Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi
August 5th, 2020
Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.
Bu protokol, zaman içinde tek hücre düzeyinde türler arası bakteri etkileşimlerinin görüntülenmesi ve izlenmesine olanak sağlar. Bu tekniklerin ana avantajı, hücre takibi, gen ekspresyonu ve canlılık boyama dahil olmak üzere bakteri etkileşimlerini incelemek için uygulanabilirliğidir. Ayrıca, koşullar farklı organizmalar çalışma için değiştirilebilir.
Başlamak için, temiz bir 50 mililitre Erlenmeyer şişesinde 10 mililitre bakteri büyüme media%2 düşük erime agarose eriterek agarose pedleri hazırlamak. Mikrodalga agarose çözeltisi kadar kısa aralıklarla şişe, daha sonra en az 15 dakika boyunca 50 derece santigrat su banyosunda soğumasını bekleyin. 35 milimetrelik bir kapta açıklık ile bir silikon kesip hizalayın, sonra çanak çevirmek ve hafifçe çanak güvenli ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir spatula ile silikon kesip dokunun.
Agarose soğuduktan sonra, pipet 915 mikrolitre erimiş agarose kalıp içine ve ped kuru izin. Deneyi ayarlamadan en az iki saat önce mikroskop çevre odasını deneysel sıcaklığa ısıtın. Tüy bırakmayan bir mendil sıkıca yuvarlayarak nem mendilleri hazırlayın.
Haddelenmiş mendilin içine steril petri kabının içine yerleştirin ve 500 mikrolitre steril suyu doğrudan mendillere ekleyin. Tüm malzemeleri dengelemek için mendilleri, pedleri ve steril 35 milimetrelik çanak ları deneysel sıcaklığa ısıtın. Pedler kurutuldıktan sonra, pipet önceden ısıtılmış steril 35 milimetrecam kapaklı çanak altında eşit co-kültür bir mikrolitre.
Steril cımbız kullanarak agarose kalıbından kesilen silikonu çıkarın, yana doğru yatırın ve steril petriplate kapağına düşürmek için agarose pedin kenarının altına hafif çetredi bir spatula kaydırın. Pedaltında 90 derece açılı bir spatula kaydırarak ve aşılanmış kapak kayma üstüne yerleştirerek aşağı bakteri hücreleri alt tarafı ile çanak için ped aktarın. Kapak kayma karşı ped floş yapmak ve yavaşça herhangi bir hava kabarcıkları dışarı basın spatula kullanın.
Nemli mendilden fazla nemi çıkarın ve tabağa değmediğinden emin olmak için yemeğin kenarına yerleştirin. Örnek görüntüleme için hazır. Aşılanmış pedlerden önce, tüm görüntü çerçevelerini hizalamak için renk aydınlatması gerçekleştirerek mikroskobu ayarlayın.
Aşılanmış çanak hazır olduğunda, 100X objektif çanak görüntülemek ve bakteriyel sonuçlar odaklanmak. Görüntüleme yazılımındaki faz seçeneğini tıklatın ve ışık kaynağını seçerek ve çubuğu ışık yüzdesi ölçeğinde kaydırarak yayılan DIA LED ışığının yüzdesini ayarlayın. Alternatif olarak, bir pozlama süresini el ile girin.
Faz kanalına sağ tıklayarak ve Geçerli Mikroskop Ayarını Ata seçeneğini seçerek faz kanalının ayarlarını kaydedin. Floresan kullanıyorsanız, ilgi çekici kanalını seçin ve yayılan floresan ışığının yüzdesini ayarlayın, ardından daha önce açıklandığı gibi pozlama süresini ayarlayın. Alternatif olarak, açılan menüdeki diğer seçeneklerden birini seçerek dinamik aralığı ayarlamak için teklif derinliğini değiştirin.
Floresan kanalına sağ tıklayarak ve Geçerli Mikroskop Ayarını Ata seçeneğini seçerek floresan kanalının ayarlarını kaydedin. XY sekmesinde, seçili XY konumunu kaydetmek için nokta adı sütunundaki kutuyu tıklatın. Ardından, mükemmel odaklama sistemini açmak için sekmenin altındaki PFS kutusunu tıklatın.
Hücreleri odaklayın ve XY konumunun odağı kaydetmek için PFS sütunundaki oku tıklatın. Diğer tüm XY pozisyonları için bu işlemi tekrarlayın. Daha önce gösterildiği gibi aşama sekmesi altında XY pozisyonları için ayarları kaydedin.
Edinme aralığını, sıklığını ve görüntüleme süresini seçmek için zaman sekmesini tıklatın ve kutuyu işaretleyin. Ardından dalga uzunluğu sekmesini tıklatın ve görüntüleme ve kanal aralığı sıklığında kullanılacak kanalları seçmek için kutuyu işaretleyin. Ayarlarla balık tuttuğınızda, zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın.
S.aureus ile ortak kültürde, P.aeruginosa S.aureus kolonilerine doğru tek hücreli hareketliliği artırdığında, sallarda gruplanmış olarak kalan monokültürdeki P.aeruginosa hücreleriyle karşılaştırın. P.aeruginosa tek hücreleri saracak ve sonunda S.aureus kolonilerini istila edecek. Deney sırasında çok fazla veya çok az nem ve yanlış kurutulmuş pedler, pedin yer değiştirmesi ve hücreleri görüş alanıdışına sürüklemesi nedeniyle sürüklenmeye yol açan iki yaygın sorundur.
Fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisitesi hücrelerin ilk neden olabilir, onların floresan gevşek sonra bölme durdurmak ve sonunda sonraki çerçevelerde ölmek. Başlangıçta çok yakın olan hücreler, diğer türlerin yanıt verebileceği gizli sinyallerin bir degradesini oluşturmak için yeterli zamana sahip olmayabilirler. Bakteriyel hücre canlılığı agarose pedleri propidium iyodür ekleyerek görselleştirilmiş olabilir.
Yeşil hücreler gfp'yi aktif olarak ifade eden canlı hücreleri gösterirken, kırmızı hücreler P.aeruginosa hücresi serbest supernatant ile tedavi edildikten sonra ölü propidium iyodür lekeli hücreleri gösterir. Tek tek P.aeruginosa hücrelerinin hareketi, bir hücrenin saldan hücrelerin S.aureus kümesine ulaştığı çerçeveden ayrıldığı çerçeveden izlenir. P.aeruginosa salı ile S.aureus kümesi arasındaki mesafe Öklid mesafesini sağlarken, toplam pist uzunlukları birikmiş mesafeyi sağlar.
Her hücrenin yönelimliliği, öklid mesafesinin birikmiş uzaklığa oranı olarak hesaplanır. Yabani tip P.aeruginosa, s.Aureus'a göre daha yüksek yönlendirmeile vahşi tip S.aureus'a doğru hareket eder ve bu da yön motilitesi için gerekli olan agr-ressiyel salgılanan etkenlerden yoksundur. Bu protokolü denerken, her araştırmacının coğrafi konuma, laboratuvar ortamına ve onların özel deneyine göre canlı görüntülemede agarose pedlerinin kurutulması için koşulları optimize etmesi gerektiğini unutmamak gerekir.
Bu teknik Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus arasındaki etkileşimleri ortaya koymaktadır, daha önce toplu kültürdeki davranışlarını araştırmalarımız sırasında gizlenmiş, bu organizmaların enfeksiyonlar sırasında nasıl etkileştiğini anlamaya daha da yaklaştırıyor.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, zaman içinde tek hücre düzeyinde interspesif bakteri etkileşimlerinin görselleştirilmesini ve izlenmesini sağlar. Zaman aralıklı görüntüleme, hem tek kültür hem de eş kültür ortamlarında bireysel bakteri türlerinin gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Bakteriler arası etkileşimleri anlamak, mikrobiyal toplulukları incelemek için çok önemlidir.
- Tek hücre görüntüleme, hücre hareketliliği ve canlılığı hakkında bilgiler sağlar.
- Bu yöntem çeşitli bakteri türleri için uyarlanabilir.
- Zaman aralıklı görüntüleme, dinamik etkileşimlerin analizini geliştirir.
Çalışmanın Amacı
- Bakteriler arasındaki interspesif etkileşimleri görselleştirmek.
- Bireysel bakteri hücrelerini zaman içinde izlemek.
- Farklı koşullarda hücre canlılığı ve hareketliliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bakterilerin kültürü için agaroz yastıklarının hazırlanması.
- Büyüme ortamında düşük erime noktalı agarozun mikrodalgada eritilmesi.
- Agarozun soğutulması ve görüntüleme için silikon kesitlerin hizalanılması.
- Bakteriler arası etkileşimleri gözlemlemek için zaman aralıklı görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- Tek hücre düzeyinde bakteri etkileşimlerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Çeşitli koşullarda hücre hareketliliği ve canlılığının gözlemlenmesi.
- Bakteryal toplulukların interspesif dinamikleri hakkında bilgiler.
- Yöntemin farklı bakteri türleri için uyarlanabilirliği.
Sonuçlar
- Bu protokol, bakteri etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- Zaman aralıklı görüntüleme, hücre davranışı hakkında değerli veriler sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar çeşitli bakteri türlerini ve koşullarını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of interspecies bacterial interactions at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking in antimicrobial target validation. By capturing dynamic motility and invasion behaviors in co-culture, it provides predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing. The method’s adaptability to different pathogens enhances translational continuity in infectious disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing pathogen-specific motility changes in response to interspecies signaling.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of invasion behaviors dependent on virulence factor expression.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying directed cell movement as a functional readout of pathway activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible co-culture conditions.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through controlled agarose pad preparation and environmental equilibration.
- Scalability: Supports platform reuse across bacterial species with modifiable growth media and staining conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical viability assessment via live/dead staining with propidium iodide.
- Mechanistic De-risking: Tracks gene expression dynamics using fluorescent reporters to correlate genotype with interaction phenotypes.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions by quantifying Euclidean and accumulated distances as metrics of interaction strength.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative imaging outputs that inform go/no-go decisions in antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how secreted factors modulate single-cell motility in co-culture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized pad preparation and environmental controls ensuring reproducible imaging.
- Analytics: Generates quantitative readouts including directedness ratios, Euclidean distance, and track length for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work via viability staining that mirrors infection-relevant host-pathogen outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular imaging capability applicable to diverse bacterial pairs beyond P. aeruginosa and S. aureus.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing invasion dynamics obscured in bulk culture.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized agarose pad preparation and microscope setting preservation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking virulence factor expression to measurable motility changes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable interaction metrics that reflect pathogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy setup, time-lapse imaging, and bacterial co-culture handling.
- Depends on environmental control systems for humidity and temperature to prevent pad drift during acquisition.
- Necessitates standardization across teams for agarose pad preparation and staining protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different bacterial motility profiles and growth requirements.
- Limited by sample space constraints, making it unsuitable for high-density population studies over extended durations.
