Name: İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Keşfedin iskemik inme koşullarında nöron-glia etkileşimlerini incelemek için sıçan embriyonik korteksinden astrosit ve nöron izolasyonu yöntemini. Bu hücre kültürü modeli, oksijen ve glukoz yoksunluğu protokolü kullanarak nöroprotektif mekanizmaları araştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Fundação para a Ciência e a Tecnologia tarafından Projeler UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 ve burs SFRH/BD/135936/2018 jp aracılığıyla fon desteği kabul, tarafından ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" proje centro-01-0145-FEDER-000013 ve Proje POCI-01-0145-FEDER-022122 ile BioImaging PPBI-Portekizplatformu finansman.

Kullanılan tüm hayvanlar CICS-UBI Sağlık Bilimleri Araştırma Merkezi'nde hayvan araştırmaları için ulusal etik gerekliliklere ve Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlariçin Kullanılan Omurgalı Hayvanları Koruma Avrupa Konvansiyonu'na uygun olarak yetiştirilmiştir (Direktif 2010/63/EU).
1. Sıçan embriyo korteks birincil hücre kültürü
<ol><li>Kültür orta hazırlık<ol>
<li>Nörobazal Orta (NBM) aşağıdaki takviyeleri ekleyerek hazırlayın: 2% B27, 0.5 mM glutamin, 25 μM glutamat ve 120 μg/mL gentamicin. Homojenize, pH'ı 7,2'ye ayarlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak ortamı vakumlu filtrasyon adımıyla sterilize edin. Nöron-glia hücre kültürü için, Isı-Inaktive Fetal Sığır Serumu% 10 ile NBM hücre kültürü orta tamamlamak (HI-FBS).</li>
		<li>Aşağıdaki takviyeleri ile Minimum Esansiyel Orta Kartal (MEM) orta hazırlayın: sodyum hidrojen karbonat 2.2 g /L, sığır pankreas 5 mg / L insülin, D-glukoz anhidrous 3.4 g/L, penisilin (12 U / mL) / streptomisin (12 μg /mL) ve 10% HI-FBS. Homojenize, pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve bir filtrasyon adımı ile ortamı sterilize edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Malzeme ve ekipmanların hazırlanması<ol>
<li>1 mL plastik mikropipet ucunun terminal kısmını, belirli bir çapa sahip bir iğne (S için 0,5 mm; M için 0,6 mm; L için 0,8 mm) kullanarak delin ve ucun açılmasını alev kullanarak kapatın.</li>
		<li>Tüm cam ları sterilize et. Diseksiyon boyunca kullanılan araçları (örneğin, makas, cımbız, neşter) % 70 etanol batırılmış tutun. Laminar akış odasına girmeden önce malzemeleri %70 etanol ile püskürtün.</li>
		<li>Su banyosu sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve işlem başlamadan önce hücre kültürünü su banyosuna yerleştirin. NOT: İmmünositokimya tahlillerinde poli-D-lizin kaplama, kapaklı çok kuyulu plakalarda yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıçan embriyonik korteks kültürü<ol>
<li>15-16 günlük gebelik (24 saat sürmesi gereken miyetingin sonunda, embriyonik gelişimin1. günü olarak kabul edilir) dişi bir Wistar sıçanından fare embriyolarını çıkarın. Bu amaçla kadını ketamin (87.5 mg/kg) ve ksilazin (12 mg/kg) ile uyuşturur ve embriyoları çıkarın. Sonra standart protokolü izleyerek servikal çıkış ile kadın sıçan ötenazi.</li>
		<li>Embriyoları 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin, embriyoları kaplayana kadar fosfat tampon salini (PBS) ekleyin ve hızla kültür odasına götürün.</li>
		<li>Hala sarısı kese içinde, soğuk PBS 25 mL içeren bir Petri kabına embriyoyerleştirin. Makas ve cımbız yardımıyla, sarısı kese kırmak, embriyo kaldırmak ve başka bir Petri çanak da soğuk PBS içeren transfer. Petri kabındaki PBS tüm embriyoyu karşılamaya yeter. NOT: Embriyoya zarar vermemek için yumurta kesesini açarken dikkatli olun. 1.3.3 ve 1.3.4'te, PBS'yi düşük sıcaklıkta tutmak için emici kağıtla kaplı buz paketlerinin üzerine yerleştirilen 90 mm çapında Petri tabakları kullandık.</li>
		<li>Embriyonun diseksiyonu için, 30 mL soğuk PBS içeren başka bir Petri kabına aktarın. Embriyoyu bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve bir cızırtıcı kullanarak hareketsiz hale getirin. Kortekse paralel ilk kesi yapın, ağız sonuna kadar oküler kavite gidiyor ve hayvan ın kafasını kesmek için dikkatli olun.</li>
