diseksiyon mikroskop ile görülebilir büyüktür. Yine de, C. elegans nöronlar nispeten küçük ve organelleri veya membranlar bakarak daha yüksek güç konfokal görüntüleri gerektirir ve yavaş bir süreçtir. Daha yüksek iş elde etme seçenekleri, çok iyi plaka biçiminde yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımlarını içerebilir.
Eksopher puanlama için standart bir yaklaşım uygulaması hangi nöronlar organize ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak sürecin uyumlu bir genetik diseksiyon altında yatan olmalıdır.

Agregalar ve disfonksiyonel mitokondri nörotoksik zorluklar uzun hücre içsel olarak kabul edilmiştir, ama daha yakın zamanda bir nöron kaynaklanan yanlış katlanmış insan hastalığı proteinleri de komşu hücrelere yayılabilir açık hale gelmiştir, patoloji teşvik1. Aynı şekilde, memeli mitokondri transsellüler bozunma 2 veya meydan2 komşu hücrelerde mitokondriyal popülasyonların kurtarılması için orijinal üretim hücre dışına gönderilebilir3. Çeşitli boyutlarda veziküller genellikle komşu hücrelere veya sıvıçevresinehücresel malzeme aktarmak için gözlenmiştir 4 . Bazı ekstrüde veziküller ortalama nöronal soma boyutuyaklaşım (ortalama dokunmatik nöron soma ~ 6 μm) ve büyük agregalar ve organeller barındırabilir.
Protein agregaları ve organeller taşıyabilir büyük vezikül ekstrüzyon çarpıcı bir örnek C. elegans dokunmatik reseptör nöronlar yüksek bir kopya numarası muhabiri bir zararlı toplama eğilimli kodlama oluşturmak ifade oluşur, bozulmaya dirençli mCherry5. Dokunma nöronlarından ekstrüzyonlar, eksoshers denilen ekstrüzyonlar, ~ 4 μm ortalama çapı, seçici mCherry veya diğer agregalar içerir, ve komşu hipodermis doğrudan teslim edilir, normalde dokunma reseptör nöronları çevreleyen. Hipodermis lizom bazlı bozulmayı dener, ancak mCherry agregaları gibi bazı sindirilemeyen içerikler hipodermis tarafından hayvanın sıvı dolu pseudocoelom'una yeniden ekstrüzyon yapılabilir, bu da mCherry'nin uzun süreli depolama için coelomocyte adı verilen uzak çöpçü hücreleri tarafından alınabilir (Şekil 1, Şekil 2)5.
Büyük ekstrüzyon ekzotek vezikülleri dokunma reseptör plazma zarı ile çevrili hücre bırakın ve toplu insan hastalığı proteinleri içerebilir, mitokondri, ve lizozomlar. Eksopher üretim süreci potansiyel olarak toksik türlerin sıralanması (örneğin bir toplama eğilimli ifade mCherry çözünür, çoğunlukla nöronal soma kalır GFP gibi zararsız proteinler ayrılmış) içeren gibi görünüyor. Bu şekilde, tehdit edici varlıkların yönlendirilmiş sınırdışı nöron tarafından gerçekleştirilir5. Bir proteostaz sorun, otofaji yıkılması tarafından indüklenen stres gibi, MG132 aracılı proteozom inhibisyonu, huntington hastalığı ile ilişkili genişletilmiş poliglutamin Q128 veya Alzheimer hastalığı ile ilgili parça Aβ1-42gibi insan hastalığı proteinlerinin transgenik ekspresyonu , exhers üreten nöronların sayısını artırabilir5.
