Name: Kanser Farmakolojisi Araştırmaları için PDX ve PDX Türevli Organoidlerin Eşleştirilmiş In vivo/In vitro Hasta Kaynaklı Model Çiftlerinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Öğrenin, kanser farmakolojisi araştırmaları için PDX tümörlerinden organoid üretme yöntemini. Eşleştirilmiş in vivo/in vitro modeller, ilaç tarama ve doğrulama çalışmalarında yüksek güvenilirlik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, makalenin eleştirel okunması ve düzenlenmesi için Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi ve Rajendra Kumari'ye teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Crown Bioscience Oncology in vitro ve in vivo ekibine büyük teknik çabaları için teşekkür eder.

Çalışmaların yürütülmesinden önce, hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili tüm protokoller ve değişiklikler veya prosedürler Crown Bioscience Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Hayvanların bakımı ve kullanımı, AAALAC (Laboratuvar Hayvan Bakımını Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği) Uluslararası kılavuzlarına uygun olarak, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi, Ulusal Araştırma Konseyi (2011) tarafından bildirildiği şekilde gerçekleştirilmesidir. Tüm hayvan deneysel prosedürleri SPF (spesifik patojen içermeyen) tesislerinde steril koşullar altındaydı ve farklı devlet kurumlarından (örneğin, Ulusal Sağlık Enstitüleri) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na sıkı sıkıya uygun olarak yürütüldü. Protokoller, tesis kurumunda (örneğin kurumsal IACUC Komitesi) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Tümör nakline hazırlık
<ol><li>
Hayvan konutları
	<ol>
<li>Bireysel havalandırmalı kafeslerde, 20-26 °C'de, %30-70 nemde ve 12 saat ışık/12 saat karanlık bir aydınlatma döngüsünde, mısır koçani yataklarının haftalık olarak değiştiği ve ışınlama sterilize edilmiş kuru granül yiyeceklerin yanı sıra steril içme suyu ad libitum'da Ev Balb /c çıplak fareler (n=5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Donör tümör parçası hazırlama
	<ol>
<li>Vücut ağırlığı (BW, tartım dengesi ile) ve tümör hacmi (TV, kaliper ölçümü ile) için tümör taşıyan donör fareleri yakından izleyin.</li>
		<li>TV 800-1000 mm3'e ulaştığında, tümör taşıyan hayvanları biyolojik tehlike başlığında ötenazi edin.<ol>
<li>Fareleri odaya CO2 gazı veren bir kapaklı bir ötenazi odasına yerleştirin. Gazı, hayvana minimum sıkıntı ile hızlı bilinçsizlik üreten bir akış hızında odaya boşaltın. CO2 için optimum akış hızı 2-2,5 Lpm civarındadır.</li>
			<li>Hayvanların bilincinin yerine gelmediğini gözlemleyerek ötenaziyi sağlayın.</li>
			<li>Belirgin klinik ölümden sonra, bir hayvanın iyileşme olasılığını en aza indirmek için gaz akışını >1 dakika koruyun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İodofor sürüntüleri kullanarak tümörün etrafındaki cildi sterilize edin. Bitişik tümör dışı dokuları çıkararak ve ötanaziden önce önceden soğutulmuş (4 °C) 20 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirerek tümörleri toplayın.</li>
		<li>Kan bileşenlerini çıkarmak için tümörleri PBS ile başka bir Petri kabında yıkayın, ardından ikiye bölün ve ekstra deri, kan damarları, kireçlenme ve / veya nekrozu çıkarın.</li>
		<li>Transplantasyon için ayrı bir hayvan odasına taşınmadan önce, sadece sağlam tümör parçalarını 20 mL PBS'li steril 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Deri altı tümör büyümesi
<ol><li>
Tümör parçasının immün sistemi baskılanmış farelere deri altı aşısı
	<ol>
<li>PDX tümörlerini neşterle 2 mm parçalara ayırın ve her biri deri altı (SC) implantasyonu için trokarlara yerleştirin.</li>