		<li>Dikkatle kortikal beyin dokusuzarar değil, cımbız kullanarak kafa derisi ve menenjler kaldırın. Korteksi ayırmak için bir sonraki kesiği yapın. Kortikal dokuyu Pasteur pipeti kullanarak 5 mL PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Kortikal beyin dokusunun mekanik sindirimini 1.2.1'de hazırlanan 1 mL plastik uçlar kullanarak gerçekleştirin. Normal bir pipetle 10 kez triturate ve parçalar parçalanana kadar, giderek daha küçük delikler (L, M ve S) ile pipetler kullanarak işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Mekanik sindirimden sonra süspansiyonu 400 x g'de 3 dk santrifüj edin. Supernatant atın ve daha önce 37 °C'de ısıtılmış uygun hücre kültürü ortamı ile tortu resuspend.</li>
		<li>Neubauer haznesini kullanarak hücre süspansiyonunda bulunan toplam hücre sayısını (hücre yoğunluğu) belirleyin, uygun seyreltmeleri yapın ve hücreleri plakalayın. İlk hücre yoğunluğu bir önceki çalışmaya göre tanımlanmıştır5.<ol>
<li>Nöronla zenginleştirilmiş bir kültür için, ilk hücre yoğunluğu olarak 0.21 x 106 hücre/cm2 kullanın ve HI-FBS olmadan NBM kültür ortamındaki hücreleri koruyun.</li>
			<li>Nöron-glia kültürleri için ilk hücre yoğunluğu olarak 0.14 x 106 hücre/cm2 kullanın ve NBM kültür orta hücreleri korumak için 10% HI-FBS ile takviye.</li>
			<li>Astrositle zenginleştirilmiş bir kültür için, ilk hücre yoğunluğu olarak 0,26 x 106 hücre/cm2 kullanın ve MEM'deki hücreleri daha önce belirtildiği gibi koruyun.</li>
			<li>Hücreleri 37 °C, %95 O2 ve %5 CO2olarak ayarlanmış bir kuvöze yerleştirin. NOT: Daha uzun kültür dönemleri için hücre büyümesini bastırmak için 27 μM 5-floro-2′-deoksitürin 68 m uridin gibi bir anti-mitotik eklenmelidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ortak kültür sistemi
<ol><li>Malzemelerin hazırlanması<ol>
<li>Parafini 150 °C'de Bir ısıtma bloğunda yaklaşık 7 dakika ısıtın. İşlem bitene kadar 150 °C'de tutun. Daha sonra, 1 mm çapında steril cam Pasteur pipet yardımı ile, sterilize ve PDL kaplı kapakları üzerinde küçük bir damla ekleyin. Parafin küreleri düzensizdir, ancak yaklaşık 2 mm çapa sahiptir. Küreler iki kültürün yaklaşık 1,25 mm ile ayrılmasını sağlayacaktır.</li>
		<li>Parafin steril olmadığı için, 15 dakika boyunca ultraviyole radyasyon altında parafin küreler ile multiwell yerleştirin.</li>
		<li>Ortak kültürü kurmak için, daha önce 15 dakika boyunca %70 etanol le batırılmış bir cızırtı kullanarak parafin küreleri ile kapak kaymasını aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ortak kültür<ol>
<li>İki kültür kullanıma hazır olduğunda (örneğin, adım 1.3.8'de belirtilen koşullar altında kültürde 7 gün geçirdikten sonra), parafin küreleri ile kapaklarda tohumlanan nöronları astrositiçeren kuyulara aktarın.</li>
		<li>24 saat önce iki kültür temas getirilir, nöronların ve astrositlerin kültür ortamı nı nbm takviyesi ne de değil, HI-FBS ile, deneyin amacına bağlı olarak değiştirin.</li>
		<li>Temas her iki hücre tipleri yerleştirdikten sonra, farklı uyaranlar ve prosedürler başlamadan önce 8-12 saat bekleyin. NOT: Ortak kültür sisteminin şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Oksijen ve glikoz yoksunluğu
<ol><li>Kültür Orta Hazırlık<ol>
<li>OGD deneyleri için Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi'ni (HBSS) kullanın. Aşağıdaki reaktifler ile HBSS ortamını hazırlayın: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homojenize ve 7.2 için pH ayarlayın. Filtrasyon ile ortamı sterilize edin. NOT: Uygunsa, 5,56 mM glikoz ekleyerek HBSS çözeltisini glikoz (HBSSglu+) ile tamamlayın. OGD'ye gönderilen kültürler için HBSS ortamını glikoz (HBSSglu-) ile tamamlamayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OGD prosedürü<ol>
<li>Hücreleri tohumlama dan 7 gün sonra, kültür ortamını çıkarın ve HBSSglu ile iki kez yıkayın. Yıkandıktan sonra HBSSglu- hücre kültürü ortamını ekleyin ve çok kuyuyu hipoksi odasına yerleştirin.</li>