Exophers sadece son zamanlarda belgelenmiştir gibi, ne onların biyoloji yararları açıklama bilinmektedir. Eksophers keşfedildi, ve en iyi çalışılan, C. elegans dokunmatik reseptör nöronlar. Altı C. elegans mechanosensory touch nöronlar olan hücre organları vücuda dağılmış var(Şekil 3A) ve mikrotübül hücreleri denir çünkü ultrayapısı ayırt edici özellikleri 15 protofilament mikrotübüller. Dokunma reseptör nöronlar anterior AVM vardır (anterior ventral mikrotübün nöron), ALMR, ve ALML (ön lateral mikrotübün nöronlar sağ ve sol), daha merkezi PVM (posterior ventral mikrotübül nöron), ve posterior PLMR ve PLML (posterior lateral mikrotübül nöronlar sağ ve sol). İlginçtir, altı dokunmatik reseptör nöronlar farklı oranlarda ekofherler üretmek, aynı saldırgan transgen ifade rağmen (Şekil 3C). Altı mekanosensoriyel dokunma reseptör nöronlar, ALMR nöron diğer dokunma nöronlar daha sık eksozgenez uğrar. Dokunma nöronlarından eksopher numaralarının sayısallaştırılması böylece genellikle ALMR'ye odaklanılarak kurulur.
Ekofhernez genellikle nöronal sitoplazmanın şişmesi ile başlayan dinamik bir süreçtir (Şekil 1A-B). Hücresel içerikler, organeller veya protein agregaları nöronal somanın bir tarafına toplanır, en sık ALMR nöronun arka ucuna doğru (projektif netüritten uzakta), bir ön eksosetki alanı (PED) oluştururlar(Şekil 1B). PED dışa doğru yansıtmaya başladığında erken çıkıntı gözlenir ve tanınabilir bir çıkıntılı tomurcuk oluşturur. Geç tomurcuk, soma-ekopher boynunun daralması çapından yaklaşık 1/3 daha büyük olan pre-exopher etki alanının en geniş çapı nın yaklaşık olarak 1/3'ü olduğunda tanımlanır(Şekil 1C). Eksophers soma hemen hemen herhangi bir yönde atılabilir, ancak en ekofers hücre gövdesinden posteriora çıkmak ve kökeni soma olarak yaklaşık aynı odak düzleminde kalır.
Dış aparat, tomurcuk boyun ince bir filament içine daralır gibi gelen soma uzak hareket edebilir. Exophers bu filament(Şekil 1D, ok)ile soma bağlı kalabilir ve daha sonra kopuk olabilir. Kalsiyum gibi hücresel içerikler, agregalar, ve mitokondri ekli exopher içine bu filament yoluyla transfer edilebilir5, ekstrüde malzemenin toplu büyük tomurcuklanma olayı tarafından exopher bölmesi içine konulsa da. Ekophers görünür bir bağlantı tüpü veya ince filament olduğunda olgun olarak kabul edilir ve eksopher gönderme soma tamamen ayrılır(Şekil 1E).
C. elegans dokunma nöronları tarafından üretilen exophers hemen hipodermis karşılaşma, dokunma nöron çevreleyen doku. En yaygın olarak, eksopher vezikül hipodermis içinde arka arkaya kuyruk doğru seyahat görünür, ve dışa dönük içeriği bozulma için hedefli görünmeden önce soma oldukça uzak olabilir (örneğin, mesafe ~ 100 μm uzaklıkta soma olabilir(Şekil 1F)). Floresan eksopher vezikül hipodermis içinde çok daha küçük veziküller içine ayrılır, bir görünüm alarak "yıldızlı gece"(Şekil 1G ve Şekil 2). "Yıldızlı gece" aşamasında, punctate floresan malzeme orijinal yalnız exopher göre floresan birçok küçük noktalarıiçine hipodermal senkronium dağılmış görülebilir. Yıldızlı gece düşük büyütme altında delinmiş bakabilirsiniz ve yüksek büyütme ile, punctate ve / veya hipodermis içinde ağ bakabilirsiniz. Yıldızlı gecenin floresan sinyali genellikle eksopher ve nöronsal olarak ifade edilen floresandan daha sönüktür (Şekil 2B-C). Birçok punctate veziküller içine mCherry dağılımı hipodermal hücrenin endozomal / lysozomal ağ ile fagozom olgunlaşma ve füzyon içerdiği düşünülmektedir. Bazı ekopher malzemeleri muhtemelen hipodermal lisozomal ağda bozulur, ancak bozulmaya karşı dirençli artık türler (mCherry agregaları gibi) hipodermisten hücresel enkaz içerebilen bir sıvı bölmesi olan pseudocoelom'a atılır. Floresan malzeme daha sonra coelomocytes denilen uzak çöpçü hücreleri tarafından alınır(Şekil 2C),hangi konsantre olabilir, depolamak, ve tekrar mCherry bozulmagirişimi.