		<li>Alıcı hayvanları% 5 izofluran ile uyuşturun (% 1'de bir burun konisi tarafından korunur). Hayvanlar rahatlar, sağ reflekslerini kaybederler ve sonunda acıya cevap vermeyene kadar hareketsiz hale gelir. Uyuşturulmış fareleri sağ yanal konumda bir deney tahtasına sabitlayın ve iodofor sürüntü örnekleriyle, özellikle tümör aşı bölgesini çevreleyen alanlarla sterilize edin.</li>
		<li>Sol kanat derisinde kalçaya sadece kranial, neşterle 0,5 cm'lik bir kesi yapın ve künt forseps kullanarak cildin altında ön ayak gücüne doğru 2-3 cm'lik bir tünel oluşturun.</li>
		<li>Aseptik olarak, aşılama bölgesi başına bir tümör parçası küpünü ortamdan aktarın ve deri altı tünelinin derinliklere yerleştirin. Yara klipsleriyle yaranın kapanmasından önce parçanın konumunu görsel olarak onaylayın.</li>
		<li>Sternal recumbence korumak için bilinçli hale gelene kadar tümör implante farelerini (5) izleyin ve ancak anesteziden tamamen iyileştikten sonra kafeslerine geri verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tümör taşıyan farelerin sağlık takibi
	<ol>
<li>Günlük su ve gıda tüketimini kontrol edin ve haftalık vücut ağırlığını kaydedin.</li>
		<li>Rutin izleme sırasında fareleri kontrol edin. Hareketlilik, nefes alma, tımar ve genel görünüm, gıda ve su tüketimi, BW kazanç / kaybı, assitler vb.</li>
		<li>Tv'yi kaliper kullanarak haftada iki kez ölçün ve her biri mm3 ile ifade edin: TV = 0,5 a × b2, burada a ve b sırasıyla tümörün uzunluğu ve genişliğidir.</li>
		<li>Aşağıdaki işaretlerden herhangi biri göründüğünde numune toplamak için hayvanları kurban edin: BW kaybı >20%; hareket kabiliyetinin bozulması (yiyememe veya içme); önemli assitler veya genişlemiş karın nedeniyle normal hareket edemez; solunum çabası; ölüm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nekropsi ve tümör hasadı
<ol><li>Tümör hacmi 200-800 mm3'e ulaştığında, onaylanan protokoller başına fareleri ötenazi edin (bkz. adım 1.2.2).</li>
	<li>Bitişik tümör olmayan dokuları çıkararak tümör dokularını toplayın, ardından dokuyu ayrışmadan önce AD+++ (buz üzerinde) ile 50 mL plastik bir tüpe yerleştirin.</li>
</ol>4. PDX türevi organoid kültürüne hazırlık
NOT: Aşağıdaki adımların tümü doku kültürü standardı yönergelerine göre bir biyogüvenlik kabini içinde gerçek gerçekleştirildi. 96, 24 ve 6 kuyulu önceden ısıtılmış stokları kullanmadan önce 37 °C'lik bir inkübatörde saklayın.
<ol><li>Reaktif preparatları<ol>
<li>Bodrum membran özü (BME) çözeltisi hazırlayın (büyüme faktörü azaltılmış, Fenol Kırmızısız). 10 mL BME'yi gece boyunca 4 °C buzdolabında saklayın. Çözdükten sonra, dağılmayı sağlamak için BME şişesini döndürün.</li>
		<li>Temel ortam/yıkama arabelleği AD+++ hazırlayın. 5 mL pipetle pipetleme yaparak Gelişmiş DMEM/F12 ortamına 5 mL 200 mM L-glutamin, 1 M HEPES ve Kalem/Strep ekleyin.</li>
		<li>Sato ve ark.18 N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nikotinamid (10 mM), SD20219 ile taban ortamı takviyesi yoluyla0 (10 nM), R-spondin (500 ng/mL), L-glutamin (2 mM), HEPES (10 μM), penisilin-streptomisin (1x) ve Y-27623 (10 μM)19.</li>
		<li>AD+++Sindirim ortamını hazırlayın: 500 μL kollajenaz tip II (20 mg/mL) ve 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM) ile 1x organoid kültür ortamının 10 mL'si.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tümör Ayrışması20<ol>
<li>50 mL plastik tüpteki tümörü 10 cm Petri kabına aktarın. Bir cetvelin yanında makroskopik bir fotoğraf çekin ve koşullarının bir açıklamasını kaydedin (örneğin, boyut, yağ dokuları, damarlanma, nekroz vb.).</li>