		<li>Hipoksi odasını kapatın ve odanın içindeki oksijeni çıkarmak için 4 dk için %95 N2/5%CO2 içeren bir gaz karışımı ekleyin ve 20 L/dk'lık bir akışla. Bundan sonra, akışı durdurun ve hipoksi odasını amaçlanan iskeminin derecesine bağlı olarak 37 °C'de 4 saat veya 6 saat için bir kuvöze yerleştirin.</li>
		<li>OGD süresinden sonra HBSSglu-orta sını kalan işlemler için uygun kültür ortamı ile değiştirin. NOT: OGD deneyi, hücrelerin iskemik bir olay sırasında maruz kalınan in vitro koşullarını simüle etmeyi amaçlamaktadır, bu nedenle daha önce kullanılan tüm ortamların kaldırıldığını onaylamak önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. İmmünositokimya testleri
NOT: Daha önce açıklandığı gibi immünostokimya tayinigerçekleştirin 5.
<ol><li>Kısaca, farklı kortikal kültürleri karakterize etmek için, 4 °C'de hücreleri tavşan anti-GFAP (1:2000) ve fare anti-mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2; 1:500) ile bir gecede kuluçkaya yatırın; ve sonra 1 saat oda sıcaklığında aşağıdaki ikincil antikorlar ile: anti-tavşan Alexa Fluor 546 ve anti-fare Alexa Fluor 488, her ikisi de 1:1000 seyreltme konjuge.</li>
	<li>Hücre çekirdeklerini oda sıcaklığında 10 dk için 2 μM Hoechst 33342 ile kuluçkaya yatarak etiketlayın.</li>
	<li>Floresan montaj ortamındaki kapakları monte edin ve 63 x büyütme ile epifloresan mikroskobunda görüntüler elde edin.</li>
</ol>5. İstatistiksel analiz
<ol><li>Verileri, toplam hücre sayısının yüzdesi veya denetim yüzdesi olarak ifade edin ve üç aylık ortamda gerçekleştirilen en az 3 bağımsız denemenin ortalama ± standart hatası (SEM) olarak sunulur.</li>
	<li>Eşleşmemiş Öğrencit testini kullanarak yazılımla (GraphPad Software Inc., t San Diego, CA) istatistiksel analiz yapın. Sonuçlar p < 0.05 değerlerinde anlamlı olarak değerlendirildi.</li>
</ol>

<ol><li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+in+the+21%28st%29+Century%3A+A+Snapshot+of+the+Burden%2C+Epidemiology%2C+and+Quality+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).</li>
<li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+ischaemic+stroke%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li>
<li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+treatment%2C+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).</li>
<li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+and+astrocytes%3A+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287(2012).</li>
<li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li>
<li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li>
<li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tripartite+synapse%3A+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li>
<li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity%3A+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins%2C+radicals%2C+and+oxidant+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li>
<li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li>
<li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion-induced+oxidative%2Fnitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li>
<li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury%2C+Functional+Recovery%2C+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia%2FReperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+%26+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li>
<li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156(2018).</li>
<li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li>
<li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemia+differentially+regulates+GABA%28B%29+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li>
<li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li>
<li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li>
<li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen%2FGlucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A%283%29+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li>
<li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li>
<li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li>
<li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li>