Agrega ekstrüzyon ve transfer olgusu phyla boyunca korunmuş olarak görünür, C. elegans5gibi genetik modellerde bildirilmiştir 5,6,7 ve D. melanogaster8,9 yanı sıra birden fazla memeli modelleri. Ekopher benzeri ekstrüzyonlar memeli hücreleri için bildirilmiştir10, korunmuş mekanizmalar agrega ve organel ihracı altında yatan olabileceğini düşündüren bir gözlem. Exopher üretimi böylece temel bir hücresel enkaz yönetimi korunmuş bir mekanizma olabilir, ama daha önce tanınmayan, nöronal proteostaz ve mitokondriyal kalite kontrolü dalı, hangi, dengesiz, aktif nörodejeneratif hastalığa katkıda bulunabilir. Enkaz ayrımcılığı ve ayrıştırma ile ilgili moleküllerin tanımlanması, ayrı bir hücre altı lokaline taşınması, ekstrüzyon, soma ve geç eksopher'i birbirine bağlayan borubağlantısının oluşumu/makaslanması ve komşu hücre tarafından uzaktan bozulması için büyük ekstrüzyon vezikülünün tanınması gelecekteki çalışmalar için kalır. Nematod ve sinek modellerinde yapılan çalışmalar, agrega ve organel toplama ve aktarma mekanizmalarının tanımlanması, bu modellerin katılımcı molekülleri fizyolojik bağlamda tanımlamak için sunduğu tarafsız genetik yaklaşımlar ve güçlü hücre biyolojik araçlarının kullanılması açısından kritik öneme sahiptir.
Eksopher biyolojisinde etkili mekanizmaların deşifre edilmesinde kritik ilk adımlar, in vivo ekopher nicelleştirmede tekrarlanabilir protokollerin tanımlanmasını içerir. C. elegans modeli, vücut şeffaf olduğundan ve floresan etiketli proteinler veya organeller içerdiklerinde kolayca gözlemlenebildiği için bu tür çabalar için özel bir avantaj sunar. Ekophers C. elegans dopaminerjik nöronlar PDE ve CEP, ASE ve ASER duyusal nöronlar tarafından oluşturulan bildirilmiştir, ve boya dolum amphid nöronlar5. Dokunma reseptör nöronları tarafından üretilen ekophers en iyi karakterize olduğundan, burada odak ekofher analizi için dokunmatik nöronların kullanımı üzerindedir. Ancak herhangi bir hücreden eksopher üretimini ölçmek için temel yaklaşım uygulanabilir. C. elegans tarafından üretilen ekofherleri algılamak ve quantitate etmek için protokoller transgenically mCherry protein ifade reseptör nöronlar dokunun, takip edilebilir yükler ve puanlama zamansal kısıtlamalar üzerinde durularak. Bu makalede, in vivo ekopher tanımlamaya yönelik yaklaşımlar ve eksopher üretimini modüle eden çevresel ve genetik koşulların niceliği tanımlanabılmaktadır. Protokoller, temel eksopher üretiminin belirlenmesi ve genotipler arasında karşılaştırmalar için sürekli gerilim dışı koşullara eleştirel dikkat ilerler.