		<li>Aspirasyonla fazla AD+++'yı çıkarın ve tümör dokusunu makasla küçük parçalara bölün ve ardından kuru buzda çıtçıt dondurma için 2 mL mikrotüp içine 1-2 parça transfer. Genomik profil oluşturma için -80 °C'de saklayın. AD+++ kullanarak 50 mL plastik bir tüpe aktarmadan önce kalan parçaları makasla daha ince parçalara ayırın.</li>
		<li>Kıyılmış dokuyu 2-3 kez 35 mL AD+++ ile yıkayın, ardından 10 mL sindirim ortamı (bkz. adım 4.1.4) ve 37 °C'de 1 saat boyunca 4 x g'da bir orbital çalkalayıcıya yerleştirme.</li>
		<li>Sindirilen dokuyu 5 mL steril plastik pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin, ardından 20 mL AD+++ ve filtrasyon 100 μm hücre süzgeç ilavesi.</li>
		<li>Geçişi AD+++ ile iki kez yıkayın (5 dakika boyunca 450 x g'da döndürün), ardından BME'de resüspensyon (süspansiyon için pelete 4x hacim BME ekleyin) ve buzda tutun19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organoid kültürünün hazırlanması<ol>
<li>BME hücre süspansiyonu, kuyu başına toplam 200 μL'ye birden fazla damlada 6 kuyu plakasına ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 37 °C inkübatöre aktarın. 30 dakika sonra jel damlaları katılaşmaya devam etti.</li>
		<li>Her kuyuya 2 mL organoid ortam ekleyin, bir inkübatöre aktarmadan önce mikroskobik fotoğrafçılık tarafından kaydedilen temsili damlalarla (37 °C ve% 5 CO2).</li>
		<li>Organoid kültürlerini her 3-4 günde bir orta değişimle koruyun ve her 7 günde bir veya büyüme ve yoğunluklarına bağlı olarak 1:2 oranında geçiş.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Histopatoloji ve yeni nesil dizileme (NGS) analizi
<ol><li>Histopatoloji<ol>
<li>Bir P1000 pipet kullanarak mevcut ortamla kuyudan organoidleri toplayın, ardından santrifüjleme (5 dakika boyunca 450 x g'da döndürün), PBS ile yıkayın ve 1 saat boyunca% 10 formalin'de sabitleme.</li>
		<li>Sabit organoidleri% 100 jelatin içine 50 mL konik tüpün altına yerleştirin, ardından rutin doku işleme ve gömme.</li>
		<li>4 mm parafin bölümlerinde standart protokolleri kullanarak hematoksilin-eosin (H&E) boyama işlemi gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNAseq ve tüm ekzom dizilimi<ol>
<li>Bir P1000 pipet kullanarak mevcut kültür ortamı ile kuyudan organoidleri toplayın, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca maksimum hızda (12.000 x g)bir mikrosantrifüj kullanarak santrifüjleme.</li>
		<li>Görünür bir BME olmadığından emin olmak için orta süpernatantı çıkararak peleti toplayın, ardından bir mikrotüpte (kuru buz) çıtçıt dondurma ve ardından -80 ° C dondurucuya aktarın.</li>
		<li>Üreticilerden standart prosedür kullanarak RNA veya DNA çıkarın ve hem RNA hem de tüm ekzom dizilimi (WES) için NGS analizi yapın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. IC50 tahlil20
<ol><li>IC50 tahlil için 384 kuyu plakasında organoid tohumlama<ol>
<li>BME'deki organoidleri her kuyudan (SINdirme BME) 2 mL organoid ortam içeren her kuyuya (6 kuyu plakası) 20 μL 100x dispaz çözeltisi ekleyerek ve ardından 37 °C'de 10 dakikalık inkübasyon ekleyerek (BME'yi sindirerek) ayrıştırın.</li>
		<li>Pipet, organoidleri toplamak için 70 μm filtre ile tüm kuyulardan organoidleri 50 mL plastik bir tüpe sindirdi.</li>
		<li>Organoid konsantrasyonunun belirlenmesi için mikroskopi altındaki organoidleri sayın. Buz üzerinde% 5 (v / v) nihai konsantrasyona ulaşmak için BME eklemeden önce, kültür ortamını kullanarak organoidleri askıya alın.</li>
		<li>İlgili organoid kültürü ortamında kuyu başına 200 CR2110 PDO tohumlama yoğunluğuna sahip plaka haritasına göre, sıvı dağıtıcı ile her 384 kuyu plakasına 50 μL organoid süspansiyon ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cisplatin ve irinotecan tedavisi<ol>