<li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedical+Engineering+OnLine%22%5BJournal%5D)">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74(2019).</li>
<li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li>
<li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain%3A+An+evolving+field+for+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li>
<li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+in+embryonic+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li>
<li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li>
<li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li>
<li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPER%3A+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).</li>
<li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li>
<li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li>
<li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro%3A+Status+Quo+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li>
<li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan yöntem sıçan embriyonik kortikal doku dan astrosit ve nöron izolasyon oluşur, nöron kurulması sağlayan- veya astrosit zenginleştirilmiş kültürler veya nöron-glia kültürleri. Bu bizim grup 5 bir önceki çalışmadan uyarlanmıştır5, kortikal nöron-glia ve nöron zenginleştirilmiş embriyonik kültürlerizolasyon tarif edildi ve iki kültür karakterize. Bu kültürleri kullanarak, Roque ve ark astrositbir iskemik hasara yanıt önemli bir rol oynadığını bulundu ve astrositler ve nöronlar arasınd...

Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre, yaklaşık 5.5 milyon kişi her yıl iskemik inme1ölür. Bu durum belirli bir beyin bölgesine kan akışının kesilmesi ile karakterizedir, doku fonksiyonunu değiştirir ve mitokondriyal disfonksiyon, kalsiyum disregülasyonu, glutamat eksitotoksisite, inflamasyon ve hücre kaybı 2 yol açan doku, oksijen ve besin kaynağı nda geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz kaybı ile sonuçlanan2,3.
Vasküler hücrelerin yanı sıra, nöronal ve glial hücreler iskemik inme patofizyolojisi katılır4. Özellikle, astrositler nöronların bakımı için gerekli olan ve son zamanlarda iskemik lezyon yanıtı kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir5. Glial hücre Bu tür yapısal destek fonksiyonları gerçekleştirir, oksidatif strese karşı savunma, nörotransmitterlerin sentezi, hücre-hücre iletişiminin stabilizasyonu, diğerleri arasında6. Nöronlar ile birlikte, astrositler sinaptik iletim doğrudan bir rol oynamak, adenozin trifosfat, gama-aminobutirik asit ve glutamat gibi moleküllerin salınımını düzenleyen7. Iskemi tarafından indüklenen yaralanma nın bir kısmı glutamat aşırı salınımı ve sinaptik yarık onun birikimi neden olur, N-metil-D-aspartat reseptörlerinin aşırı aktivasyonuyol, aşağı sinyal kaskadlar aktive, sonuçta eksitotoksisite neden8. Astrositler sinaptik yarık glutamat kaldırmak ve glutamin dönüştürmek mümkün olduğundan, onlar eksitotoksisite karşı savunmada çok önemlidir, bu nedenle iskemi üzerinde bir nöroprotektif etki uygulayarak. Bu hücreler aynı zamanda iskemi kaynaklı nöroinflamasyon bir rol oynamaktadır. Iskemik hakaretten sonra aktive astrositler morfolojik değişikliklere (hipertrofi), çoğalır ve glial fibrillary asidik protein (GFAP) ekspresyonunda artış gösterirler. Onlar reaktif olabilir (astrogliosis), tümör nekroz faktör-α, interlökin-1α ve interlökin-1β gibi pro-inflamatuar sitokinler serbest, ve serbest radikaller üreten, nitrik oksit ve süperoksit de dahil olmak üzere, hangi sırayla nöronal ölüm neden olabilir9,10. Buna karşılık, reaktif astrositler de nöroprotektif bir etki oynayabilir, onlar anti-inflamatuar sitokinler serbest beri, büyüme faktörü dönüştürme gibi-β, inme sonra upregulated olduğunu11. Ayrıca, onlar bir glial yara oluşturabilir, hangi aksonal filizlenme inhibe doku rejenerasyonu sınırlayabilir; ancak, Bu glial yara uygun doku yaralanma site izole edebilirsiniz, böylece kontrolsüz doku hasarı basamaklı bir dalga önlenmesi12,13.