<table><tbody><tr><td>95B Bilimsel CMOS kamera</td><td>Fotometri Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; L düşük tutma uçları</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipet</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 & L düşük tutma uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>%13 sodyum hipoklorit</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>2 L erlenmeyer şişeleri</td><td>Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serolojik pipet</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L düşük tutma uçları</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 mL serolojik pipet</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-Floro-2'-deoksiüridin %98</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm steril Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>mutlak etanol</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans suşu vahşi tip</td><td>CGC N2 tarafından sağlanır</td><td></td><td>C. elegans suşu</td></tr><tr><td>kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>kolesterol</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>dibazik sodyum fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli suşu OP50</td><td>CGC</td><td>Op50</td><td>E coli suşu tarafından sağlanır</td></tr><tr><td>FBS10 Standart mikroskop</td><td>Meyer Instruments</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 Standart, Plaka Tabanlı, 100/100 Trinoküler Başlık ve Flip zoom</td></tr><tr><td>cam pipet 270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Aşılayıcı Yayıcılar</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB ortamı kapsüller</td><td>MP biyomedikaller</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &ndash; Lazer Diyot Aydınlatıcı</td><td>89 Kuzey</td><td></td><td></td></tr><tr><td>levamisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 multipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>monobazik potasyum fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standart çalkalama inkübatörü</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td>INFO28573</tr><tr><td>Nalgene 1 L Santrifüj kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipet</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipet çocuğu 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren mikro boncuklar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus zemine monte santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>Yeniden kullanılabilir halkalı sitoloji slaytları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5 [Pmec-4GFP]</td> <td>sözleşme Driscoll laboratuvarı</td><td></td><td>GFP dokunmatik nöronlarda ifade edilen</td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 Otoklav</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 Eğirme Diski Konfokal Ünite</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td><td>sözleşmeli Driscoll laboratuvarı</td><td></td><td>mCherry dokunma nöronlarında ifade edilir</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>sözleşme Driscoll lab</td><td></td><td>Q128 dokunma nöronlarında ifade edilir</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>sözleşme Driscoll laboratuvarı</td><td></td><td>mitoROGFP dokunma nöronlarında</td></tr> <tr><td>ifade edilirZB4528 bzIs166[Pmec-4mKiraz]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td> <td>dokunmatik nöronlarda ifade edilen</td> <td>sözleşme Driscoll laboratuvar</td><td></td> otofaji belirteci</tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans'ta büyük ekofher veziküllerde İnvivo nöronal agrega ve organel ekstrüzyon puanlama da kantitatif yaklaşımlar

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Yanlış katlanmış proteinlerin toksisitesi ve mitokondriyal disfonksiyon, türler arasında yaşa bağlı fonksiyonel nöronal gerileme ve nörodejeneratif hastalığı teşvik eden önemli faktörlerdir. Bu nörotoksik sorunlar uzun hücre-içsel olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, önemli kanıtlar şimdi bir nöron kaynaklanan yanlış katlanmış insan hastalığı proteinleri komşu hücrelerde görünebilir destekler, insan nörodejeneratif hastalık patoloji yaymak teşvik etmek için önerilen bir fenomen.
C. elegans yetişkin nöronlar bu toplama proteinleri ifade büyük ekstrüzyon olabilir (~4 μm) membran çevrili veziküller toplu protein içerebilir, mitokondri, ve lizozomlar. Bu büyük veziküller "ekophers" olarak adlandırılır ve ekzozomlardan farklıdır (yaklaşık 100 x daha küçüktür ve farklı biyogeneze sahiptir). Eksophers hücresel enkaz dışarı atma temel oluşturan korunmuş bir mekanizma tarafından oluşabilir, ama daha önce tanınmayan, nöronal proteostaz ve mitokondriyal kalite kontrolü dalı, hangi agregalar insan nörodejeneratif hastalıklarda yayıldı süreçleri ile ilgili.
Ekoferler çoğunlukla dokunma nöronların içinde yüksek kopya transgenik mCherry ifade hayvanlarda incelenmiş olsa da, bu protokoller flüoresans etiketli organeller veya nöronların çeşitli sınıflarda ilgi diğer proteinler kullanarak ekofhergenez çalışmalarında eşit derecede yararlıdır.