<li>Cisplatin (en yüksek konsantrasyon 100 μM) ve "irinotecan" (en yüksek konsantrasyon 10 μM ile) kullanın. SN-38 ekleyin (irinotecan metaboliti, genellikle in vivo çalışmalar için kullanılan irinotecan aksine) her kuyuya 9 doz için ilaç seyreltme şemasına göre, dijital dispener tarafından seri seyreltme.</li>
		<li>Dijital dağıtıcı yazılım aracını kullanarak plaka haritası oluşturun. %100 canlılık ve %0 canlılık gösteren 5 μM starurosporine postive kontrolüne sahip negatif kontrol aracı ekleyin.</li>
		<li>İlaçla tedavi edilen 384 kuyu plakasını tekrar 37 °C inkübatöre yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İlaç tedavisi sonrası organoid hücre canlılığının belirlenmesi<ol>
<li>5 günlük ilaç tedavisinin sonunda, üreticinin önerdiği prosedüre göre lüminesan hücre canlılığı reaktiflerini kullanarak organoid hücre canlılığını belirleyin. Sıvı dispener ile her kuyuya parlak reaktif ekleyin ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde 5 dakika karıştırın, ardından karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon.</li>
		<li>Işıklı sinyali bir lüminesans çok kuyulu plaka okuyucusunda kaydedin.</li>
		<li>Plaka okuyucusundan gelen ham okumaları kullanarak her kuyunun normalleştirilmiş canlılıklarını hesaplayın ve doğrusal olmayan eğri sığdırarak bir doz yanıt eğrisi veIC 50 değerleri oluşturun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+erlotinib+resistance+with+tailored+treatment+regimen+in+patient-derived+xenografts+from+naive+Asian+NSCLC+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients.</a> International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).</li>
<li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+Cancer+Researchearch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in Cancer Researchearch.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Models+of+Cancer+Explode+with+Possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Weeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+genetic+diversity+in+organoids+cultured+from+biopsies+of+human+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Organoids+Predict+Chemoradiation+Responses+of+Locally+Advanced+Rectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Yang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+RNAi+library+based+on+partially+randomized+consensus+sequences+of+nuclear+receptors%3A+identifying+the+receptors+involved+in+amyloid+beta+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation.</a> Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+gastric+cancers+with+EGFR+amplification+and+overexpression+respond+to+cetuximab+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy.</a> Scientific Reports. 3, 2992(2013).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+defined+oncogenic+mutation+alleles+seems+to+better+predict+the+response+to+cetuximab+in+CRC+patient-derived+xenograft+than+KRAS+12%2F13+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations.</a> Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathology+of+Patient+Tumors%2C+Patient-Derived+Xenografts%2C+and+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines.</a> Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+Organoid+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Corcoran, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+BRAF+and+MEK+Inhibition+With+Dabrafenib+and+Trametinib+in+BRAF+V600-Mutant+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. , (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Crown Bioscience, Inc.'in şu anki tam zamanlı çalışanlarıdır.