Bu nedenle, iskemik yaralanmanın etkilerini sınırlayan veya tersine çeviren tedavi stratejileri bulmak için iskemik yaralanma altında nöron-glia etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanıyan modeller oluşturmak zorunludur. Iskemik yaralanma çalışma için kullanılan diğer modeller ile karşılaştırıldığında, yani in vivo modelleri14,15,16, organotipik kültürler17,18,19 ve akut beyin dilimleri20,21,22, birincil hücre kültürleri daha az karmaşıktır, hangi mümkün iskemik inme patofizyolojisi her hücre tipibireysel katkıları çalışma yapar ve nasıl her hücre tipi olası terapötik hedeflere yanıt verir. Tipik olarak, nöron zenginleştirilmiş kültürler ve astrosit zenginleştirilmiş kültürler arasındaki etkileşimleri incelemek için, nöronlar ve postnatal kökenli glial hücrelerkullanılır 23,24, veya doğum sonrası glial hücreler ve embriyonik nöronlar25,26. Burada nöron kurmak için basit bir yaklaşım önerilmektedir- veya astrosit zenginleştirilmiş kültürler ve nöron-glia kültürleri aynı dokudan. Bu birincil hücreler sıçan embriyonik korteks elde edilir, bir bölge sık inme etkilenen27,28. Ayrıca, doku dissociation sadece mekanik bir prosedür ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu protokol, hücrelerin gelişimin aynı aşamasında, hızlı ve ucuz bir şekilde ve yüksek performans ve tekrarlanabilirlik ile izole sağlar.
Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşma, kapaklarda kültürlenen nöronların çok kuyu plakalı bir astrosit tek tabakası ile temas halinde tutuldukları bir ortak kültür sistemi kullanılarak incelenebilir. Küçük parafin küreler iki hücre kültürleri ayrılmasını sağlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, temas edilmeden önce her hücre türünün bağımsız manipülasyonuna olanak tanır. Örneğin, astrositlerde belirli bir geni susturmak ve iskemik kaynaklı hasara karşı nöronal kırılganlığı veya korumayı nasıl etkileyebileceğini görmek mümkündür. In vitro iskemik benzeri koşulları indüklemek için kurulmuş bir yöntem oksijen ve glikoz yoksunluğu (OGD)3, hangi normal atmosfer yerine oluşur (95% hava ve 5% CO2) bir anoksik atmosfer ile (95% N2 ve% 5 CO2),glikoz ihmali ile ilişkili.
Açıklanan yöntem, iskemik inme bağlamında nöronlar ve astrositler arasındaki etkileşimleri basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde incelemek için uygundur.