Burada açıklanan C. elegans ekophers fiziksel özellikleri, bunların tespiti için stratejiler, tanımlama kriterleri, nicelik için optimal zamanlama ve dışa dönük üretim düzeylerini modüle edebilir stresler için kontrol hayvan büyüme protokolleri vardır. Birlikte, burada özetlenen protokollerin ayrıntıları laboratuvarlar arasında eksophers kantitatif analizi için bir standart oluşturmak için hizmet etmelidir. Bu belge, eksopherlerin üretildiği ve eksopherlerin komşu ve uzak hücreler tarafından tepkiverilen moleküler mekanizmaları ayrıntılı olarak ortaya koyan laboratuvarlar için sahada bir kaynak olarak hizmet vermeyi amaçlamaktadır.

Exophers ölçmek için birden fazla floresan muhabirler kullanılabilir. Dokunma nöron eksophers kolayca ekstrüzyon için seçilebilir proteinlerin floresan etiketleme yoluyla in vivo görselleştirilmiş, ekstrüzyon olabilir organeller etiketleme, ya da hücre zarları etiketleme tarafından. Tablo 1, eksopherleri izlemek için kullanılan dokunma nöron ifade floresan muhabirleri tanımlar ve şekil 4'teyer alan temsili örneklerdir. Ekoferlerde ekstrüzyon yaptığı bilinen yükler arasında insan huntingtin'in N-terminal etki alanının genişletilmiş poliglutamin (Q128)(Şekil 4B)ile bir füzyonu , lysozomal membran proteini (LMP-1)(Şekil 4C)ile etiketlenmiş gfp etiketli lizozomlar ve mitokondri matris-lokalize GFP (Şekil 4D) ile etiketlenmiştir. Sitoplazmik GFP kuvvetle sınırdışı edilmez ve tercihen soma tutulur5, GFP zayıf ekoferler görselleştirmek rağmen(Şekil 4A). GFP çıkarılan proteinlere kaynaştığında, bu etiket eksopherleri görselleştirmek için kullanılabilir. Önemli bir nokta, farklı proteinlerin etiketlenerek, belirli yüklerin ve organellerin atılması ile ilgili çok çeşitli soruların yanı sıra dışa dönükleri oluşturan protein ve zarlarla da ele alınabileceğidir.
Sözde stereomikroskop kurulumu, hayvanlardaki eksopherleri agar plakalar üzerinde görüntülemek için etkili bir araçtır. Bu kurulum, her büyütme, sözde stereo teknoloji (stereoskopik taban üzerinde ayrık hedefler) ve yüklü hedeflere ara büyütme görüntüleme için bir zoom işletim anahtarı yüksek sayısal diyafram optik içeren bileşik ve stereoskopik teknoloji bir melez. Bunun gibi bir mikroskop, yüksek işlem liskor (tarama/toplama için kullanılan 2x hedef, tanımlama ve puanlama için kullanılan 10x hedefi) için nöronal morfoloji ve eksopher üretimini gözlemleyecek kadar güçlü 10x gözlük ve hedeflerle donatılmalıdır.
Standart stereomikroskopların büyütme yetenekleri genellikle floresan proteinleri ifade eden dokunmatik nöronların ağını görecek kadar yüksek çözünürlüğe sahip olsa da, soma'nın tübüler bağlantıları gibi dış eksilerin hücre altı detaylarını gözlemlemek için standart diseksiyon mikroskopları yeterli değildir. Bu tür gözlemler konfokal mikroskopi gerektirir (ekipman detayları için Malzeme Tablosu'na bakınız).