Bu raporda pdx-/PDXO-CR2110 için ön veriler, her iki model de hastanın orijinal CSC'sinden elde edilen hastalık formlarını temsil ettiği için, genomik, histopatoloji ve farmakoloji açısından PDX ve türevi PDXO arasındaki biyolojik eşdeğerliği desteklemektedir. Her iki model de hasta kaynaklı hastalık modelleridir, potansiyel olarak hastaların klinik yanıtını tahmin eden10 , 11,12,21. Eşleşen in...

Kanserler çeşitli genetik ve immünolojik bozuklukların bir koleksiyonudur. Etkili tedavilerin başarılı gelişimi, klinik sonuçları etkili bir şekilde öngören deneysel modellere oldukça bağlıdır. İyi karakterize hasta kaynaklı ksinograftların (PDX) büyük kütüphaneleri, uzun zamandır, hasta tümör özelliklerini, heterojenliği ve hasta ilaç yanıtını1yeniden yakalama yetenekleri nedeniyle kemoterapi ve / veya hedefli tedavileri test etmek için tercih edilen çevirisel in vivo sistemi olarak görmektedir, böylece Faz II benzeri fare klinik çalışmalarının klinik başarıyı iyileştirmesini sağlar2,3. PDX'ler genellikle hücre hattı türetilmiş ksinograftların aksine genetik stabiliteye sahip kanser kök hücre hastalıkları olarak kabul edilir2. Son birkaç on yılda, dünya çapında büyük PDX koleksiyonları oluşturuldu ve bugün kanser ilacı geliştirmenin atı haline geldi. Yaygın olarak kullanılmasına ve büyük çeviri değerine sahip olmasına rağmen, bu hayvan modelleri özünde maliyetli, zaman alıcı ve düşük verime sahiptir, bu nedenle büyük ölçekli tarama için yetersizdir. PDX ayrıca bağışıklıktan zarar gören bir doğa nedeniyle immün-onkoloji (GÇ) testi için istenmeyen4. Bu nedenle, mevcut büyük PDX kütüphanesinden tam olarak yararlanmak pratik değildir.
Hans Clevers'in laboratuvarı5tarafından öncülük edilen son keşifler, epitel kökenli çoğu insan organında yetişkin kök hücrelerden üretilen organoidlerin in vitro kültürlerinin kurulmasına yol açmıştır5. Bu protokoller, çeşitli endikasyonların insan karsinomlarında varsayılan CSC'lerden organoidlerin büyümesine izin vermek için daha da rafine edilmiştir6,7. Bu hasta kaynaklı organoidler (PDO' lar) genomik olarak stabil8,9'dur ve klinik tedavi sonuçları 10 , 11,12'yioldukça tahmin ettiği gösterilmiştir. Ek olarak, PDO'ların in vitro doğası yüksek verimli tarama (HTS)13, böylece potansiyel olarak in vivo modellere göre bir avantaj sunar ve hasta popülasyonunun bir vekili olarak büyük organoid kütüphanelerinden yararlanır. PDO'lar, yukarıda açıklanan PDX'lerin birçok sınırlamasının üstesinden gelerek önemli bir keşif ve çeviri platformu olmaya hazırdır.
Hem PDO hem de PDX, terapötikleri kişiselleştirilmiş tedavi veya klinik çalışma formatı bağlamında değerlendirme yeteneğine sahip hasta kaynaklı ve CSC odaklı modellerdir. Bu nedenle,14, 15, 16, 17>3000 PDX'lerin tescilli koleksiyonu gibi mevcut büyük PDX kütüphaneleri, tümör organoidlerinin (PDX türevli organoidler veya PDXO) kütüphanelerinin hızlı üretimi için uygundur ve bu da eşleştirilmiş PDX ve PDXO modellerinin eşleştirilmiş bir kütüphanesiyle sonuçlanır. Bu rapor, kolorektal kanser PDXO-CR2110'u ebeveyn PDX-CR2110 model16ile ilgili olarak oluşturma ve karakterize etme prosedürünü açıklar.