<table><tbody><tr><td>24 kuyulu kültür plakaları</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>%95 N2/%5 CO2 gaz tüpü</td><td>ArL &iacute; quido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Alexa Fluor 488 ile konjuge anti-fare</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>1/1000 seyreltme; kuluçka süresi - oda sıcaklığında 1 saat</td></tr>; <tr><td>Alexa Fluor 546 ile konjuge anti-tavşan</td>; <td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1/1000 seyreltme; inkübasyon süresi - oda sıcaklığında 1 saat</td></tr><tr><td>B27 takviyesi (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dako Floresan Montaj Ortamı</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td>3.4 g/L</td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1x</td><td>63x objektif</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Biochrom</td><td>S0615</td><td>%10</td></tr> <tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>120 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8415</td><td>25 & mikro; M</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td>0.5 mM</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>2 ve mikro; M; kuluçka süresi - oda sıcaklığında 10 dakika</td></tr><tr><td>Hipoksi kuluçka odası</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>27310</td> Sığır pankreasından <td>OGD indüksiyonu için kullanılan oda</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>5 mg / L</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K-002</td><td>87.5 mg / Kg</td></tr><tr><td>Minimum Temel Orta Eagle orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0268</td><td>37 ° C'ye kadar ısınma; C kullanmadan önce Mouse</td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-74421</td><td>1/500 seyreltme; gece boyunca 4 ° C'de kuluçka süresi; C</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>37 °C'ye kadar ısınma; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>histoloji için parafin pastilleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.07164</td><td>Katılaşma noktası 56-58&deg; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P6148</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Biochrom</td><td>A 2213</td><td>penisilin (12U / mL) / streptomisin (12 ve mikro; g / mL)</td></tr> <tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Anti-GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td>1/2000 seyreltme; gece boyunca 4 ° C'de kuluçka süresi; C</td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat</td><td>Fisher Scientific S</td><td>/4240/60</td><td>2.2g/L</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1126</td><td>12 mg/Kg</td></tr></tbody></table>

İskemide nöron-glia etkileşimlerinin rolünü nörade İncelemek İçin hücre kültürü modeli

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

İskemik inme beyin dokusunun hipoperfüzyon uğrama ile karakterize klinik bir durumdur, oksijen ve glikoz yoksunluğu yol, ve sonuç nöronal kaybı. Çok sayıda kanıt glial ve nöronal hücreler arasındaki etkileşim bir iskemik olaydan sonra yararlı etkileri uygulamak düşündürmektedir. Bu nedenle, potansiyel koruyucu mekanizmaları keşfetmek için, bir iskemik ortamda nöron-glia etkileşimleri incelenmesine olanak sağlayan modeller geliştirmek önemlidir. Burada, astrositleri ve nöronları sıçan embriyonik korteksinden izole etmek için basit bir yaklaşım saklıyız ve özel kültür ortamını kullanarak, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile nöron veya astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya nöron-glia kültürlerinin kurulmasına olanak sağlıyor.
Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için, kapaklarda kültürlenen nöronların çok kuyu plakalı bir monokat astrositle temas halinde tutuldukları ortak kültür sistemine dayalı bir yaklaşım öneriyoruz. İki kültür küçük parafin küreleri tarafından ayrı tutulur. Bu yaklaşım bağımsız manipülasyon ve birçok çalışmada bir avantaj temsil eden her hücre tipi, özel tedavilerin uygulanması sağlar.
Iskemik inme sırasında meydana gelen leri simüle etmek için, kültürler oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolüne tabi tutulur. Bu protokol iskemik inme nöron-glia etkileşimlerinin rolünü incelemek için yararlı bir araç temsil eder.

Kültürleri karakterize etmek için, immünositokimya GFAP veya MAP2 ifade hücrelerinin sayısını değerlendirmek için, astrosit ve nöronların yaygın olarak kullanılan belirteçleri(Şekil 2),<img alt="As...