Exopher nicelik çalışmaları deneysel gerilmeleri ortadan kaldırmak için sıkı kontroller gerektirir. Tekrarlanabilir eksopher üretimi için tutarlı büyüme koşullarının özenli bakımı gereklidir. Daha spesifik olarak, eksopher üretimi, nesiller boyunca tutarlı besleme, sabit sıcaklık ve kontaminasyonsuz büyümenin tekrarlanabilirlik açısından kritik öneme sahip olması gibi strese duyarlıdır. mCherry yüksek nöronal ekspresyon ile bazal büyüme koşulları altında, eksopher üretimi nispeten düşük (ALM'lerin% 5-25 ekophers üretmek) ama bazı stresler, ozmotik ve oksidatif stres de dahil olmak üzere, eksopher oranlarını artırabilir. mCherry ekspresyonu stres olarak düşünülebilirken, eksopher düzeylerinin stres ekolünün bir sonucu olarak, eğer doğru şekilde kontrol edilirse, deneysel strese giriş eksophergenezin ivedine neden olmak ve gözlemlemek için bir strateji olabilir.
Zamanlama ve beklenen exopher üretim seviyeleri. Dışa dönükler larva gelişimi sırasında neredeyse yoktur. Genç erişkin yaşamda pik eksopher üretim dönemi son derece yetişkin gün 1-4 sırasında sınırlı gibi görünüyor, en sık yetişkin gün 2 veya 3 belirgin olmak. Tepe biraz ileri veya geri kayabilir çünkü, bir exopher üretim profilinin en eksiksiz değerlendirme yetişkin gün 1-4 üzerinde günlük birden fazla deneme puan etmektir. Genel olarak, bir ALMR en az 24 saat boyunca vezikül devam ile, bir büyük eksopher üretir. Eksopher oldukça hızlı bir şekilde (en hızlı dakika sırasına göre)üretilebilir. En yaygın olarak, sadece bir büyük eksopher erken erişkin yaşamında nöron başına üretilen, ancak birden fazla eksophers üretimi mümkündür.
Bazal koşullarda mCherry ifade ALM'ler tarafından genel eksopher üretimi yetişkin gün 2-3 optimal zaman dilimi içinde incelenen ALM'lerin% 5-25 arasında değişmektedir(Şekil 3D). Proteostaz krizleri5<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig1v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig1v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig2v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig2v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig3v3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig3v3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig4v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig4v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig5v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig5v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig6v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig6v2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61368/61368fig7v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61368/61368fig7v2large.jpg" target="_blank"></a>

Bu protokol, C. elegans hücreleri tarafından membrana bağlı ekophers şeklinde üretilen büyük agrega ve/veya organel ekstrüzyonların (~4 μm) tespiti ve niceliği için yaklaşımları açıklamaktadır. Bu enkaz kovma mekanizmasının diseksiyonunu kolaylaştırmak için gerekli suşları, büyüme koşullarını, puanlama kriterlerini, zamanlamayı ve mikroskopi hususlarını tanımlıyoruz.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Nörodejeneratif hastalık patolojisi yayılımı ile ilgili olarak, eksogenez, kötü anlaşılmış biyoloji adı verilen bir süreçle nöronlardan agrega ve organel ekstrüzyonun in vivo mekanizmalarını karakterize ediyoruz. Bu yaklaşımlar ekstrüzyon nöronal eksophers tekrarlanabilir puanlama elde etmek için gerekli ve komşu hücrelere nöronal transfer yoluyla hücresel çöp eliminasyonu mekanistik diseksiyon için bir platform göstermek. Nöronların agregaları nasıl çıkardığının in vivo mekanizmalarının tanımlanması, insan nörodejeneratif