<table><tbody><tr><td>İleri DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634028</td><td>Baz ortamı</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td>Yıkama ortamı</td></tr><tr><td>Kollajen tip II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Sindirim tümörü</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Organoid kültür matrisi (Bazal Membran Ekstresi, büyüme faktörü azaltılmış)</td></tr> <tr><td>N-Ac</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>B27</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504044</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7076</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Rspondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38-1000</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050038</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630056</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>Organoid kültür ortamı</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Tarama testi</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Tarama testi (ışıldayan ATP göstergesi)</td></tr> <tr><td>Multidrop dağıtıcı</td><td>Thermo Fisher</td><td>Multidrop kombi</td><td>Kaplama organoidler/CellTiter-Glo 3D ekleme</td></tr><tr><td>Dijital dağıtıcı</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>Bileşik ekleme</td></tr><tr><td>Envision Plaka okuyucu</td><td>Perkin Elmer</td><td>2104</td><td>Lüminesans okuma</td></tr><tr><td>Balb/c çıplak fareler</td><td>Pekin HFK Bio-Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>tRNA saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>DNAeasy Kan & Doku Kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>DNA saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td>Organoid gömme</td></tr></tbody></table>

kanser farmakolojisi araştırmaları için pdx ve pdx türevli organoidlerin eşleştirilmiş in vivo/in vitro hasta kaynaklı model Çiftlerinin oluşturulması

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Hasta kaynaklı tümör ksinograftları (PDX'ler), büyük ölçüde geleneksel kanser ilacı değerlendirmesi için kanser kök hücreleri (CSC) tarafından yönlendirildiğine inanılan en tahmine dayalı preklinik modeller olarak kabul edilir. Büyük bir PDX kütüphanesi hasta popülasyonlarının çeşitliliğini yansıtır ve böylece nüfusa dayalı preklinik çalışmalara olanak tanır ("Faz II benzeri fare klinik çalışmaları"); ancak, PDX düşük aktarım hızı, yüksek maliyetler ve uzun süre pratik sınırlamalara sahiptir. Aynı zamanda hasta kaynaklı CSC güdümlü modeller olan tümör organoidleri, büyük organoid veya bileşik kütüphaneleriyle başa çıkmak için belirli PDX sınırlamalarının üstesinden gelen PDX'in in vitro eşdeğeri olarak kabul edilebilir. Bu çalışma, PDX türevi organoidler (PDXO) oluşturmak için bir yöntem açıklar, böylece in vitro ve in vivo farmakoloji araştırmaları için eşleştirilmiş modeller elde edilir. Deri altı nakledilen PDX-CR2110 tümörleri tümör taşıyan farelerden, tümörler onaylanmış bir otopsi prosedürü başına 200-800 mm3'e ulaştığında, ardından bitişik tümör dışı dokuların çıkarılması ve küçük tümör parçalarına ayrışması toplanmıştır. Küçük tümör parçaları yıkandı ve enkazı gidermek için 100 μm hücre süzgecinden geçirildi. Hücre kümeleri bodrum membran özü (BME) çözeltisinde toplanıp askıya alındı ve CO 2 inkübatörde büyümek için çevreleyen sıvı ortama sahip katı bir damlacık olarak6 kuyulu bir plakaya kaplandı. Organoid büyümesi ışık mikroskopisi altında haftada iki kez izlendi ve fotoğrafla kaydedildi, ardından haftada 2 veya 3 kez sıvı orta değişim izlendi. Yetiştirilen organoidler, tripin ilavesi ve 10 μM Y-27632 ilavesi ile birlikte mekanik kesme kullanarak BME gömülü organoidleri bozarak 1:2 oranında daha fazla geçiş yaptı (7 gün sonra). Organoidler, bme'den santrifüjleme ile serbest bırakıldıktan sonra uzun süreli depolama için kriyo tüplerde kriyopreziteserv edildi ve ayrıca daha fazla karakterizasyon için örneklendi (örneğin, DNA, RNA ve FFPE bloğu).

Hafif mikroskopi altındaki organoidlere özgü ve H&amp;E boyama başına ebeveyn PDX ile tutarlı olan PDBO'ların morfolojisi Işık mikroskopisi altında PDXO-CR2110, daha önce hasta kaynaklı organoidler (PDO) için açıklandığı gibi tipik kistik morfolojiyi (Şekil 1A),pdxo ve PDO arasındaki benzerliği aynı kültür koşullarında destekleyen kanıtları göstermektedir.
H&amp;E boyama ile yapılan histopatolojik inceleme, PDXO-CR2110 doku yapılarının ve hücre...