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

İskemik inme beyin dokusunun hipoperfüzyonu ile karakterize klinik bir durumdur ve nöronal kayıp ile sonuçlanır. Çok sayıda kanıt glia ve pisuar hücreleri arasındaki etkileşim bir iskemik olaydan sonra basınç etkileri uygulamak öneririz. Potansiyel koruyucu mekanizmaları araştırmak için, iskemik bir ortamda nöron-glia etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlayan modeller geliştirmek önemlidir.Burada rat embriyonik korteksten astrositleri ve nöronları izole etmek için basit bir yaklaşım saklıyız ve özel kültürel ortam kullanarak nöron veya astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile neo-glia kültürlerin kurulmasına olanak sağlar. Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için, kapak fişleri içinde kültürlenen nöronların çok kuyulu plakalarla kaplanmış bir monokat astrositle temas halinde tutuldukları ortak kültür sistemine dayalı bir yaklaşım öneriyoruz. İki kültür küçük parafin küreler tarafından bir parçası korunur.Bu yaklaşım bağımsız manipülasyon ve birçok çalışmada bir avantaj temsil eden her hücre tipi, özel tedavi uygulanması sağlar. Iskemik inme sırasında meydana gelen leri simüle etmek için, kültürler oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolüne tabi tutulur. Bu protokol iskemik inme nöron-glia etkileşimlerinin rolünü incelemek için yararlı bir araç temsil eder.Fare embriyonik korteks yalıtımı ile başlayın. Embriyolar 15 günlük gebelikte fare ailesinden elde edildi ve PBS içeren steril bir Falcon tüpüne yerleştirildi. Hala sarısı poşet embriyolar soğuk PBS içeren bir petri kabıiçine yerleştirilir.Makas ve cımbız yardımıyla, sarısı kese kırık ve embriyo kaldırılır ve bir buz paketi üzerinde soğuk PBS içeren başka bir petri kabına yerleştirilir. Embriyoya zarar vermemek için yumurta kesesini kırarken çok dikkatli olmak gerekir. Embriyoyu bir kesişme mikroskobu altında yerleştirin, bir twizzer kullanarak embriyoyu nazikçe düzeltin.İlk kesi kortekse paralel olmalı. Hayvanın kafasını kesmemeye dikkat et. Kafa derisi ve dikkatle kortikal beyin dokusuzarar değil kaldırılır.Sıradaki kesik korteksi ayırıyor. Dokuda bulunan kan damarlarını çıkarın. Son olarak, bir pipet kullanarak, PBS ile bir Falcon tüp kortikal doku aktarın.Tek hücreli süspansiyon azalan çapı ile ipuçları kullanılarak kortikal beyin dokusunun mekanik sindirim yoluyla elde edilir. Doku iyi homojenize olduğundan emin olun sindirim sonra, üç dakika boyunca 400 Gs malzeme santrifüj. Supernatant atın ve kültür orta tortu askıya, daha önce 37 dereceye ısıtılır.Neubauer haznesini kullanarak süspansiyonda bulunan toplam hücre sayısını hesaplayın ve yeterli hücre yoğunluğu için seyreltme yi önceden hesaplayın. Son olarak, 37 derece de çok kuyuve kuluçka hücreleri tohum. Malzemeyi ortak kültür sistemine hazırlamak için parafini sıvı hale gelene kadar ısıtma bloğunda ısıtın.Daha sonra, bir stereo cam Pasteur pipet yardımıyla daha önce çok kuyuya yerleştirilen ve Poly-D-Lysine ile kaplanmış kapak fişleri üzerinde küçük küreler hazırlayın. 24 saat önce iki kültür temas getirilir, nöronların kültür ortamı değiştirmek ve ısı inaktive FBS olmadan NBM tamamlamak için. İki kültür kullanıma hazır olduğunda, parafin küreleri ile kapak fişleri oturan nöron transferi daha önce% 70 etanol batırılmış bir cımbız kullanarak astrosit içeren kuyulara.Her iki hücre türünü de temas halinde yerleştirdikten sonra, sekiz ila 12 saat bekleyin ve sonra farklı uyaranları ve yordamları başlatın. Oksijen ve glikoz yoksunluğu büyüme yedi gün ile bir kültürde gerçekleştirilir. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri glikoz takviyesi olmadan HBSS ortamı ile iki kez yıkayın.Glikoz içeren tüm ortamın yıkandığından emin olun. Hipoksi Odası'nı kapatın ve odanın içindeki oksijeni değiştirmek için 20 litrelik bir akışla dört dakika boyunca %95 azot ve %5 karbondioksit içeren gaz karışımını ekleyin. Sonra, akışı durdurun ve Hipoksi Odası'nı 37 derecede bir kuvöze yerleştirin.Oksijen ve glikoz yoksunluğu döneminden sonra, kalan işlemler için uygun kültür ortamı ile glikoz takviyesi olmadan orta, HBSS değiştirin ve 37 derece hücreleri kuluçka. Kortikal kültürün türünü karakterize etmek için, sırasıyla astrositik ve nöronal hücreler için yaygın olarak kullanılan belirteçler olan GFPA veya MAP2'yi ifade eden hücre sayısını değerlendirmek için kortikal kültürlerin üç türünde immünohistokimya uyguladık. Bu analizler, bu protokol de, gfap ifade hücrelerinin yaklaşık% 97 ile astrositsaf zenginleştirilmiş bir kültür elde başardık ortaya koymuştur.Nöron la zenginleştirilmiş kültür ile ilgili olarak, MAP2 ifade hücrelerinin yaklaşık% 78 doğruladı. Ancak GFAP ve MAP2 negatif hücrelerinin yaklaşık %18'ini tanımlarız. Nöron-glia kortikal kültür için, Bu hücrelerin yaklaşık% 49 MAP2 pozitif olduğu gözlenmiştir.%31'i GFAP pozitiftir. Ve %20'si GFAP'den ya da MAP2'den sorumlu değiller. Kortikal kültür kuruluşundan yedi gün sonra, nöron-glia kültürü ve nöron la zenginleştirilmiş kültür 4 ve 6 saat boyunca OGD prosedürüne tabi tutuldu.Bu işlemden sonra hücreler MAP2 ile etiketlendi ve daha sonra MAP2 pozitif hücrelerin sayısı floresan mikroskopi kullanılarak ölçüldü. Nöron-glia kültüründe, kültürün 4 saatlik bir OGD dönemine sunulduğunda nöronların sayısında yaklaşık %30'luk bir azalma gözlendi. 6 saatlik bir OGD döneminden sonra lezyonun uzaması artar ve nöronal kaybın yaklaşık %60'ına ulaşır.OGD'ye maruz kalan nöronların zenginleştirilmiş kültürü ile ilgili olarak MAP2 hücrelerinin sayısında yaklaşık %41 ve %64 azalma gözlendi. Ayrıca, nöron zenginleştirilmiş kültürde, 4 saat boyunca OGD'ye maruz kalan nöron-glia kültürüne kıyasla yaralanma uzantısında hafif bir artış olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak, burada basit, hızlı ve pahalı ve tekrarlanabilir bir şekilde kurulan iskemik inme çalışması için bir in vitro modeli temsil etmektedir.Ayrıca, açıklanan yöntem aynı zamanda nöronlar ve astrosit zenginleştirilmiş birincil kültürlerin uygulanmasına olanak sağlar, aynı zamanda bir nöron-glia kültürü. Böylece, karmaşıklık daha yüksek bir düzeyde çeşitli beyin hastalıkları modelleme için büyük bir in-vitro model sağlayan, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve saf nöronal veya glial kültürlerdaha.

a-cell-culture-model-for-studying-role-neuron-glia-interactions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Burada, biz fare 3D kültür için bir protokol beyin kaynaklı glia hücreleri, astrocytes, microglia ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere mevcut. Biz birincil hücre kültürü, methacrylated hyaluronik asit (HAMA) hidrojel sentezi, HAMAphoto polimerizasyon ve hücre saklamasını ve confocal ve tarama elektron mikroskobik görüntüleme için işleme örnek göstermektedir.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Keşfedin iskemik inme koşullarında nöron-glia etkileşimlerini incelemek için sıçan embriyonik korteksinden astrosit ve nöron izolasyonu yöntemini. Bu hücre kültürü modeli, oksijen ve glukoz yoksunluğu protokolü kullanarak nöroprotektif mekanizmaları araştırmaya olanak tanır.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Daha fazla video keşfet