koşullarının tedavisinde yardımcı olmak için yeni stratejilerin tasarımını etkileyebilir.Bazal koşullar için, 20 santigrat derece sabit sıcaklıkta aynı biyolojik yaşta ev C.Elegans. Hücre içi dinamiklerin ve ekofhergenezin özelliklerinin canlı görüntülenmesi için, 20 kadar hayvanı cam mikroskop kaydırağında bir agaros pedine yerleştirin ve hayvanları hareketsiz hale getirin. Dikkatle felç solucanlar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin ve bir konfokal floresan mikroskop aşamasına slayt yerleştirin.Brightfield istenilen Z düzlemi tanımlamak için 10-40x objektif kullanın, solucan konumlandırma notları alarak, baş kuyruk oryantasyonu, ve vulva konumu, hangi daha sonra nöronal ve exopher kimlik için dönüm noktası olan. Aynı Z düzleminde kalarak, seçilen sitosolik muhabir için 10 ila 40 x geniş alan floresan görüntülemeye geçin ve odak düzlemindeki hayvanın derinliğini ve floresan ifadesini gözlemlemek için Z ekseni içinde ilerleyin. Baş floresan sinir halkası olacak, ve daha sivri kuyruk bir ila iki görünür posterior lateral dokunmatik nöron somas içerecektir.63x lens ile yüksek büyütme sinir halkası tanımlamak için yardımcı olabilir, nöronal süreçler, ve soma organları. İlk olarak hayvan ve lateral nöronal süreçlerin başında bulunan sinir halkası tanımlamak için yararlıdır. Bunu yapmak için, solucanın başında nöral süreçlerin bağlı olduğu sinir halkasının düzlemini belirlemek için yavaşça Z ekseninde ilerleyin.Bir kez sinir halkası tespit edilmiştir, floresan görünümünde vulva doğru arka yönde yanal bağlı nöronal süreci izleyin, soma belirgin olacak nerede. Yuvarlak soma vücut veya organları odak olduğunda, yakındaki tüm nöronlar belirlemek önemlidir. Dokunmatik nöron tanımlama için, ilk ALML bulmak, ALMR, ve AVM soma, hangi parlak sinyalleri olmalıdır ve sürecin sonunda yuvarlak bir hücre gövdesi ile işaretlenmiş.Bir kez en odak nöronal soma yer olmuştur, AVM hücre kullanın, bir ventral hücre, oryantasyon atamaya yardımcı olmak için. AVM nöron ALM ile aynı düzlemde ise, o zaman hayvan yan ve lateral nöron ALMR dinleniyor. AVM nöron söz konusu ALM ile aynı düzlemde değilse, odak düzlemine en yakın dokunmatik nöron ALML nörondur.Ayrıca yararlı PVM nöron tanımlamak için, kuyruk yakınında bulunan bir ventral dokunma nöron olan. PVM odak düzlemi ön dokunmatik nöron ALML veya ALMR olup olmadığını gösterir. Söz konusu ALM PVM ile aynı düzlemde ise, o zaman gözlenen dokunmatik nöron ALML nöron.En odak alm tespit edilip atandıktan sonra, ilgi alanı ve tüm Z uçakları nda yakın diğer soma organlarının konumlarını belirlemek önemlidir, exophers onları yanlış değil. İlgi touch nöron bulunduğunda, ALMR veya ALML, büyük çıkıntılı eksopher etki alanları için nöron incelemek, yeterince büyük bir tomurcuk eksopher olarak kabul edilecek, en az beşte biri kökenli soma boyutu. Hiçbir tomurcuk veya exopher etki gözlenirse, daha fazla soma vücuttan yayılan bağlı ince filaman için nöronal soma incelemek.Ekli eksophers soma kökenli yakın ve benzer bir Z düzlemde yer olma eğilimindedir. Bir bekar exopher tanımlamak için, genellikle soma daha parlak konsantre süzme floresan proteinler arayın. Burada tasvir edilmesine rağmen, büyük bir eksopher vardır.Tek bir soma dan kaynaklanan birden fazla floresan varlık olabilir. Farklı odak düzlemlerinde ve soma kaynaklı bulunan uzak lateral bölgede bekar eksophers arayın. Eksophers genellikle nöronal süreçten bir posterior yönde soma uzak çıkıntı.Nöronal somas olarak tanımlanan ve konumlandırılmayan büyük küresel nesneleri kontrol edin. Ekoferler genellikle boğucu yapılar olmasına rağmen, zaman içinde bozulabilir, daha düzensiz