İn vitro tarama için hasta kaynaklı ksinograftlar (PDX) kullanılarak organoidler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır, bu da eşleşen in vivo/in vitro model çiftleri ile sonuçlanır. PDX tümörleri mekanik veya enzmatik olarak küçük parçalara ayrıldı/işlendi, ardından Clevers'in orijinal PDX'e karşı pas geçen, kriyoprezerserve edilen ve karakterize edilen tümör organoidlerini yetiştirme yöntemi izlendi.

Kanser Farmakolojisi Araştırmaları için PDX ve PDX Türevli Organoidlerin Eşleştirilmiş In vivo/In vitro Hasta Kaynaklı Model Çiftlerinin Oluşturulması

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Bu protokol, eşleştirilmiş hasta türetilmiş ksinograftlar veya PDX ve buna karşılık gelen hasta türevi organoid çizgilerinden oluşan eşleştirilmiş bir kitaplık oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı, in vitro tarama için PDX kullanarak organoid oluşturmak için kullanılabilmesidir, bu da eşleşen in vivo / in vitro model çiftleri ile sonuçlanır. Tümörleri toplayarak ve metin el yazmasında açıklandığı gibi dokuyu işleyerek başlayın.Doku sindirimi sonrası, beş mililitre steril plastik pipet ile dokuyu yukarı ve aşağı pipet. Daha sonra homojenliğe 20 mililitre AD + ekleyin ve 100 mikrometre hücre süzgeci ile filtreleyin. Filtratı AD+ ile iki kez yıkayın, ardından plastik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin.BME'deki hücreleri yeniden biriktirin ve buzda tutun. Organoid kültürünü hazırlamak için, hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın ve plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Her kuyuya iki mililitre organoid ortam ekleyin ve temsilcinin mikroskop altında düştüğünü görüntüleyin.Organoid kültürlerini 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte, her üç ila dört günde bir orta değişikliklerle ve her yedi günde bir-iki oranında geçişle koruyun. Organoidleri ayrıştırtıktan sonra, 70 mikrometrelik bir filtreden 50 mililitrelik plastik bir tüpe geçirin. Organoidleri mikroskop altında sayın ve %5'lik son konsantrasyon için bme'de buz üzerinde yeniden depolayın Her 384 kuyu plakasına 50 mikrolitre organoid süspansiyonu ekleyin ve kuyu başına 200 CR2110 PDBO tohumlama yoğunluğu için sıvı bir dağıtıcı ile ekleyin.Seri seyreltmede her kuyuya SN38 eklemek için dijital dağıtıcıyı kullanın. Dijital dağıtıcı yazılım aracını kullanarak bir plaka haritası oluşturun. Tedaviler% 100 canlılığa sahip negatif kontrol aracını ve% 0 canlılığa sahip beş mikromolar Staurosporine pozitif kontrolünü içermelidir.Bittiğinde, ilaçla tedavi edilen 384 kuyu plakasını 37 santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin. Hafif mikroskopi altında PDXO CR2110, pdx türevi organoidler ile hasta kaynaklı organoidler arasındaki benzerliği gösteren tipik kistik morfolojiyi aynı kültür koşullarında göstermektedir. H&E boyama ile yapılan histopatolojik inceleme, PDXO CR2110'un doku yapılarının ve hücre tiplerinin orijinal PDX CR2110 ile benzer olduğunu ortaya koymaktadır.PDX ve PDXO'nun genomik profil karşılaştırmaları transkriptom ekspresyonunun %94,92 korelasyonunu ve DNA mutasyonlarının %97,67'sini göstererek bu model çifti arasında genel bir genomik benzerlik olduğunu göstermektedir. PDXO CR2110'da 384 kuyu plakasında uyuşturucu duyarlılığı tahlilleri yapıldı. PDXO CR2110, PDX tedavi sonuçlarına uygun olarak irinotekan duyarlı ve cisplatine karşı dirençliydi.Eşleşen in vitro ve in vivo modelleri, in vitro tarama ve in vivo doğrulama için birbirlerine iltifat edebilir, ilaç keşfinin başarı oranını iyileştirir ve klinik gelişimde yıpratma oranlarını potansiyel olarak azaltabilir.

creating-matched-vivoin-vitro-patient-derived-model-pairs-pdx-pdx

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Pankreas duktal adenokarsinomun hasta kaynaklı organoid kültürleri, epitel aliskan kollektifini yüksek sadakatle temsil eden, bu öldürücü maligniteye çeviri araþtirici araþtýrýmý saýkan, hýzlýklý bir 3 boyutlu modeldir. Burada organoidlerin kurulması ve yayılması ve bu modelleri kullanarak ilgili biyolojik tahlillerin gerçekleþtirilen ayrýntýlý yöntemlerin yer alýnmasýný saýlýyor.