bir şekil elde. Yıldızlı gece olaylarının varlığını ve birden çok eksopher olayının örneğini arayın.Bir eksopher için yanlış ve düzlem dışı soma önlemek için, gözlem başında bile odak dışı somas, tüm yakın soma organları tanımlamak için önemlidir. Genişletilmiş veya sivri soma görülebilir, ancak net bir daralma yeri olmayan bir uzatma eksopher olarak puanlandırılmamalıdır. Exopher olay nicelleştirmede soma boyutunun beşte birine ulaşamayan küçük çözülmüş tomurcukları reddedin.Olgun nöritler yaşla birlikte önemli ölçüde uzatabilse ler ve floresan proteinler bu tür yapıların distal ucuna göç etseler de, dışa dönük çıkıntıları dışa dönük olarak saymaz. Ekophers olmayan floresan varlıkları tanımlamak için, geniş alan floresan altında yıldızlı gece vesiküler enkaz için yanlış olabilir herhangi bir otofloresan, dışlamak için emin olun. Embriyonik floresan sinyalleri dışlamak için, floresan ve brightfield aydınlatma arasında geçiş, ve rahim içinde yumurta ile sinyal ilişkilendirme kontrol edin.Bu tablo, eksopher üretimini izlemek için kullanılan farklı dokunma nöron ifade floresan muhabirlerin bir özetini sağlar. Ekzoteklerde ekstrüzyon yaptığı bilinen yükler arasında Q128, insan Huntington genişletilmiş poliglutamin tekrarlarının bir füzyonu, lysozomal ilişkili membran proteini ile etiketlenmiş lyozomlar GFP ve matris lokalize GFP ile etiketlenmiş mitokondri gibi agregalar bulunmaktadır. Sitoplazmik GFP güçlü bir şekilde sınır dışı edilmez ve tercihen soma'da tutulur, ancak GFP dışa dönükleri zayıf bir şekilde görselleştirmek için kullanılabilir.Genel olarak, bazal koşullar altında ALMR nöron ifade mCherry tarafından eksopher üretimi yetişkinliğin ilk gününde başlar ve yetişkin gün bir ila üç ana ekopher üretim zaman dilimi içinde incelenen ALMR yaklaşık% beş ila % 25 arasında değişmektedir. Özellikle gerilmeler ve genetik tedirginlikler ALMR nöronlar içinde eksopher üretimini büyük ölçüde artırabilir. Bu dışa etki alanları, bozulmamış eksophers, ya da yıldızlı gece olayları için ilgi ve çevredeki nöron incelemeden önce yakındaki tüm nöronlar bulmak için çok önemlidir.Ekopherleri manuel olarak tanımlamakta rahat olduğunuzda, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak büyük ölçekli tarama için geliştirilmiş iş verme yöntemleri kullanılabilir, böylece tüm genom analizi ve mekanistik ekophergenez diseksiyonu kullanılabilir.

quantitative-approaches-for-scoring-vivo-neuronal-aggregate-organelle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri...

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Büyük ölçekli 2D elektron mikroskobu (EM) veya nanotomi, nano ölçekli çözünürlüklü EM'nin doku çapında uygulamasıdır. Burada, zebra balığı larva beynini sağlıkta ve non-invaziv beyin hasarı üzerine araştırmak için uygulanan nanotomi için evrensel bir yöntemi açıklıyoruz.

Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Tekrarla ilişkili olmayan ATG bağımlı çeviri ürünleri, tekrarlayan genişleme tabanlı hastalıkların patojenik özellikleridir. Açıklanan protokolün amacı, c. elegansmodel sisteminde davranışsal ve hücresel tahliller kullanarak bu peptidlerin neden olduğu toksisiteyi değerlendirmektir.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Bu yazıda, C. elegans'tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Keşfedin C. elegans'ta nöronal agrega ve organel ekstrüzyonunun kantitatif puanlama yöntemlerini. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıkların patolojisini anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için canlı görüntüleme kullanır.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Daha fazla video keşfet