Hasta Kaynaklı Pankreas Duktal Adenokarsinom Organoid Modellerinin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

Aşağıdaki çalışmada, kolorektal ve pankreas kanserinden oluşan büyük bir biyobankanın kurulması için gerekli ardışık adımları açıklıyoruz.

Yaşayan Bir Biyobankanın Oluşturulması ve Bakımı - Nasıl Yaparız

Kanser dokularına benzer ancak 96 kuyulu ve 384 kuyu plakalı in vitro yüksek verimli tahlil sistemleri için uygun olmayan, hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO) kullanan antikanser ilaçları değerlendirmek için son derece hassas bir in vitro yüksek verimli tahlil sistemi geliştirilmiştir.

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Bu protokol, orta ila yüksek verimli organoid ilaç taramaları için yarı otomatik bir yöntemi ve intratümör heterojenitesini yakalamak için multiparametrik, tek organoid ilaç yanıtlarını ölçmek ve görselleştirmek için mikroskoptan bağımsız, otomatik görüntü analiz yazılımını açıklamaktadır.

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Bu protokol, anaplastik tiroid karsinomu (ATC) ve baş boyun skuamöz hücreli karsinomunun (HNSCC) hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelini oluşturmakta ve karakterize etmektedir, çünkü PDX modelleri translasyonel onkoloji alanında hızla standart hale gelmektedir.

Anaplastik Tiroid Karsinomu ve Baş-Boyun Skuamöz Hücreli Karsinomun Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması ve Karakterizasyonu

Hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri ile terapötik ilaç testi yapmak için kullanılabilecek bir protokol sunuyoruz.

Klinik Öncesi İlaç Testi için Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoid Modeller

Tümör organoidleri, kanser araştırmalarında ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımında devrim yarattı. Araştırmacıların klinikte tümörden bir adım önde olmalarını sağlayan klinik olarak ilgili bir tümör modelini temsil ederler. Bu protokol, taze pankreas tümör dokusu örneklerinden ve pankreas adenokarsinomu kökenli hasta kaynaklı ksenogreftlerden tümör organoidlerini oluşturur.

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Hasta kaynaklı tümör organoidleri, temel ve translasyonel araştırmalar için gelişmiş bir model sistemdir. Bu yöntem makalesi, farklı organoid fenotiplerin eşzamanlı kinetik değerlendirmesi için çoğullanmış floresan canlı hücre görüntülemenin kullanımını detaylandırmaktadır.

Kanserin Hasta Kaynaklı Organoid Modellerinde İlaç Yanıtları için Çoğullanmış Canlı Hücre Görüntüleme

Burada, taze melanom dokularından ayrışmış hücre süspansiyonlarını kültürleyerek melanom hastadan türetilmiş organoidler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu organoidler, hastaya özgü tümörleri in vitro olarak aslına uygun olarak özetleyerek, tümör immünosupresif mekanizmalarını, ilaç taramasını, ilaç direnç mekanizmalarını ve kanser sürveyans yaklaşımlarını keşfetmek için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Öğrenin, kanser farmakolojisi araştırmaları için PDX tümörlerinden organoid üretme yöntemini. Eşleştirilmiş in vivo/in vitro modeller, ilaç tarama ve doğrulama çalışmalarında yüksek güvenilirlik sağlar.

Kanser Farmakolojisi Araştırmaları için PDX ve PDX Türevli Organoidlerin Eşleştirilmiş In vivo/In vitro Hasta Kaynaklı Model Çiftlerinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal

Kanser Farmakolojisi Araştırmaları için PDX ve PDX Türevli Organoidlerin Eşleştirilmiş In vivo/In vitro Hasta Kaynaklı Model Çiftlerinin Oluşturulması

Daha fazla video keşfet